Name: a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae
Uploaded: 2018-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae at JoVE.com

Karen M. Qiang è stato il destinatario di 2016 di George J. Schroepfer Research Award alla Rice University. Fanli Zhou è il destinatario di una borsa di studio di insegnamento presso la Rice University. I servizi del centro Stock Drosophila Bloomington, l'impianto di Harvard TRiP, il centro di risorse di Drosophila Vienna sono ringraziano.

1. preparazione delle larve
<ol><li>Due o più giorni prima di iniziare il dosaggio, impostare croci del desiderato sperimentale e controllare combinazioni (minime 20 femmine e 10 maschi ogni) in piatti di uovo-pone come descritto da Wieschaus e Nüsslein-Volhard 13 ma utilizzando il polipropilene 50 mL bicchieri e 6,0 cm di Petri monouso contenenti uva agar e spalmato con pasta di lievito appena prima dell'uso. Tenere le mosche nel Deposita uovo piatti al buio a temperatura ambiente fino a quando necessario.</li>
	<li>Ricetta agar uva – combinare 100ml congelato 100% uva succo concentrato, 350 mL di acqua di deioinized, 5ml glaciale acido acetico e 13 g d. melanogaster agar in un becher di vetro 1L. Forno a microonde a raffica di 1-2 min, mescolando tra burst, fino a quando agar è tutto sciolto. Raffreddare la soluzione per qualche minuto poi aggiungere 10 mL di 10% (p/v) di Nipagen (metil-p-idrossibenzoato) in etanolo al 95%. Mix, quindi pipetta 7 mL per piastra in capsule di Petri monouso 6,0 cm, permetterà di gel e asciugare a temperatura ambiente per 3-4 h. Store a 4 0C in sacchetti di plastica.</li>
	<li>Lievito pasta ricetta – 7 g secchi lievito, 10 mL di acqua deionizzata, mescolare con una spatola fino a consistenza uniforme.</li>
	<li>Collezioni di uovo temporizzato per generare sperimentale e controllare le larve. Usando le nuove, piastre imbrattato di lievito, uva, raccogliere le uova a temperatura ambiente per 4 ore nel buio durante le ore del mattino. Queste piastre di raccolta di 4 h di rimuovere e sostituire con piatti freschi. Incubare le piastre di raccolta di 4 h pernottamento presso 25 0C fino al pomeriggio del giorno successivo, quando la maggior parte delle larve si sono schiuse. Raccogliere queste prime larve instar e li usa per impostare l'esperimento.</li>
</ol>2. creazione di piastre di dosaggio
<ol><li>Preparazione delle piastre di dosaggio. Per un singolo ciclo del dosaggio, preparare cinque piastre dosaggio di 10 larve sperimentali e cinque piastre delle larve di controllo 10. Utilizzare un trivellatore di sughero di 1,5 cm per rimuovere un nucleo centrale di agar da ogni piatto creando un buco per il cibo. Porre della pasta di lievito (0,8 - 0,9 g) nel foro e picchiettare delicatamente con una spatola per rendere un tumulo il foro di riempimento.</li>
	<li>Preparazione di piastra di agar – combinare 700 mL di acqua deionizzata con 16 g di d. melanogaster agar in un becher di vetro 2L e forno a microonde per 5 min, togliere dal microonde e mescolare con una bacchetta di vetro per portare agar non disciolto nella soluzione. Aggiungere 17,5 mL di 10% (p/v) Nipagen in etanolo al 95%, mix, quindi continuare il riscaldamento per microonde in 30 s burst seguita da mescolando, fino a quando tutti i agar è dissolto completamente. Raffreddare per un minuto o due, quindi dispensare aliquote da 15 mL in plastica cm 10 capsule di Petri. Consentire l'agar gel, coprire le piastre con coperchi e lasciarli asciugare a temperatura ambiente per alcune ore o durante la notte. Conservare le piastre in sacchetti di plastica sigillati a 18 ° C. Nota 1: Per evitare la formazione di cristalli di Nipagen sulla superficie delle piastre a causa di dessiccation in eccesso, è possibile utilizzare piastre entro pochi giorni dalla preparazione. Se necessario, cristalli possono essere ri-sciolto facendo cadere pochi microlitri di alcol al 95% su di loro. Nota 2: lotti di agar possono avere diverse proprietà gelificanti. Le piastre di gel secco dovrebbero essere sodo al tatto e sufficientemente resiliente che un cerchio pulito, intatto dell'agar può essere rimosso quando si utilizza il dispositivo di prelievo del sughero per creare il foro di cibo (Vedi sopra).</li>
	<li>Configurazione di larve nelle piastre di analisi. Utilizzare pressione meccanica per curva la punta di un microspatula di plastica e immergere la punta in pasta di lievito per fornire "adesivo" per raccogliere le larve. Pick up primo instar larve individualmente e metterli sulla piastra di agar vicino il tumulo di cibo. Preparare almeno cinque piastre replicare dei genotipi di controllo e 10 larve per entrambi sperimentali. Una volta completato, tappo ed etichettare ogni piatto e impostare le piastre (lato coperchio alto) in uno spazio buio a temperatura ambiente (nel nostro laboratorio questo è 22 ° C).</li>
</ol>3. monitoraggio analisi piastre
<ol><li>Esaminare le piastre al giorno sotto un microscopio per dissezione e registrare il numero di larve sulla sommità del cibo o sulla superficie dell'agar. Nota qualsiasi visibile delle larve morte o morenti. Nota Quando e se, tunneling in substrato agar è visto come larve spostare nel terzo instar. Nota le date su cui pupe cominciano a formare e notare eventuali anomalie pupale. Continuare osservazioni quotidiane fino a quando tutte le larve sono morti o popolate.</li>
	<li>Rimuovere attentamente pupe dalla piastra con un piegato in giro ago e un piatto di uva. Se si desidera continuare il monitoraggio pupe per determinare quanti eclose come adulti.</li>
</ol>4. preparazione saggio piastre per l'imaging
<ol><li>Rimuovere con cautela e scartare tutto il cibo lievito dal pozzo centrale di ogni piatto.</li>
	<li>Delicatamente alluvione ogni piatto con l'acqua del rubinetto e utilizzare il pennello di un artista morbido per strofinare accuratamente detriti che ha stati tracciati sulla superficie dell'agar. Sostituire l'acqua più volte e continuare una spazzolatura delicata fino a che ogni piatto è completamente pulito. Dare i piatti un risciacquo finale con acqua deionizzata, cap loro e lasciare a temperatura ambiente durante la notte a secco. Nota: Tunneling dentro l'agar è più intenso intorno il tumulo di cibo (Vedi figura 2). Di conseguenza, il bordo del foro cibo solitamente è esteso di là del diametro iniziale di 1,5 cm. Inoltre, la fragilità dell'agar ha lavorato in questa regione può causare piccoli pezzi di agar con tunnel andranno persi dalla circonferenza del foro durante la pulizia. L'aumento della concentrazione di agar gel potrebbe aiutare con questi problemi, ma le correzioni sono possibili durante i passaggi di quantificazione di immagine J (Vedi sotto).</li>
</ol>5. quantificazione del tunneling
<ol><li>Le piastre di immagine. Preparare un'immagine di ogni piatto preso su uno sfondo nero in modo da mostrare i tunnel nell'agar come linee bianche luminose. Nota: Usiamo un sistema comunemente utilizzato per DNA gel per questo passaggio di immagine (Vedi tabella materiali e reagenti). Alternativa in grado di generare file tiff, come fotocamere digitali o telecamere telefono cellulare sistemi di imaging potrebbe essere adattato per produrre immagini adatte.</li>
	<li>Utilizzare il programma di pubblico dominio NIH Image J per quantificare larvale di tunneling. Scarica il programma da http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Per ulteriori informazioni sul programma di andare a http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html. Nota: Altri sistemi di imaging possono essere utilizzati per quantificare il tunneling. Le seguenti istruzioni si applicano a NIH Image J.</li>
	<li>Dopo l'apertura di un'immagine di file tiff di una piastra di tunneling, utilizzare lo strumento ovale per definire un'area per quantificazione che rappresenta la superficie dell'agar intero ma Ritaglia il bordo in plastica della piastra.</li>
	<li>Applicare la soglia automatica per produrre un'immagine invertita del piatto, con le gallerie mostrando come linee nere. Utilizzare il selettore colore e pennello strumenti al bianco fuori qualsiasi aree nere che rappresentano danni l'agar anziché il tunnel.</li>
	<li>In menu pull-down Analyze , selezionare Scala Set | Fare clic per rimuovere il calcare e quindi sulla finestra impostare misure (anche sotto Analyze), controllare la zona e limite di soglia.</li>
	<li>Premere il tasto CTRL + tasto M per richiamare l'area nera (tunnel) in pixel.</li>
	<li>Copia e incolla il valore in pixel per ogni piastra è in un programma di foglio di calcolo (come Excel) che permetterà l'analisi quantitativa.</li>
	<li>Il foro centrale è solitamente espanso a causa di intenso tunneling in questa regione. Per quantificare il tunneling mancante, deseleziona "Limitare a soglia" e utilizzare la bacchetta per definire il foro centrale. Premere il tasto CTRL + tasto M per ottenere il valore in pixel di questa zona. Sottrarre da questo valore il valore in pixel di un buco di 1,5 cm e aggiungere la differenza per il tunneling valore ottenuto al punto 5.6.</li>
	<li>Per alcuni piatti, il foro centrale potrebbe mancare un pezzo di agar con tunnel che include un'area di untunneled agar adiacente al foro. Quando il foro centrale per questi uso di piastre di quantificazione il selettore colore e pennello strumenti per aggiungere una barra nera in tutta la regione manca per definire la regione con tunnel ed escludere l'area con tunnel non da quantificazione. Nota 1: Se le larve sperimentale il tunneling di qualsiasi, questa quantificazione permette il calcolo della media di tunneling valori per i set di piastre e comparazione statistica di controllo e i valori sperimentali.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+responses+to+oxygen+deprivation.">Conserved responses to oxygen deprivation.</a> J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).</li><li>Lavista-Llanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+hypoxic+response+in+D.+melanogaster+by+the+basic+helix-loop-helix+pas+protein+Similar.">Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar.</a> Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).</li><li>Reiling, J. H., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxia-induced+paralogs+Scylla+and+Charybdis+inhibit+growth+by+down-regulating+S6K+activity+upstream+of+Tsc+in+D.+melanogaster.">The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster.</a> Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).</li><li>Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+and+responding+to+hypoxia+via+Hif+in+model+invertebrates.">Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates.</a> J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).</li><li>Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+developmental+adaptations+to+hypoxia:+A+D.+melanogaster+perspective.">Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective.</a> Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).</li><li>Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+hypoxia-induced,+nitric+oxide-mediated+signaling+cascade.">Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade.</a> Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).</li><li>Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+to+burrow+and+tunnel+reveals+roles+for+jim+lovell+in+the+growth+and+endoreplication+of+the+D.+melanogaster+larval+tracheae.">Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae.</a> PLOS ONE. 11, e0160233 (2016).</li><li>Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+contributes+to+behavioral,+cellular,+and+developmental+responses+to+low+oxygen+in+D.+melanogaster.">Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster.</a> Cell. 98 (1), 105-114 (1999).</li><li>Zhang, L., Ward, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uninflatable+encodes+a+novel+ectodermal+apical+surface+protein+required+for+tracheal+inflation+in+D.+melanogaster.">Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster.</a> Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).</li><li>Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+characterization+of+two+atypical+soluble+guanylyl+cyclases+in+the+central+and+peripheral+nervous+system+of+D.+melanogaster+melanogaster.">Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).</li><li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+responses+to+hypoxia+and+hyperoxia+in+D.+melanogaster+larvae.">Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae.</a> Fly. 5 (2), 119-125 (2011).</li><li>Brand, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: a practical approach. , 199-227 (1986).</li><li>Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+reduced+oxygen+in+the+developmental+physiology+of+growth+and+metamorphosis+initiation+in+D.+melanogaster.">The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hif-+and+non-Hif-regulated+hypoxic+responses+require+the+estrogen-related+receptor+in+D.+melanogaster.">Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster.</a> PLoS genetics. 9 (1), e1003230 (2013).</li><li>Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+oxygen+supply+in+Drosophila+malignancies+identify+tracheogenesis+as+a+novel+cancer+hallmark.">Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark.</a> Scient. Rep. 5 (9061), (2015).</li></ol>

Gli autori dichiarano che non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.

Qui abbiamo presentato un'analisi semplice, progettata per rilevare l'ipossia tissutale nelle larve di d. melanogaster . La diagnosi si basa sulla diminuzione scavando cunicoli tumuli di cibo nei primi anni di vita larvale e l'assenza di substrato tunneling tardi nella vita larvale. Affollamento larvale può causare precoce migrazione lontano da una fonte di cibo e quindi un aspetto critico del test è che un piccolo numero di larve è dosato in presenza di un grande eccesso di cibo. L'inclusione del benzoato di idrossile di fungicida metil-p (Nipagen) nelle piastre agar è anche essenziale per impedire la crescita di muffe durante il dosaggio.
Troviamo che le piastre di agar possono essere una fonte di variabilità nell'analisi. In genere, le larve dello stesso genotipo, da differenti gruppi di genitori, o da diverse collezioni di larve, mostrano variazioni relativamente limitato nel loro comportamento nell'analisi. Al contrario, piastre di agar fatto in giorni diversi o con diversi lotti di agar possono produrre differenze di tunneling. Una condizione è pertanto tale controllo e larve sperimentali devono tutti essere verificate utilizzando piastre di agar dalla stessa preparazione batch. Agar di produttori diversi o anche le spedizioni dalla stessa fabbricazione possono variare nel loro potere gelatinizzante, e quindi può essere necessario regolare la concentrazione di agar verso l'alto dal 2,2% usato qui per ottenere un gel ottimo. Abbiamo trovato che le larve di tipo selvaggio possono prontamente tana attraverso gel 3% agar.
Al fine di dimostrare il valore di questo test, abbiamo utilizzato per indagare la potenziale ipossia tissutale nelle larve con soppressa funzione di uninflatable in trachee. I nostri risultati forniscono l'appoggio importante per l'ipotesi che la perdita di tracheale espressione di questo gene può produrre ipossia: btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larve ha mostrato il guasto alla tana in cibo e completa assenza di substrato tunneling durante il terzo instar. Nei nostri studi precedenti di altri genotipi, abbiamo osservato che la perdita indotta da ipossia di cibo scavando non è completo come perdita di substrato tunneling e btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larve studiato qui si sono comportati allo stesso modo. Il componente di tunneling non riuscito di questo test fornisce pertanto l'indicazione più forte di ipossia.
Anche se il btl-Gal4 > uif RNAi larve ha mostrato tratti comportamentali diagnostica di ipossia, il taglio(ue)-Gal4 > UAS -uif RNAi non ha esibito queste anomalie. Il btl e tagliare(ue), Gal4 driver sono espressi in diverse fasi e in diversi modelli, all'interno le trachee larvale. Il btl-Gal4 driver è espresso in tutto il sistema trachea a partire dal suo sviluppo nell'embriogenesi e continuando attraverso la vita larvale. Al contrario, espressione Gal4 dal taglio(ue)-Gal4 driver solo inizia alla fine della vita embrionale, dopo morfogenesi delle trachee ed è limitato alle sezioni posteriore estreme dei tronchi dorsale, i principali vasi longitudinali di il sistema trachea. atterramento di UIF con questa linea di Gal4 non può pertanto ridurre la uif espressione abbastanza presto o largamente sufficiente a produrre qualche livello di soglia di ipossia da innescare i comportamenti misurato in questo test.
Uno studio precedente trovato che terza larve instar esposte a bassi livelli di ossigeno (10%) mostrano crescita è diminuito e ha ritardato l'inizio di pupariation 14. Il btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larve studiate qui ha diventato il terzo instar, ma gli effetti sui loro tassi di crescita e impupamento erano più pronunciati: erano considerevolmente più piccoli rispetto ai controlli con molto poco tessuto adiposo sotto la epidermide (Figura 3) e solo una piccola frazione (~ 10%) ha tentato di pupariation. Queste differenze suggeriscono il btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larve ha avvertito un maggior grado di ipossia, uif atterramento nelle trachee era presente durante tutta la loro vita larvale, o perché ha prodotto un più privazione dell'ossigeno severa nel terzo instar. A questo punto è chiaro come perdita di funzione di uif nelle trachee potrebbe impedire il trasporto dell'ossigeno. Le trachee di btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larve sono state prontamente visibile attraverso la cuticola (Figura 3), un'indicazione che conteneva aria e non sono stati danneggiati al punto che fluido voce funzione compromessa. È formalmente possibile quindi che il danno trachea creato da perdita di funzione di uif non suscitare ipossia ma piuttosto qualche altro difetto che inibisce il tunneling. Per i genotipi studiati in precedenza, abbiamo determinato che il mancato traforo è associato con i livelli elevati di LDH mRNA7, l'indicatore canonico di glicolisi e di ipossia in ritardo terzo instar larve 15. Così, la conferma definitiva di ipossia per il btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larve (e nelle larve esaminate in futuro utilizzo di questo test) comporterebbe RT-PCR per valutare i livelli di mRNA LDH o l'uso di un indicatore disponibile in commercio per misurare livelli di ossigeno intracellulare (ad esempio vedere 16).

La sofisticata gamma di strumenti genetici molecolari disponibili in d. melanogaster ne fanno un organismo prezioso per lo studio dei processi biologici evolutivamente conservati. Chiave risposte molecolari alla disponibilità di ossigeno hanno dimostrato di essere conservati attraverso l'evoluzione e studi precedenti in d. melanogaster hanno generato intuizioni i componenti universali di queste vie 1,2, di segnalazione 3,4,5,6.
Nell'ambito di uno studio volto a dissezione funzione del neurone sensoriale nelle larve di d. melanogaster , abbiamo identificato due risposte comportamentali che ha dimostrato di essere attivato da ipossia del tessuto normale dell'ossigeno livelli 7. Uno di questi, il mancato scavano nel cibo, è altamente relativo alla risposta a bassi livelli di ossigeno segnalato da Wingrove e o ' Farrell 8. Il secondo comportamento, guasto al tunnel in un substrato morbido durante il tardo terzo instar vagando fase, non era stati precedentemente identificato come relazione con l'ipossia. Abbiamo determinato che esponendo larve errante di tipo selvaggio a bassi livelli di ossigeno inoltre inibisce il substrato tunneling 7, stabilendo così che entrambi questi comportamenti hanno origine da ipossia - sia indotta da danno di tessuto o di livelli di assunzione di ossigeno basso. Qui descriviamo un'analisi che abbiamo sviluppato per quantificare questi due comportamenti indotti da ipossia, che inizia con osservazioni immediatamente dopo la schiusa larvale.
Risposte ipossiche nelle prime fasi larvali non sono state esaminate in precedenza e quindi eseguire un'analisi per tutta la vita larvale è una componente importante della nostra analisi. La maggior parte delle manifestazioni evidenti di ipossia – lento sviluppo, scarsa crescita e lentezza dell'apparato locomotore – si sovrappongono con i fenotipi larvali prodotti da molte mutazioni. Ma abbiamo trovato che solo terzo instar larve con ipossia mostrano un completo fallimento per 7un tunnel. Così, abbiamo determinato che larve anche più compromessi in termini di crescita e locomozione rispetto nostro larve hypoxic, ancora effettuato alcuni tunneling, considerando che larve ipossiche con tunnel mai 7. Un altro prezioso elemento di questo test è così che fornisce un modo per stabilire quando l'ipossia è la fonte di un particolare insieme di fenotipi pleiotropici, al contrario di alcuni altri stress o disfunzione metabolica. Come una dimostrazione del dosaggio, qui descriviamo il suo uso nel caratterizzare le risposte delle larve con ridotta espressione tracheale di uninflatable, un gene che funziona nel larvale airways 9.
Prevediamo che questo test sarà di valore per i ricercatori impegnati nella caratterizzazione dei fenotipi larvali che includono scarsa crescita e comportamento pigro. Di conseguenza, nuovi geni che influenzano la distribuzione, l'utilizzo o risposte, potrebbe essere identificato ossigeno in tutto il corpo. Inoltre, incorporare questo test un mutante protocollo di screening fornirebbe un percorso diretto ad identificare le mutazioni che producono ipossia. Questo test sarà anche prezioso nell'analizzare i circuiti che suscita i comportamenti innati indotta da ipossia descritti qui. Analisi di rete neurale di questo tipo sono un fuoco di molta ricerca corrente e il sistema nervoso semplice della larva d. melanogaster è un sistema prezioso per la dissezione fuori comportamenti automatizzati. Neuroni sensoriali coinvolte nella percezione del larvale ossigeno già individuati, fornendo un primo passo verso la definizione la circuiteria completa per risposte indotta da ipossia 10,11. Usando la nostra analisi in combinazione con atterramento selettiva neurale tramite il sistema GAL4-UAS12 è un percorso chiaro per la delineazione ulteriori componenti della rete neurale.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dehydrated yeast&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frozen grape juice concentrate</td><td>Welch&#039;s</td><td></td><td>&amp;nbsp;Available at most large supermarkets</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila agar</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-para-hydroxybenzoate</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>20-658</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylene beakers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6.0 cm disposable Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>08757100B</td><td></td></tr><tr><td>10 cm disposable plastic Petri dishes</td><td>E+K Scientific</td><td>EK-24104</td><td></td></tr><tr><td>Plastic microspatulas</td><td>Corning Incorporated</td><td>3012</td><td></td></tr><tr><td>Bent teasing needle</td><td>Nasco</td><td>S08848MH</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td></td><td></td><td>Any microscope with 10-30X magnification</td></tr></tbody></table>

a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae

Privazione dell'ossigeno negli animali può derivare dall'esposizione a livelli bassi di ossigeno atmosferico o da danni ai tessuti interni che interferisce con la distribuzione di ossigeno. È anche possibile che il comportamento aberrante dei neuroni di rilevamento dell'ossigeno potrebbe indurre ipossia-come comportamento in presenza di livelli normali di ossigeno. In d. melanogaster, sviluppo a bassi livelli di ossigeno provoca l'inibizione della crescita e pigro comportamento durante le fasi larvali. Tuttavia, queste manifestazioni consolidate del deficit di ossigeno si sovrappongono notevolmente con i fenotipi di molte mutazioni che regolano la crescita, le risposte di sforzo o locomozione. Come risultato, non c'è attualmente nessun test disponibili per identificare i) cellulare ipossia indotta da una mutazione o ii) ipossia-come comportamento quando indotta dal comportamento di un neurone anormale.
Recentemente abbiamo identificato due comportamenti distintivi nelle larve di d. melanogaster che si verificano a livelli di ossigeno normale in risposta alla rilevazione interna di ipossia. In primo luogo, in tutte le fasi, tali larve evitare scavando cunicoli cibo, spesso randagi lontano dalla fonte di cibo. In secondo luogo, tunneling in un substrato morbido, che si verifica normalmente durante la terza tappa di instar errante è completamente abolita se le larve sono ipossiche. Il test qui descritto è stato progettato per rilevare e quantificare questi comportamenti e quindi per fornire un modo per rilevare ipossia indotta da danno interno piuttosto che esterno basso ossigeno. Piastre di dosaggio con un substrato di agar e una spina centrale della pasta di lievito sono utilizzate per sostenere gli animali attraverso la vita larvale. La posizione e lo stato delle larve vengono rilevate ogni giorno appena si procede dalla prima alla terza instar. Nella misura di tunneling in substrato agar durante fase errante è quantificata dopo impupamento usando ImageJ NIH. Il dosaggio sarà di valore per determinare quando l'ipossia è un componente di un fenotipo mutante e così fornire informazioni su possibili siti di azione del gene in questione.

Come una dimostrazione del valore di questo test abbiamo utilizzato per indagare la potenziale ipossia nelle larve con la funzione alterata del gene uninflatable (uif) nelle trachee. UIF codifica per una proteina transmembrana grande che è fortemente espresso sulla superficie apicale delle cellule tracheale larvale. Mutanti di uif sono stati notati in precedenza presentano comportamento aberrante che poteva indicare ipossia tissutale a causa di malfunzionamento tracheale 9. In particolare abbiamo soppresso uif espressione nella trachea larvale utilizzando il sistema Gal4-UAS. Gal4 due linee sono state usate: i) senza fiato (btl)-Gal4, che è fortemente espresso in trachee dall'inizio del loro sviluppo embrionale e ii) tagliato(ue)-Gal4, che inizia l'espressione in una piccola regione posteriore del le trachee tronco dorsale principale all'estremità dell'embriogenesi e continua forte espressione in questa regione in tutto vita larvale 7. UAS -uif linea RNAi è stata ottenuta dal centro di ricerca della drosofila Vienna (VDRC ID n. 1050).
Come descritto nel protocollo di cui sopra, cinque replicare piastre di appena schiusi primo instar larve sono stata istituite per ciascuno dei quattro croci come segue.
Esperimento 1 1) controllo 1 - tagliare(ue)-Gal4 x Cantone-S (+) 2) sperimentale 1 - tagliare(ue)-Gal4 x UAS-uif RNAi
Esperimento 2 3) controllo 2 - btl-Gal4 x Cantone-S (+) 4) sperimentale 2 - btl-Gal4 x UAS-uif RNAi
Il comportamento del taglio(ue)-Gal4 > UAS -uif RNAi larve di esperimento 1 era paragonabile a quello del controllo taglio(ue)-Gal4 > + animali in termini di scavatori, tunneling e sopravvivenza all'impupamento, (Figura 1 e Figura 2). Al contrario, giù-regolando uif espressione attraverso l'intero sistema trachea da presto nello sviluppo (esperimento 2) prodotto marcatamente diverse risposte. Il btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larve visualizzate entrambe le manifestazioni comportamentali di ipossia del tessuto – ridotto cibo scavando e una totale assenza di substrato tunneling più tardi nella vita larvale (Figura 1 e figura 2 ). Le larve sperimentali erano anche notevolmente più piccola, più sottile e più lento rispetto ai controlli (Figura 3) e ha mostrato un alto tasso di mortalità nel corso del test. Come discusso sopra, crescita ridotta, la lentezza e la morte organismal sono noti sintomi di ipossia larvale. Inoltre, la maggior parte delle larve sperimentale non è riuscito a tentare impupamento e rimase come terza instar larve lunghe dopo controllo larve erano popolate. Alcune larve è sopravvissuto più di 15 giorni prima di morire alla fine senza pupating (Figura 1A). Alcuni delle larve sperimentale provato a pupate ma in tutti i casi anormali pupe sono stati formati che non hanno generato gli adulti praticabili.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig1.jpg"> Figura 1. Quantificazione di sviluppo larvale e scavatori di cibo. (A) percentuale di larve vive fuori i tumuli di cibo per i quattro genotipi studiati qui. Medie per le piastre di cinque test utilizzate per ciascun genotipo sono mostrate. Dal giorno 3 dopo la schiusa, circa il 70% di btl-Gal4 > UAS uif RNAi larve erano fuori il cibo, mentre nessun larve sono state rilevate all'esterno il cibo o sulla superficie dell'agar per altri tre genotipi. Il btl-Gal4 > le larve UAS uif RNAi morire lentamente tra i giorni 4-20, con ~ 15% di loro ancora vivo 15 giorni dopo la schiusa. La freccia nera lungo l'asse x qui e (b) indica il giorno con il quale avevano popolate tutte le larve dei tre altri genotipi. (B) percentuale di morte larve visibile all'esterno il cibo per i quattro genotipi. Medie per le piastre di cinque dosaggio per ciascun genotipo sono mostrate. Morto btl-Gal4 > le larve UAS uif RNAi si accumulano nel tempo con la maggior parte muoiono fuori il cibo. Gli altri genotipi tutti sopravvivono all'impupamento (C) percentuale di sopravvivenza all'impupamento per i quattro genotipi studiati. Medie per le piastre di cinque dosaggio per ciascun genotipo sono mostrate. Nessun normale pupe di btl-Gal4 > genotipo di RNAi uif UAS sono state prodotte. Barre di errore in tutta figura rappresentano SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig2.jpg"> Nella figura 2. Quantificazione di tunneling larvale. (A) esempi delle piastre di dosaggio per tutti i quattro genotipi studiati dopo la preparazione per il tunneling di quantificazione. Si noti la completa assenza di tunneling per il btl-Gal4 > le larve UAS uif RNAi. Piastre di dosaggio sono piastre di Petri di 10 cm. (B) quantificazione di tunneling per i quattro genotipi derivata dall'immagine J. Valori dei pixel medio per le piastre di cinque dosaggio per ciascun genotipo. Nessun tipo di tunneling è stata osservata per il btl-Gal4 > le larve UAS uif RNAi. Barre di errore = SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig3.jpg"> Nella figura 3. Confronto di btl-Gal4 > UAS uif RNAi e btl-Gal4 > + larve Larve di simile età (giorno 6 dopo la schiusa) per il btl-Gal4 > UAS uif RNAi (A) e btl-Gal4 > + (B) genotipi. Frecce rosse scegliere le trachee tronco dorsale. Entrambe le larve imaged allo stesso ingrandimento. Barra della scala = 0,5 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig3large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae at JoVE.com

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Il protocollo descrive un'analisi semplice per identificare le larve di Drosophila melanogaster che stanno vivendo ipossia sotto i livelli normali di ossigeno atmosferico. Questo protocollo permette hypoxic larve deve essere distinto da altri mutanti che mostrano fenotipi sovrapposti ad esempio lentezza o crescita lenta.

Un saggio di Burrowing/Tunneling per rilevazione di ipossia nelle larve di Drosophila melanogaster

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

a-burrowingtunneling-assay-for-detection-hypoxia-drosophila

Research

JoVE Journal

Behavior

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

7.7K Views.  Rice University. Il protocollo descrive un'analisi semplice per identificare le larve di Drosophila melanogaster che stanno vivendo ipossia sotto i livelli normali di ossigeno atmosferico. Questo protocollo permette hypoxic larve deve essere distinto da altri mutanti che mostrano fenotipi sovrapposti ad esempio lentezza o crescita lenta.

Video: A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Metodi per test Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Ricerca

Neuroscienze

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Analisi funzionale del circuito di alimentazione larvale in Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Comportamento

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

Una semplice tecnica per analizzare l'attività locomotoria nella Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Foraggiamento protocollo percorso di lunghezza per<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Le larve

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

Quantificazione dell'assunzione di macronutrienti in uno schermo neuronale termogenetico usando larve di Drosophila

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

Analisi basata su macchie di luce per l'analisi di Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Biologia

Drosophila Burrowing and Tunneling Assay: A Method to Assess Tissue Hypoxia in Fly Larvae

Source: Qiang, K. M., et al. <a href="https://www.jove.com/video/57131/" target="_blank">A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2018).
This video shows a method to test hypoxia in Drosophila larvae by assessing their burrowing and tunneling abilities. Using this technique researchers can distinguish larvae experiencing oxygen deprivation from those with developmental deficits. The example protocol demonstrates the setup for this assay.

drosofila Saggio di scavo e tunneling: un metodo per valutare l'ipossia tissutale nelle larve di mosca

Source: Qiang, K. M., et al. A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae. J. Vis. Exp. (2018).
This video shows ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Drosophila melanogaster (fruit fly)

Larva

Fly Climbing Assay: A Method to Test General Locomotion in Drosophila melanogaster

Source: Gevedon, O., et al. <a href="https://www.jove.com/video/59720/in-vivo-forward-genetic-screen-to-identify-novel-neuroprotective">In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a simple method to quantify fly locomotion and shows the climbing assay performed.&#160; The fly climbing assay is a general test of motor function which relies on a negative geotaxis response.

Saggio di arrampicata volante: un metodo per testare la locomozione generale in Drosophila melanogaster

Source: Gevedon, O., et al. In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).
This ...

Un saggio di Burrowing/Tunneling per rilevazione di ipossia nelle larve di Drosophila melanogaster

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Metodi per test Drosophila Comportamento

Analisi funzionale del circuito di alimentazione larvale in Drosophila

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

Una semplice tecnica per analizzare l'attività locomotoria nella Drosophila

Foraggiamento protocollo percorso di lunghezza per

Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

Quantificazione dell'assunzione di macronutrienti in uno schermo neuronale termogenetico usando larve di Drosophila

Analisi basata su macchie di luce per l'analisi di Drosophila Larval Phototaxis

drosofila Saggio di scavo e tunneling: un metodo per valutare l'ipossia tissutale nelle larve di mosca

Saggio di arrampicata volante: un metodo per testare la locomozione generale in Drosophila melanogaster