F.s. räumt Unterstützung von Rhenac Green Tec AG durch Teile dieser Studie. J.s. und b.b. finanziell unterstützt von der DFG (SFB TR175).

Dieses Protokoll enthält einige Beispiele für Wuchsverhalten von A. Thaliana Pflanzen zu analysieren.
1. Vorbereitung
<ol><li>Machen Sie bevor Sie beginnen einen sorgfältige Plan auf wie viele Pflanzen benötigt werden dafür eine zuverlässige statistische Analyse der Experimente und bereiten dann die entsprechenden Beträge von Töpfen. Hinweis: Lassen Sie die Möglichkeit, die einige Samen nicht keimen können.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Klimakammer mit unterschiedlichen individuell programmierbare LED Pflanzenwachstum unter gleichen ökologischen Rahmenbedingungen (Materialtabelle) zu vergleichen.</li>
</ol>2. Pflanzen Sie Wachstum und Aufbau der LED-Leuchten
<ol><li>Bereiten Sie die entsprechende Anzahl (je nach unterschiedlichen Bedingungen und/oder Mutanten zu analysierenden) 6 x 7 cm Töpfe mit Erde und einen einzigen Samen in jedem von ihnen. Hinweis: In diesem Fall wurden 36 Pflanzen pro Bedingungen ausgesät.</li>
	<li>Vernalize für zwei Tage bei 4 ° C.</li>
	<li>Legen Sie die relative Luftfeuchte auf 65 % und die Temperatur auf 22 ° C/16 ° C für täglich 16 h / 8 h Nacht-Zyklus. Stellen Sie das Licht auf allen Ebenen zu einer Intensität von 200 µM/cm2/s1. Dazu geben die jeweiligen Werte in ein Programm über den Touchscreen auf der Vorderseite der Klimakammer. Um vier unterschiedliche Lichtqualitäten vergleichen stellen die LEDs auf folgende Parameter gemäß Tabelle 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Identifyier</td>
			<td>395 nm [%]</td>
			<td>440 nm [%]</td>
			<td>3 K [%]</td>
			<td>660 nm [%]</td>
			<td>770 nm [%]</td>
		</tr>
<tr>
<td>"Sonnenlicht"</td>
			<td>100</td>
			<td>11</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rot und blau (RB)</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Blau (B)</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>25</td>
			<td>2</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Red (R)</td>
			<td>90</td>
			<td>2</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Zusammensetzung der Lichtintensitäten von LEDs abgestrahlt wird
<ol start="4"><li>Die spektrale Leistung kontinuierlich, z. B. mithilfe einer integrierten kalibrierten Spektrometer zu überwachen.</li>
	<li>Legen Sie die Pflanzen in der Klimakammer auf den verschiedenen Ebenen und halten sie mit einem transparenten Oberteil bedeckt, bis gut entwickelten Keimblätter sichtbar sind. Stellen Sie sicher, dass die Pflanzen ausreichend bewässert werden.</li>
	<li>Überwacht und dokumentiert Pflanzen vom Auge und fotografisch so oft wie erforderlich, je nachdem, wie schnell die Pflanzen unter den gewählten Bedingungen, z.B. alle zwei Tage wachsen. Stellen Sie sicher, verwenden Sie ein Stativ für die Kamera zur Gewährleistung des gleiche Abstand zwischen Kamera und Objekt für alle Bilder und ermöglichen dadurch Vergleiche. Verwenden Sie eine Maßstabsleiste bei Bedarf. Hinweis: Der Begriff DAS (Tage nach der Aussaat) bezieht sich auf die eigentliche Bepflanzung der Vernalisation einschließlich Samen.</li>
</ol>3. Ermittlung der PSII Ertrag
<ol><li>Verwenden Sie eine Puls-modulierten Fluorimeter. Der Kamerakopf in einem angemessenen Abstand von der Pflanze so richten Sie ein, dass die komplette Rosette auf das live-Fenster zu sehen ist.</li>
	<li>Nach dem Start der Software erscheint ein Fenster "ausgewählte Einheit". Kreuzen Sie "MINI" und dann "Ok". Wählen Sie die Farbe "blau" im folgenden Pop-up-Fenster. Klicken Sie auf "Ok." Hinweis: Die Puls-modulierten Fluoreszenz Lichtmessung wird automatisch eingeschaltet. Auf dem Monitor erscheint das Bildfenster zeigt des Fluoreszenz-Parameters Ft. Eine Pflanze unter der Kamera platziert ist als orange Bild jetzt zu sehen.</li>
	<li>Um das Bild zu konzentrieren und/oder wählen bestimmte Regionen der Pflanze, indem Sie das Kästchen "live-video" zu Live Video wechseln Sie und drehen Sie den Einstellring des Objektivs. Beenden Sie das LIVE-Video-Fenster durch Klicken auf die Exit-Box in der rechten oberen Ecke.</li>
	<li>Zur Messung der photosynthetischen Parameter definieren Sie einen Anwendungsbereich (AOI). Verwenden Sie die Standardeinstellung für das, was ein Kreis ist die automatisch in der Mitte des Bildschirms angezeigt wird. Das rote Feld daneben stellt den gemittelten Ft Wert alle Pixel innerhalb der AOI. Definieren Sie die entsprechenden AOI durch Auswahl aus der AOI-Box auf der rechten Seite, wo verschiedene Formen zur Verfügung stehen. Klicken Sie auf "hinzufügen" in der Registerkarte "AOI" und platzieren Sie den Kreis innerhalb der Blattfläche. Wiederholen Sie fünfmal pro Blatt.</li>
	<li>Pflegen Sie die Einstellungen (Registerkarte "auf der rechten Seite) auf die Standardwerte des Herstellers (Tabelle 2).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>MEAs Licht</td>
			<td>Int.</td>
			<td>Frequenz</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Handeln. Licht</td>
			<td>Int.</td>
			<td>Breite</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Bildkorrekturen</td>
			<td>MINI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Bildtransformation</td>
			<td>Akku</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>16.7V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Zu gewinnen</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Dämpfung</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sat-Puls</td>
			<td>Int.</td>
			<td>Nein</td>
			<td>Intervall s</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>Langsame Induktion</td>
			<td>Verzögerung s</td>
			<td>Uhr s</td>
			<td>Dauer-s</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>40</td>
			<td>20</td>
			<td>315</td>
		</tr>
<tr>
<td>Absortivity</td>
			<td>Rot Gain</td>
			<td>Rot-Intensität</td>
			<td>NIR-Intensität</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>340</td>
			<td>25</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anzeige</td>
			<td>Farbe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PS Limit</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Inh. Ref-AOI</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FM-Faktor (ankreuzen)</td>
			<td>1.030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Standardeinstellungen für die PAM-Messungen, wie vom Hersteller vorgesehen.
<ol start="6"><li>Wenden Sie eine Sättigung Lichtblitz um eine Messung der photosynthetischen Parameter durch fluoreszierende abschrecken Analyse (Sättigung Puls) durchzuführen. Davor bestimmen Sie abschrecken Koeffizienten durch Messung den minimalen und maximalen Fluoreszenz-Ertrag einer angepassten Pflanze. Stellen Sie zu diesem Zweck die Pflanze im Dunkeln (z.B. in einer Schublade oder dunklen Kasten) für ein paar Minuten. Dann stellen Sie die Pflanze unter den Kamerakopf, aktivieren Sie die Kontrollkästchen Maßnahme und ML (Lichtmessung), in die Zeile darunter das Bild wählen "Fv/Fm" durch Taktung in den Kreis, und klicken Sie auf Fo, Fm am unteren Rand des Bildschirms. Hinweis: Fo/Fm stellt die PSII Ausbeute einer angepassten Pflanze. So ist es der Wert, zu dem die Messung nach dem Auftragen Licht normalisiert ist. Die Strommessung Fo/Fm bleibt bis zur Aktivierung neuer Rekord. Alle F und Fm "durch Sättigung Impulse ermittelten Werte beziehen sich auf Fo/Fm und abschrecken Parameter werden entsprechend berechnet.</li>
	<li>Finden Sie diese Ergebnisse in der Registerkarte "Bericht" zu und markieren Sie die Kästchen auf der rechten Seite, die relevant für das Experiment (zB. Y(II), qP, qN, etc.).</li>
	<li>Exportieren Sie die Ergebnisse in eine Analyse Software zB. Zeichnen Sie sich durch einen Klick auf die Schaltfläche "exportieren" in der oberen linken Ecke und unter entsprechenden Dateinamen speichern. Mindestens fünf AOIs pro Blatt zu erzeugen und Messen Sie mehrere Blätter der gleichen Pflanze (vergessen Sie nicht zu kurz dunkel Anpassung die Pflanze wieder nach jeder Messung), sowie mehrere Pflanzen aus einer Bedingung, die können dann statistisch ausgewertet werden.</li>
	<li>Für statistische Analysen generieren Mittelwerte und Standardabweichungen von alle AOIs und mindestens drei unabhängige Anlagen für alle Zeit Punkte/Bedingungen und führen ein Student t-Test zu bewerten, ob die Daten erhebliche12sind. Daten werden als signifikant gewertet, wenn die p-Werte unter 0,05.</li>
</ol>4. Bestimmung der Spaltöffnungen Dichte
<ol><li>Sammle drei vollständig erweitert Rosette Blätter aus drei einzelnen Pflanzen pro Zustand zu 70 % Ethanol in einer Petrischale Glas und Chlorophyll zu extrahieren. In diesem Lösungsmittel über Nacht bei Raumtemperatur oder Shop bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Für die volle Abfertigung von Pigmenten, brüten in Chloral Hydrate Lösung (Chloral Hydrate: Wasser: Glycerin = 8: 2: 1 w/V/w) bis Blätter komplett weiß erscheinen.</li>
	<li>Nehmen Sie differential Interferenz Mikroskopie (DIC) Bilder von der abaxial Oberfläche bei 40 X Vergrößerung. Zählen Sie Spaltöffnungen in das Blickfeld und mit Hilfe des Maßstabs zu Spaltöffnungen pro mm ² zu extrapolieren. Wiederholen Sie dieses Verfahren für mindestens 4 pro Bedingungen verlässt. Führen Sie statistische Analyse durch die Berechnung des Mittelwert für alle Blätter eine Bedingung und hieraus berechnet die mittleren Fehler.</li>
</ol>5. Ermittlung der Frischgewicht
<ol><li>Entfernen Sie alle Blätter einschließlich Blattstiele von Rosetten aus sechs Pflanzen pro Zustand mit einer Rasierklinge. Wiegen Sie alle Blätter sofort und unterwerfen Sie die Daten zu statistischen Analysen zu, wie oben beschrieben.</li>
</ol>6. Bestimmung der Rosette Blattfläche
<ol><li>Verwenden Sie Bilder aus acht Pflanzen pro Zustand, um die Blattfläche grafisch analysieren. Kombinieren Sie die Bilder für eine Bedingung in einem einzigen Bild und speichern Sie als *.jpeg oder * .tif.</li>
	<li>Laden Sie die entsprechende Software (Materialtabelle). Hinweis: Es ist natürlich möglich ein anderes Programm in der Lage, diese Aufgabe anwenden.</li>
	<li>Eine Image-Datei zu öffnen. Wählen Sie das Werkzeug "Freihand-Auswahl." Umschließen Sie Blätter einschließlich Blattstiele eine Rosette. Klicken Sie auf "Analyze - Set Messungen" und "Bereich", "Min & Max Grauwert" kontrollieren "Integrierte Dichte" und "Mittlere Grauwert." Wählen Sie geeignete Dezimal Plätze, am besten ist, zwei oder drei und klicken Sie auf "ok".</li>
	<li>Um mm zu erhalten2 anstelle von Pixeln mit dem Befehl "set Maßstab". Wenden Sie das geradlinige Auswahlwerkzeug um eine Zeilenauswahl zu treffen, die einem bekannten Abstand, z.B. Urlaub Durchmesser, der ist einfach entspricht zu berechnen aus der Maßstab der Bilder, dann öffnen Sie das Dialogfeld Maßstab gesetzt und geben diesem definierten Abstand und, an Messung. Dann gehen Sie zurück zu "analysieren" und klicken Sie auf "messen."</li>
	<li>Es erscheint ein neues Fenster berechtigt "Ergebnisse" enthält die relevanten Daten für die aktuelle Rosette. Wiederholen Sie diesen Vorgang bei allen Pflanzen im Bild und initialisieren Sie Flächenmaße für jede neue Anlage mit Strg + M zu. Hinweis: Für kleinere Anlagen mit nicht überlappenden Blätter das Zauberstab-Werkzeug lässt sich das Verfahren einfacher und schneller zu machen. Sobald die Blätter beginnen einander decken, geben dieses Tool nicht zuverlässige Ergebnisse.</li>
	<li>Alternativ alle Blätter geschnitten Sie ab, und positionieren Sie diese in einer Weise, dass ein Übersichtsbild ergriffen werden können und verwenden Sie dann das Zauberstab-Werkzeug. Berücksichtigen Sie, dass bei Verwendung dieser Methode mehr Pflanzen benötigt werden.</li>
	<li>Wählen Sie "Datei"-"Speichern unter" im Ergebnisfenster und eine entsprechende Datei-Namen und einen Speicherort in das Computer-Verzeichnis erzeugen. Die Datei wird automatisch im Excel-Format gespeichert werden.</li>
</ol>7. Vorbereitung der RNA
<ol><li>Drei Proben aus zehn einzelnen Pflanzen für jeden Zustand zu ernten. Gesamt-RNS mit einer Pflanze RNA Extraktion Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren. Bestimmen Sie RNA-Konzentration, Reinheit und Integrität mithilfe einer Bioanalyzer. RNA kann dann für downstream-Anwendungen wie z. B. qRT-PCR oder gen Expressionsanalyse von z.B. RNASeq13verwendet werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>An, G., Watson, B. D., Chiang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Tobacco,+Tomato,+Potato,+and+Arabidopsis+thaliana+Using+a+Binary+Ti+Vector+System.">Transformation of Tobacco, Tomato, Potato, and Arabidopsis thaliana Using a Binary Ti Vector System.</a> Plant Physiology. 81 (1), 301-305 (1986).</li><li>Schiml, S., Fauser, F., Puchta, H., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromosome and Genomic Engineering in Plants: Methods and Protocols. , 111-122 (2016).</li><li>Rivero, L., Sanchez-Serrano, J. J., Salinas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arabidopsis Protocols. , 3-25 (2014).</li><li>Ubbens, J. R., Stavness, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Plant+Phenomics:+A+Deep+Learning+Platform+for+Complex+Plant+Phenotyping+Tasks.">Deep Plant Phenomics: A Deep Learning Platform for Complex Plant Phenotyping Tasks.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1190), (2017).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Suppression+of+Growth+by+Blue+Light:+OCCURRENCE,+TIME+COURSE,+AND+GENERAL+CHARACTERISTICS.">Rapid Suppression of Growth by Blue Light: OCCURRENCE, TIME COURSE, AND GENERAL CHARACTERISTICS.</a> Plant Physiology. 67 (3), 584-590 (1981).</li><li>Seiler, F., Soll, J., B&#246;lter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Phenotypical+and+Molecular+Analyses+of+Arabidopsis+Grown+under+Fluorescent+and+LED+Light.">Comparative Phenotypical and Molecular Analyses of Arabidopsis Grown under Fluorescent and LED Light.</a> Plants. 6 (2), 24 (2017).</li><li>Janda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+stress+response+in+Arabidopsis+thaliana,+Nicotiana+benthamiana,+Glycine+max,+Solanum+tuberosum+and+Brassica+napus+cultivated+under+polychromatic+LEDs.">Growth and stress response in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Glycine max, Solanum tuberosum and Brassica napus cultivated under polychromatic LEDs.</a> Plant Methods. 11 (1), 31 (2015).</li><li>Olle, M., Vir&#353;ile, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+light-emitting+diode+lighting+on+greenhouse+plant+growth+and+quality.">The effects of light-emitting diode lighting on greenhouse plant growth and quality.</a> Agricultural and food science. 22 (2), 12 (2013).</li><li>Lin, K. -. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+back+to+nature:+a+reality+check+for+experiments+in+controlled+environments.">Getting back to nature: a reality check for experiments in controlled environments.</a> J Exp Bot. 68 (16), 4463-4477 (2017).</li><li>Palus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japan's+Massive+Indoor+Farm+Produces+10,000+Heads+of+Fresh+Lettuce+Every+Day.">Japan's Massive Indoor Farm Produces 10,000 Heads of Fresh Lettuce Every Day.</a> Smithonian.com. , (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der erste Schritt bei der Untersuchung von Pflanzenwachstum ist die Einrichtung der Klimakammer nach den gewünschten Bedingungen. Dies geschieht ganz einfach indem Sie alle Variablen in der Programm-Maske der jeweiligen Software (Abbildung 1A) eingeben. Bei diesem Schritt können viele Änderungen implementiert werden, indem Sie ändern die vereinfachte Regelung und/oder Temperatur. Achten Sie darauf, Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Lichtverhältnisse (Abbildung 2) zu verhindern, dass technisches Versagen ruinieren das Experiment ständig zu überwachen. Dies ist ein kritischer Punkt für reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Obwohl dieses Set-up viele Variablen bietet und flexibel angepasst werden kann, hat es seine Grenzen. Die derzeit verfügbaren LED-Leuchten können nicht dem Sonnenlicht eine hundertprozentige imitieren und die klimatischen Bedingungen in einer Klimakammer können nie vollständig reflektieren was außen15geht.
Im Vergleich zu den weit verbreiteten Leuchtstofflampen LED-Leuchten sind vielseitiger, benötigen weniger Energie und zeigen nahezu keine Wärmestrahlung. Diese Vorteile führten die Großindustrie innen Landwirtschaft, Klimakammern und Gewächshäuser mit LEDs16auszustatten. In Anbetracht der großen Erfolge berichtet in diesem Bereich die LED-Technik finden sicher viele weitere Anwendungen.
Bei der Beobachtung des Phänotyps und vor allem zur Bestimmung der Blattfläche ist es wichtig zu berücksichtigen Blätter, dass in älteren Anlagen Überlappung (Abbildung 3). Grafische Auswertung der gesamten Rosetten tendenziell so ungenau sein. In diesem Fall ist es sehr viel genauer auf alle Blätter abgeschnitten und gehen von dort aus.
Die Auswertung der Wuchsverhalten und vor allem die Unterschiede von Wachstum und Entwicklung unter verschiedenen Bedingungen hängt eine ausreichende Stichprobengröße. In dieser Studie mindestens sechs Pflanzen dienten zur Bestimmung von z.B. photosynthetischen Ertrag (Abbildung 5), Frischgewicht (Abbildung 7), und Blattfläche (Abb. 8A) aber 30 einzelne Samen gepflanzt wurden zu Beginn der Studie zu gewährleisten dass erstens genügende Samen keimen, und zweitens eine Auswahl der "typischen" Pflanzen erzielt werden. Sogar innerhalb der gleichen Bevölkerung, d.h. Pflanzen in einzelnen Töpfen in demselben Fach unter den exakten gleichen Bedingungen zeigten unterschiedliche Phänotypen. Dies spiegelt dann natürlich in die Standardabweichung bei der statistischen Analyse, aber die Interpretation der Daten ist in der Regel zuverlässiger, wenn kleine statistische Fehler (Abbildung 8 b) eingehalten werden.
Messung der photosynthetischen Leistungsfähigkeit von PAM (Abbildung 4, Bild 5) kann für mehrere Parameter erfolgen. In diesem Fall im Mittelpunkt standen PSII Ertrag Y(II) als Beispiel, aber es ist möglich, auch zu ermitteln, z. B. nicht photochemische abschrecken, die Quantenausbeute der regulierten und nicht regulierten Energie Verschwendung oder leichte Remission. Wichtig ist hier, wählen mindestens fünf AOIs pro Blatt gleichmäßig auf der Blattoberfläche verteilt und dann messen Sie mindestens sechs Blätter von verschiedenen Pflanzen. Der Nachteil dieser Methode ist, dass keine Auswirkungen auf die PSI nicht erkannt werden können; zu diesem Zweck braucht man verschiedener Geräte.

Arabidopsis Thaliana wurde der Modellorganismus für Pflanzenforscher der molekularen Ära für mehr als zwei Jahrzehnten. Verschiedene Eigenschaften machen dieses kleine Vertreter der Familie der Brassica einen idealen Kandidat für die genetischen und molekularbiologischen Studien: Es hat ein relativ kleines Genom mit nur fünf Chromosomen (im Vergleich zu z.B. Nicotiana Tabacum mit 24 Chromosomen) und sein Genom wurde in 20001vollständig sequenziert. A. Thaliana durch Agrobacterium Infektion2 einfach genetisch modifiziert werden kann und sogar die neuesten genetischen Werkzeuge wie CRISPR/Cas3zugänglich ist. Obwohl klein, ist der Wachstumszyklus schnell genug, um biochemische Experimente möglich zu machen, wo eine höhere Menge an Material benötigt. Die Pflanzen wachsen auf Agarplatten oder am Boden und können sogar als flüssige Kulturen4kultiviert werden. Arabidopsis kann in klimatisch kontrollierten Schränke, z. B. von Percival, angebaut in Klimakammern oder in Gewächshäusern. Um zu vergleichen Wuchsverhalten und Phänotypen von Mutanten zu analysieren ist es wichtig, reproduzierbar und in der gleichen Zeit flexibles Wachstum Bedingungen5bieten. Je nach die wissenschaftliche Fragestellung, die angesprochen werden soll benötigen eine unterschiedliche Temperaturen und konstante Lichtverhältnisse, unterschiedlichen Lichtintensitäten oder verschiedenen Lichtqualitäten bei gleicher Temperatur. Licht ist ein sehr kritischer Parameter für das Pflanzenwachstum und seinen Einfluss ist oft in unterschiedlicher Ansätze6untersucht. Um die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der erhobenen Daten ist es entscheidend eine stabile Leistung zu gewährleisten und die gleiche Art von Lichtquellen anwenden.
Die üblichen Lichtquellen in Gewächshäusern und Klimakammern bestehen aus Natrium-Dampf oder Leuchtstofflampen, die befriedigend Pflanzenwachstum zu fördern, sondern haben mehrere Nachteile. Erstens, Altern sie im Laufe der Zeit die spektrale Leistung ändert sich nicht nur in der Intensität, sondern in der Qualität (eigene Beobachtungen). Allerdings wird nur die Intensität in der Regel kontinuierlich überwacht, so dass eine Änderung der Lichtqualität könnte unbemerkt aber noch erhebliche Auswirkungen haben. Zweitens: beide Arten von Lampen erzeugen Wärme bei höheren Lichtintensitäten, die selbst hat einen großen physiologischen Einfluss auf das Pflanzenwachstum und könnte jeder abhängige Lichteffekt zu maskieren. Drittens ist die spektrale Ausgabe dieser Lichtquellen unveränderlich und ganz anders als das natürliche Sonnenlicht-7. Diese Nachteile sind bei LEDs überwunden)8,9,10,11. Sie haben eine lange Lebensdauer mit kaum Änderungen der Emission, produzieren keine Abwärme auch bei sehr hohen Lichtintensitäten und sie sind sehr flexibel bezüglich ihrer spektralen Leistung.
Hier zeigen wir, wie Einrichten einer Klimakammer mit separaten LED-Leuchten für rot, blau und weißes Licht und verschiedene Parameter des Pflanzenwachstums im Laufe der Zeit zu folgen. Wir messen Frischgewicht, Blattfläche, Spaltöffnungen Dichte und photosynthetischen Leistung. Zur gleichen Zeit zeigen wir, wie wichtig es ist, richtig einrichten statistische Auswertungen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Climatic chamber equipped with LED panels</td>
			<td>Rhenac Green Tec AG</td>
			<td></td>
			<td>These chambers are custom made.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer&#160;</td>
			<td>OceanOptics</td>
			<td>USB-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging PAM</td>
			<td>Walz</td>
			<td>IMAGING-PAM M-Series</td>
			<td>There are several suitable models depending on the broader use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope+ 40x objective</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DM1000</td>
			<td>Other companies also produce suitable microscopes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download from website</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Needs an additional computer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of arabidopsis thaliana growth behavior in different light qualities

Pflanze Biologen müssen oft Wuchsverhalten ihrer gewählten Arten beobachten. Zu diesem Zweck benötigen die Pflanzen konstant Umwelt- und stabile Lichtverhältnisse, die vorzugsweise variabel in Quantität und Qualität sind damit Studien unter verschiedenen Setups durchgeführt werden können. Diese Anforderungen werden durch Klimakammern mit Licht emittierenden Dioden (LED)-leuchten, die im Gegensatz zu Leuchtstoffröhren – auf verschiedenen Wellenlängen eingestellt werden können – erfüllt. LEDs sind Energie sparen und emittieren praktisch keine Wärme auch bei Lichtintensitäten, die oft ein Problem mit anderen Lichtquellen darstellt. Die vorgestellte Protokoll sieht eine schrittweise Anleitung zum Programmieren einer Klimakammer mit variabler LED-Leuchten ausgestattet sowie mehrere Ansätze für eingehende Analyse der Wachstum Phänotypen zu beschreiben. Je nach der Versuchsaufbau können verschiedene Eigenschaften der wachsenden Pflanzen beobachtet und analysiert werden. Hier beschreiben wir, wie Frischgewicht, Blattfläche, photosynthetische Aktivität und Stomata Dichte bestimmen. Wir zeigen, dass, um verlässliche Daten zu erhalten und gültige Schlüsse ist es zwingend erforderlich, um eine ausreichende Anzahl von Personen für die statistische Auswertung verwendet. Hohe statistische Fehler zu wenige Pflanzen für diese Art von Analyse-Ergebnisse an und folglich in weniger klaren Interpretation der Daten.

Beobachtung und Analyse von Pflanzenwachstum und vor allem Phänotypen von mutierten Pflanzen setzen auf stabile und reproduzierbare Umweltbedingungen. Diese können in Klimakammern werden zur Verfügung gestellt werden. Menge Licht und vor allem Qualität kritisch hängt von den eingesetzten Lichtquelle, die in dieser Studie von LED-Leuchten zur Verfügung gestellt wurde.
Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für eine Klimakammer mit LED-Panels ausgestattet. Abbildung 1A zeigt einen Screenshot des Control Panels wo alle klimatische und leichten Bedingungen angepasst werden kann. Innerhalb von 24 h können zwanzig verschiedenen Zeitrahmen festgelegt werden. In diesem Beispiel sind die langen Tag Bedingungen mit 16 Licht/8 h dunkel programmiert worden. Diese Kammer verfügt über vier Ebenen, die separat programmiert werden können, so dass Pflanzenwachstum bei vier verschiedenen Lichteinstellungen unter genau den gleichen Umweltbedingungen studiert werden kann. Die obere linke Ebene soll eine spektrale Leistung imitiert das Sonnenlicht so weit wie technisch möglich, die oberen rechten Ebene stellt erhöhte rot (660 nm) und blaues Licht (440 nm) mit weißes Licht (3K) reduziert. Die linke untere Ebene wurde auf erhöhte Blaulicht und der unteren rechten Ebene überwiegend rotes Licht gesetzt. Abbildung 1 b zeigt die LEDs mit den verschiedenen Einstellungen als eine Übersicht (mittlere Panel) und die entsprechenden Zoom-Plugins installieren (äußere kleine Platten). Die unterschiedliche Lichtqualitäten kann leicht mit dem Auge gesehen werden.
Eine eingebaute Spektrometer ständig misst, überwacht und passt die spektrale Leistung. Abbildung 2 zeigt das Spektrum von der oberen linken Ebene 1.1, die gegründet wurde, um Sonnenlicht zu imitieren. Im Vergleich zu einer standard-Glühbirne ist der Teil des UV- und Blaulicht viel höhere7.
In Abbildung 3 ein Beispiel von A. Thaliana Pflanzen aus allen vier Bedingungen 10, 13 und 17 Tagen bzw. nach Aussaat dargestellt wird. Alle Pflanzen wurden aus der gleichen Entfernung von Befestigung der Kamera auf einem Stativ fotografiert. Der Maßstabsbalken entspricht 1 cm. Nach 10 Tagen nicht viel Unterschied in der Größe oder Farbe, kann erkannt werden, aber nach 17 Tagen ein schnelleres Wachstum unter Rotlicht ist offensichtlich. Neben dieser visuellen Analyse wurden mehrere physiologische Untersuchungen durchgeführt.
Abbildung 4 folgt die verschiedenen Schritte der PAM-Messungen, die z. B. Photosynthesekapazität analysiert. In Abbildung 4A ist ein Screenshot von der live-Video gezeigt das ist die Einstellung für die Pflanze in den Vordergrund zu bringen, um optimale Qualität der Messungen zu gewährleisten. Anstatt die ganze Pflanze, kann man auch wählen, ein einzelnes Blatt zu analysieren. Abbildung 4 b zeigt die fluoreszierenden Stromausbeute Ft einer angepassten Pflanze vor die eigentliche Messung gestartet wurde. In diesem Fall wurden fünf Runden Interessensgebiete (AOIs) gewählt. Die Zahlen in den roten Kästchen neben jedem AOI gibt direkt das numerische Ergebnis, das auch in Form einer Tabelle gespeichert werden kann. Um eine Messung der photosynthetischen Parameter Fo einzuleiten, muss Fm festgelegt. Ein Screenshot von Ft nach auf diese Weise ist in Abbildung 4dargestellt. Beachten Sie, dass jetzt die Schaltfläche "Fo, Fm" nicht mehr aktiv ist. Um eine neue Messung zu starten, muss "Neuer Datensatz" angeklickt werden, um die vorherigen Normalisierung zu löschen. Abbildung 4 zeigt die effektive Quantenausbeute PSII Y(II) nach einem sättigbaren Lichtimpuls ("SAT-Pulse") geben. Quantifizierung der beispielhafte Daten ist in Abbildung 5dargestellt. Pflanzen unter Sonnenlicht bei 200 µM/cm2/s1 (Abb. 5A) wurden 12, 21 und 28 Tage nach der Aussaat bzw. analysiert. Unsere Daten zeigen, dass PSII Ausbeute deutlich höher in den Blättern von Pflanzen für drei Wochen als für 12 Tage. Der Unterschied zwischen 28 und 12 Tagen ist immer noch signifikant, aber der p-Wert ist höher. In Abbildung 4 bwurden PSII Erträge von Pflanzen für zwei Wochen von verschiedenen Lichtqualitäten verglichen. Interessanterweise führt ständige Wachstum unter Licht mit einem hohen Anteil an blauem Licht eine deutlich höhere Ausbeute an PSII. Ein ähnlicher Effekt wurde für unter angereicherten Rotlicht kultivierten Pflanzen beobachtet, aber der Anstieg war ein wenig niedriger.
Unterschiedliche Lichtqualitäten wurden Effekt Spaltöffnungen Entwicklung14gezeigt. Daher wurde die Stomata Dichte untersucht. Abbildung 6 zeigt, wie ein Blatt nach der Extraktion Pigment aussieht. Einzige Epidermiszellen gut unterschieden werden können, und Stoma leicht gezählt werden kann. In der Abbildung sind individuelle Spaltöffnungen durch ein Sternchen gekennzeichnet. Detaillierte Daten über die Stomata Dichte der Pflanzen aus den verschiedenen Lichteinstellungen finden Sie ebenfalls9.
Neben der Sichtkontrolle (Abbildung 3) bietet das Frischgewicht ein gutes Maß für den Fortschritt des Wachstums. In diesem Beispiel wurden die Blätter von Pflanzen unter "Sonnenlicht" nach 8, 10 und 12 Tage nach der Aussaat bzw. gewogen. Statistische Auswertung dieser Daten ist in Abbildung 7ersichtlich. Erwartungsgemäß steigt die Frischgewicht mit der Zeit.
Die Blattfläche ist neben Frischgewicht ein gutes Maß für Wachstum. Hier folgte die Pflanzenentwicklung aus 10, 13 und 17 Tage nach der Aussaat (Abb. 8A). Mindestens sechs einzelne Pflanzen wurden routinemäßig ausgewertet, um zuverlässige statistische Daten zu erhalten. Um die Bedeutung einer hohen Stichprobengröße zu demonstrieren, wurde der prozentualen Fehler des Mittelwertes, von zwei bis sechs Pflanzen, bzw. Analyse berechnet (Abbildung 8 b). Das bedeutet, dass der Prozentsatz der Standardabweichung in Bezug auf den Mittelwert ermittelt wurde. Es ist ganz klar, dass im Falle einer kleinen Stichprobe der Fehler zwischen 5-10 % höher als bei einer höheren Probengröße. Durch die Erhöhung der Anzahl der Pflanzen, die ausgewertet werden, kann die Fehler minimiert werden, wodurch die Interpretation der Daten viel klarer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig1.jpg"> Abbildung 1: unterschiedliche Lichtqualitäten stammen von LEDs. (A) Screenshot aus dem Control Panel LED-Kammer. Tageslänge soll 16 h (oben rechts) und die Lichtintensität ist auf 200 µmol cm-2 s-1eingestellt. Die Lichtqualität ist anders auf allen vier Ebenen: 1.1 repräsentiert ein Spektrum als ähnlich wie das Sonnenlicht als technisch möglich, 1.2 stellt einen hohen Prozentsatz der roten und blauen Wellenlängen (RB) Licht, 2.1 befindet sich überwiegend auf blau (B), 2,2 stellt hauptsächlich rot Licht (R). B) der mittleren Spalte zeigt eine Übersicht über alle Ebenen; die äußeren Bereiche zeigen die einzelnen Ebenen in einem höheren Zoom. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig2.jpg"> Abbildung 2: Wellenlängenspektrum von simulierten Sonnenlicht Einstellungen. Ein Screenshot aus dem eingebauten Spektrometer in der LED-Kammer wird angezeigt, die Ebene 1.1 positioniert war. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig3.jpg"> Abbildung 3: Pflanzenentwicklung Tag(en). Repräsentative A. Thaliana Pflanzen aus allen vier Lichtverhältnissen von 10, 13 und 17 DAS. Pflanzen wurden mit einer digitalen Spiegelreflex-Kamera auf einem Stativ fotografiert. Maßstabsbalken entspricht 1 cm für alle Bilder. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig4.jpg"> Abbildung 4: Screenshots von repräsentativen Treppe von PAM-Messungen von A. Thaliana Pflanzen. A) Screenshot aus der "Live-Video" wo die Bildschärfe angepasst werden kann. B) Fluoreszenz-Stromausbeute Ft vor der Applikation Lichtimpulse. C) Fluoreszenz-Stromausbeute Ft nach Einstellung der Fo/zegit D) bewirken PSII Quantenausbeute nach Setzung einer Sättigung Lichtpuls. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig5.jpg"> Abbildung 5: grafische Darstellung der bewirken PSII Quantenausbeute (YII). (A) Daten aus Pflanzen 12, 21 und 28 Tage nach der Aussaat und Anbau unter 200 µmol/cm2/s1 unter simulierten Sonnenlicht ("Sonnenlicht") PAM Analyse unterzogen wurden statistisch ausgewertet. Dargestellt sind die Mittelwerte von fünf Pflanzen und fünf AOIs pro Tag. Ein Sternchen zeigt einen signifikanten Unterschied mit einem p-Wert < 0,05 12 und zwei Sternchen sehr große Unterschiede mit einem p-Wert geben im Vergleich zu Tag < 0,02 laut Students' t-Test. B) Daten aus Pflanzen 200 µmol/cm 2/s1 unter simulierten Sonnenlicht (SL), bereichert blau (B) oder rot (R) Licht, bzw. wurden statistisch ausgewertet. Dargestellt sind die Mittelwerte von fünf Pflanzen und fünf AOIs pro Tag. Berechnet wurden signifikante Unterschiede im Vergleich zu "Sonne."
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig6.jpg"> Abbildung 6: repräsentatives Bild der Spaltöffnungen abaxial seitlich ein A. Thaliana Blatt. Blätter wie oben beschrieben vorbereitet und wurden visuell unter einem Lichtmikroskop mit DIC Einstellungen bei 40 X Vergrößerung analysiert. Spaltöffnungen sind im sichtbaren Bereich mindestens 4 Blätter pro Zustand gezählt. Das Bild wurde aufgenommen mit einer digitalen Kamera an das Mikroskop Tubus angeschlossen. Die Anzahl der Spaltöffnungen pro mm ² errechnet sich mit Hilfe des Maßstabs. Sterne bedeuten ein einzelnes Stoma. Die Maßstabsleiste stellt 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig7.jpg"> Abbildung 7: grafische Darstellung der Frischgewicht von A. Thaliana Pflanzen bei simuliert Sonnenlicht/200 µmol/cm2/s1. Rosette Blätter wurden aus Pflanzen, acht, zehn und zwölf Tage nach der Aussaat geschnitten. Mittelwerte in mg aus sechs Pflanzen pro Tag werden dargestellt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig8.jpg"> Abbildung 8: Statistische Auswertung von A. Thaliana Blattfläche von Pflanzen unter verschiedenen Lichtbedingungen. A) Blattfläche von A. Thaliana 10, 13 und 17 Tage lang gewachsen wurde grafisch ermittelt mit ImageJ und Daten von n = 6 Pflanzen wurden statistisch ausgewertet. Die Blattfläche aus allen sechs Rosetten aus jede Bedingung war fasste und geteilt durch sechs auf den Mittelwert zu erhalten. Mit diesem Wert die Standardabweichung berechnet wurde, und dies wird durch die Fehlerbalken dargestellt. B) Blattfläche wurde grafisch ermittelt mit ImageJ und Daten aus entweder n = 2 oder n = 6 Pflanzen, bzw. wurden statistisch analysiert, wie für Panel A. beschrieben Dann war der Fehler in Prozent des Mittelwertes berechnet und graphisch dargestellt. Grüne Balken zeigen die prozentuale Fehler aus der Analyse von n = 6, blau Bars von n = 2 Pflanzen. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Analyse des Wachstumsverhaltens von Arabidopsis thaliana bei verschiedenen Lichtqualitäten | Biologie | Video

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für das Studium der Pflanze Wuchsverhalten und vor allem Phänotypen reproduzierbar. Wir zeigen wie Sie bieten Variable und in der gleichen Zeit stabilen Lichtverhältnissen. Richtige Analysen hängen ausreichend Probennummern und gültige statistische Auswertungen.

Analyse von Arabidopsis Thaliana Wuchsverhalten in verschiedenen Licht-Qualitäten

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

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18.8K Aufrufe.  Ludwig-Maximilians-Universität. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für das Studium der Pflanze Wuchsverhalten und vor allem Phänotypen reproduzierbar. Wir zeigen wie Sie bieten Variable und in der gleichen Zeit stabilen Lichtverhältnissen. Richtige Analysen hängen ausreichend Probennummern und gültige statistische Auswertungen.

Serie: Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Anwendung von Licht-gehärteten Dental Adhesive Resin für Montage-Elektroden oder Mikrodialysesonden in Chronic Experimente

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Forschung

Biologie

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video bioinformatischen Analyse von humanen embryonalen Stammzellen Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-dip Transformation von Arabidopsis thaliana Zum Untersuchen PTSO2: β-Glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling durch Dünnschichtchromatographie (TLC) mit Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (GLC) Coupled

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fahrwerk Zellkulturen

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of dormant seeds or that of nondormant seeds irradiated by a far red (FR) light pulse. In order to further gain insight into the molecular genetic mechanisms underlying the germination repressive activity exerted by the endosperm, a &#34;seed coat bedding&#34; assay (SCBA) was devised. The SCBA is a dissection procedure physically separating seed coats and embryos from seeds, which allows monitoring the growth of embryos on an underlying layer of seed coats. Remarkably, the SCBA reconstitutes the germination repressive activities of the seed coat in the context of seed dormancy and FR-dependent control of seed germination. Since the SCBA allows the combinatorial use of dormant, nondormant and genetically modified seed coat and embryonic materials, the genetic pathways controlling germination and specifically operating in the endosperm and embryo can be dissected. Here we detail the procedure to assemble a SCBA.

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

We present the procedure to assemble a seed coat bedding assay (SCBA) from Arabidopsis thaliana seeds. The SCBA was shown to be a powerful tool to explore genetically and in vitro how the endosperm controls seed germination in dormant seeds and in response to light cues. The SCBA is in principle applicable under any situation where the endosperm is suspected to influence embryonic growth.

Ein Mantel Bettwäsche Seed-Test zur Genetisch erkunden<em&gt; In-vitro-</em&gt; Wie das Endosperm Kontrollen Keimung der Samen in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Histochemische Färbung von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sekundärzellwand-Elemente

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Analyse von Arabidopsis Thaliana Wuchsverhalten in verschiedenen Licht-Qualitäten

Zusammenfassung

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Anwendung von Licht-gehärteten Dental Adhesive Resin für Montage-Elektroden oder Mikrodialysesonden in Chronic Experimente

Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Video bioinformatischen Analyse von humanen embryonalen Stammzellen Colony Growth

Floral-dip Transformation von Arabidopsis thaliana Zum Untersuchen PTSO2: β-Glucuronidase Reporter Gene Expression

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling durch Dünnschichtchromatographie (TLC) mit Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (GLC) Coupled

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von

Ein Mantel Bettwäsche Seed-Test zur Genetisch erkunden

Histochemische Färbung von