F.S. destek Rhenac Green Tec AG'nin bu çalışmanın bölümleri kabul eder. JS ve B.B. DFG (SFB TR175) fon aldı.

Bu protokolü nasıl A. thaliana bitkiler büyüme davranışlarını analiz etmek için bazı örnekler içerir.
1. hazırlık
<ol><li>Başlamadan önce kaç bitki deneyler güvenilir bir istatistiksel analizi yapmak için gerekli olacak ve tencere uygun miktarda hazır olun dikkatli bir plan yapın. Not: Her zaman için değil bazı tohum çimlenme olasılığı sağlar.</li>
	<li>İklimsel odası farklı ayrı ayrı programlanabilir LED düzeyleri ile aynı genel çevre koşulları (malzemeler tablo) altında bitki büyüme karşılaştırmak için kullanın.</li>
</ol>2. bitki büyüme ve Set-up LED ışıkları
<ol><li>6 x 7 cm tencere toprak ile uygun bir sayı (bağlı olarak farklı koşullar ve/veya analiz edilecek mutantlar) hazırlamak ve her birinde tek bir tohum bitki. Not: Bu durumda, koşullar başına 36 bitkilerin ekili.</li>
	<li>4 ° C'de 2 gündür vernalize</li>
	<li>Göreli hava nemi % 65 ve sıcaklığı 22 ° C/16 ° C 16 h gün / 8 h gündüz döngüsü ayarlayın. 200 µM/cm2/s1bir yoğunluk için her seviyedeki ışığı ayarlayın. Bu iklimsel odası önünde dokunmatik ekran üzerinden bir programa ilgili değerleri girerek yaparsınız. Dört farklı ışık nitelikleri karşılaştırmak için tablo 1'de belirtilenler LED'ler için aşağıdaki parametreleri ayarlayın.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Identifyier</td>
			<td>395 nm [%]</td>
			<td>440 nm [%]</td>
			<td>3 K [%]</td>
			<td>660 nm [%]</td>
			<td>770 nm [%]</td>
		</tr>
<tr>
<td>"güneş ışığı"</td>
			<td>100</td>
			<td>11</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kırmızı ve mavi (RB)</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mavi (B)</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>25</td>
			<td>2</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Red (R)</td>
			<td>90</td>
			<td>2</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: LED yayılan ışık yoğunluklarını kompozisyon
<ol start="4"><li>Spektral çıktı sürekli olarak yerleşik bir kalibre edilmiş Spektrometre kullanarak örneğin izlemek.</li>
	<li>Bitkiler farklı düzeylerde iklimsel odası yerleştirin ve iyi gelişmiş cotyledons görünür hale gelene kadar ile şeffaf bir üst kapalı tutun. Bitkiler yeterince sulanan emin olun.</li>
	<li>Monitör ve belge bitkiler göz ve olabildiğince sık uygun, fotografik seçilen koşullarda, örneğin her iki gün bağlı olarak ne kadar hızlı bitkiler büyümek. Fotoğraf makinesi ve nesneleri tüm fotoğrafların arasında eşit mesafede sağlamak ve böylece karşılaştırma etkinleştirmek için bir tripod kamera için kullandığınızdan emin olun. Bir ölçek çubuğu uygun olduğunda kullanın. Not: Terim DAS (Ekim sonra gün) gerçek vernalization de dahil olmak üzere tohumları dikim için anlamına gelir.</li>
</ol>3. PSII verim tespiti
<ol><li>Nabız modülasyonlu fluorimeter kullanın. Uygun bir mesafede kamera kafası kadar bitki tam rozet-ebilmek var olmak seen üstünde belgili tanımlık canlı pencere ayarlayın.</li>
	<li>Yazılım başlangıç üzerine "select birimi" penceresi görüntülenir. Tıkırtı "MINI" ve sonra "Tamam." "Mavi" renk sonraki açılan pencerede seçin. "Tamam." Not: otomatik olarak darbe modülasyonlu Floresan ışık ölçüm açýlýr. Monitörde, Floresans parametre Ft gösteren görüntü penceresi belirir. Kameranın altında yer bir bitki şimdi turuncu bir resim olarak görülebilir.</li>
	<li>Görüntü odak ve/veya belirli bölgeleri bitki seçmek için Video canlı "canlı video" kutusunu işaretleyerek tarafından geçiş ve objektif lens ayar halkası etkinleştirin. Canlı Video penceresinin sağ üst köşesinde çıkış kutusunu tıklatarak çıkın.</li>
	<li>Fotosentetik parametrelerini ölçmek için bir ilgi (AOI) alanı tanımlayın. Bunlar, otomatik olarak ekranın ortasında görüntülenen bir daire için varsayılan ayarı kullanın. Bunun yanında kırmızı bir kutu tüm pikseller AOI içinde ortalama Ft değerini temsil eder. Burada farklı formlarda kullanılabilir sağ panelinden AOI kutusundan seçerek uygun AOI tanımlayın. "Ekle" AOI sekmesini tıklatın ve Daire yaprak içinde yerleştirin. Yaprak beş kez tekrarlayın.</li>
	<li>(Tablo 2) üreticisi tarafından sağlanan varsayılan değerlerinde (sağ sekme) ayarlarını korumak.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ölçü birimi ışık</td>
			<td>Int.</td>
			<td>Frekans</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hareket. Işık</td>
			<td>Int.</td>
			<td>Genişlik</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Resim düzeltmeleri</td>
			<td>MINI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Görüntü dönüştürme</td>
			<td>Pil</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>16.7V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Kazanç</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sönümleme</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sat darbe</td>
			<td>Int.</td>
			<td>Hayır</td>
			<td>Aralık s</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yavaş indüksiyon</td>
			<td>Gecikme s</td>
			<td>Saat s</td>
			<td>Süre s</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>40</td>
			<td>20</td>
			<td>315</td>
		</tr>
<tr>
<td>Absortivity</td>
			<td>Kırmızı kazancı</td>
			<td>Kırmızı yoğunluğu</td>
			<td>NIR yoğunluğu</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>340</td>
			<td>25</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Görüntü</td>
			<td>Renk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PS Sınır</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>INH. Ref. AOI</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FM faktörü (tıkırtı)</td>
			<td>1,030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: varsayılan ayarlar olarak üretici tarafından sağlanan PAM ölçümler için.
<ol start="6"><li>Fotosentetik parametrelerinin ölçüm analizi (doygunluk darbe) Şoklama floresan tarafından gerçekleştirmek için doyurarak ışık flaş uygulamak. Bundan önce su verme katsayıları minimal ve maksimal Floresans verim dark-adapted bir bitkinin ölçerek belirlemek. Bu amaçla, bitki karanlıkta (örneğin bir çekmece veya koyu kutu) birkaç dakika yerleştirin. Sonra bitki kamera kafası altında yer, resmi seçin "Fv/Fm" çember içine saatle denetim altındaki satırda ölçü ve ML (ışık ölçüm), kutuları işaretleyin ve Fo, Fm ekranın alt'ı tıklatın. Not: Fo/Fm PSII verim dark-adapted bir bitkinin temsil eder. Böylece, ışık uygulandıktan sonra ölçüm normalleştirilmiş değeridir. Yeni kayıt etkinleştirilene kadar geçerli Fo/Fm ölçüm kalacaktır. Tüm F ve Fm' doygunluk bakliyat tarafından belirlenen değerleri Fo/Fm ile ilgili ve su verme parametreleri buna göre hesaplanır.</li>
	<li>Bu sonuçlar rapor sekmesinde bulmak ve sağ tarafta deney (örn. ilgili tüm kutuları işaretleyin Y(II), qP, qN, vb).</li>
	<li>Sonuçları için bir analiz yazılımı örneğindışa aktarabilirsiniz. Sol üst köşede dışa aktar düğmesini tıklatarak excel ve uygun dosya adı altında kaydedin. Yaprak başına en az beş AOIs oluşturmak ve aynı bitkinin çeşitli yaprakları ölçmek (kısa bir süre için karanlık tekrar her ölçüm sonra bitki uyum unutmayın), yanı sıra çeşitli bitkilerden bir şartla, hangi sonra istatistiksel olarak değerlendirildi.</li>
	<li>İstatistiksel analiz için ortalama değerler ve standart sapmalar oluşturmak tüm AOIs ve tüm için en az üç bağımsız bitki Puan/koşullar zaman ve bir öğrenci t-test verileri önemli12olup olmadığını değerlendirmek için gerçekleştirin. P-değeri 0,05 altında olduğunda veri önemli ölçüde farklı değerlendirilir.</li>
</ol>4. stoma bantlı yoğunluk tayini
<ol><li>Koşul başına üç bireysel bitki toplamak üç tam olarak genişletilmiş rozet yaprakları % 70 etanol cam petri kabına ve klorofil ayıklamak için içine. Bu çözücü gecede oda sıcaklığında veya mağaza 4 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Kloral hidrat çözümde pigmentler üzerinden tam giriş izni için kuluçkaya (kloral hidrat: su: gliserol = 8: 2: 1 w/v/w) yaprakları tamamen beyaz görününceye kadar.</li>
	<li>Fark girişim mikroskobu (DIC) görüntü abaxial yüzeyinin 40 X büyütme oranında alabilir. Stoma bantlı görme alanı içinde saymak ve stoma bantlı mm² başı için ölçek çubuğu yardımıyla tahmin. Bu yordam için en az 4 koşullar bırakır yineleyin. Bütün yaprakları bir koşul için ortalama değerlerini hesaplayarak istatistiksel çözümleme gerçekleştirme ve bundan kötü hata hesaplamak.</li>
</ol>5. taze ağırlık tespiti
<ol><li>Tüm yaprak sapları rozet koşul bir tıraş bıçağı ile başına altı bitkilerden gelen dahil olmak üzere kaldırın. Bütün yaprakları hemen tartmak bulunmaktadır ve verileri İstatistiksel analizler için yukarıda açıklandığı gibi.</li>
</ol>6. rozet yaprak alanı belirlenmesi
<ol><li>Koşul başına sekiz bitkiler resimlerden yaprak alanı grafik olarak çözümlemek için kullanın. Resimleri tek bir görüntüde bir koşul için birleştirmek ve *.jpeg kaydedin veya * .tiff.</li>
	<li>Uygun yazılımı (malzemeler tablo) indirin. Not: Bu, tabii ki, bu görev sahip başka bir program uygulamak mümkündür.</li>
	<li>Bir görüntü dosyasını açın. "Serbest el seçimi." Aracı'nı seçin Yaprak sapları bir rozet de dahil olmak üzere çevreler. Tıkırtı üstünde "Analiz - set ölçümleri" ve "Alan", "Min ve Max gri değeri," kontrol "Entegre yoğunluk" ve "Ortalama gri değer." Uygun ondalık yerler, en iyi iki ya da üç seçin ve "Tamam."</li>
	<li>2 piksel yerine mm almak için "ölçek set" komutunu kullanın. Bilinen bir mesafe için örneğin kolay görüntüleri, ölçek çubuğundan hesaplamak o zaman ölçeği ayarla iletişim kutusunu açmak ve bu tanımlanmış mesafe ve birimi girin bırak çapı karşılık gelen satır seçim yapmak için normal amortisman seçim aracını uygulamak ölçüm. "Analiz" ve "ölçü" tıklatın geri dön</li>
	<li>Yeni bir pencere "başlıklı sonuçları geçerli rozet için ilgili verileri içeren" görüntülenir. Görüntüdeki tüm bitkiler ile bu yordamı yineleyin ve alan ölçüleri ile Ctrl + M yeni her bitki için başlatılamıyor. Not: Üst üste yaprakları ile daha küçük bitkiler için "değnek aracı" daha kolay ve hızlı işlem yapmak için kullanılabilir. Yaprakları birbirine kapsayan başlar başlamaz bu aracı güvenilir sonuçlar vermez.</li>
	<li>Alternatif olarak, tüm yaprakları kesti ve bir genel bakış resim alınabilir ve Değnek aracını kullanın bir şekilde pozisyon. Bu yöntemi kullanırken, daha fazla bitkiler ihtiyacı olduğunu göz önünde bulundurun.</li>
	<li>"Dosya"-"Farklı Kaydet" sonuçları penceresinde ve uygun dosya adını ve konumunu bilgisayar Rehberi oluşturmak. Dosyayı otomatik olarak Excel biçiminde kaydedilir.</li>
</ol>7. RNA hazırlanması
<ol><li>Üç örnek her koşul için on bireysel bitkilerden hasat. Toplam RNA bir bitki RNA ekstraksiyon kiti üreticinin talimatlarına göre kullanarak ayıklayın. RNA konsantrasyon, saflık ve bütünlük bir bioanalyzer kullanarak belirleyin. RNA daha sonra aşağı akım kullanma öyle aynı derecede qRT-PCR veya gen ifade analizi için örneğin tarafından RNASeq13kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>An, G., Watson, B. D., Chiang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Tobacco,+Tomato,+Potato,+and+Arabidopsis+thaliana+Using+a+Binary+Ti+Vector+System.">Transformation of Tobacco, Tomato, Potato, and Arabidopsis thaliana Using a Binary Ti Vector System.</a> Plant Physiology. 81 (1), 301-305 (1986).</li><li>Schiml, S., Fauser, F., Puchta, H., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromosome and Genomic Engineering in Plants: Methods and Protocols. , 111-122 (2016).</li><li>Rivero, L., Sanchez-Serrano, J. J., Salinas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arabidopsis Protocols. , 3-25 (2014).</li><li>Ubbens, J. R., Stavness, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Plant+Phenomics:+A+Deep+Learning+Platform+for+Complex+Plant+Phenotyping+Tasks.">Deep Plant Phenomics: A Deep Learning Platform for Complex Plant Phenotyping Tasks.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1190), (2017).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Suppression+of+Growth+by+Blue+Light:+OCCURRENCE,+TIME+COURSE,+AND+GENERAL+CHARACTERISTICS.">Rapid Suppression of Growth by Blue Light: OCCURRENCE, TIME COURSE, AND GENERAL CHARACTERISTICS.</a> Plant Physiology. 67 (3), 584-590 (1981).</li><li>Seiler, F., Soll, J., B&#246;lter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Phenotypical+and+Molecular+Analyses+of+Arabidopsis+Grown+under+Fluorescent+and+LED+Light.">Comparative Phenotypical and Molecular Analyses of Arabidopsis Grown under Fluorescent and LED Light.</a> Plants. 6 (2), 24 (2017).</li><li>Janda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+stress+response+in+Arabidopsis+thaliana,+Nicotiana+benthamiana,+Glycine+max,+Solanum+tuberosum+and+Brassica+napus+cultivated+under+polychromatic+LEDs.">Growth and stress response in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Glycine max, Solanum tuberosum and Brassica napus cultivated under polychromatic LEDs.</a> Plant Methods. 11 (1), 31 (2015).</li><li>Olle, M., Vir&#353;ile, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+light-emitting+diode+lighting+on+greenhouse+plant+growth+and+quality.">The effects of light-emitting diode lighting on greenhouse plant growth and quality.</a> Agricultural and food science. 22 (2), 12 (2013).</li><li>Lin, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+red,+blue,+and+white+light-emitting+diodes+on+the+growth,+development,+and+edible+quality+of+hydroponically+grown+lettuce+(Lactuca+sativa+L.+var.+capitata).">The effects of red, blue, and white light-emitting diodes on the growth, development, and edible quality of hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa L. var. capitata).</a> Scientia Horticulturae. 150, 86-91 (2013).</li><li>Castronuovo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+spectrum+affects+growth+and+gas+exchange+of+common+dandelion+and+purple+coneflower+seedlings.">Light spectrum affects growth and gas exchange of common dandelion and purple coneflower seedlings.</a> International Journal of Plant Biology. , (2016).</li><li>Student, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+PROBABLE+ERROR+OF+A+MEAN.">THE PROBABLE ERROR OF A MEAN.</a> Biometrika. 6 (1), 1-25 (1908).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+Genetics.+RNA-Seq.">Essentials of Genetics. RNA-Seq.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Klermund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LLM-Domain+B-GATA+Transcription+Factors+Promote+Stomatal+Development+Downstream+of+Light+Signaling+Pathways+in+Arabidopsis+thaliana+Hypocotyls.">LLM-Domain B-GATA Transcription Factors Promote Stomatal Development Downstream of Light Signaling Pathways in Arabidopsis thaliana Hypocotyls.</a> The Plant Cell. 28 (3), 646-660 (2016).</li><li>Annunziata, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+back+to+nature:+a+reality+check+for+experiments+in+controlled+environments.">Getting back to nature: a reality check for experiments in controlled environments.</a> J Exp Bot. 68 (16), 4463-4477 (2017).</li><li>Palus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japan's+Massive+Indoor+Farm+Produces+10,000+Heads+of+Fresh+Lettuce+Every+Day.">Japan's Massive Indoor Farm Produces 10,000 Heads of Fresh Lettuce Every Day.</a> Smithonian.com. , (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bitki büyüme okuyan ilk adımı istenen koşullara göre iklimsel odası kurma. Bu kolayca ilgili yazılım (şekil 1A) programı maskeye tüm değişkenleri yazarak yapılır. Bu adımda, ışık rejimi ve/veya sıcaklık değiştirerek birçok değişiklikler uygulanabilir. Sürekli sıcaklık, nem ve ışık koşullarında (teknik deney bozma önlemek için,Şekil 2) izlemek emin olun. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bir kritik nokta bu. Bu kurulum çok değişken sunuyor ve esnek şekilde ayarlanabilir olmasına rağmen kendi sınırlamaları vardır. Şu anda mevcut LED ışıklar güneş ışığı yüzde yüz taklit edemez ve iklimsel odası içinde iklim koşulları asla tamamen dış15tarihinde neler olduğunu yansıtabilir.
Yaygın olarak kullanılan karşılaştırıldığında floresan ampuller LED ışıkları daha çok yönlü, daha az enerji ihtiyacı ve hemen hemen hiçbir ısı radyasyon göstermektedir. Bu avantajları iklim odaları ve LED16seralara donatmak için kapalı tarım büyük sanayi açmıştır. Büyük başarı dikkate alınarak, bu alanda LED tekniği kesinlikle çok daha fazla uygulama bulabilirsiniz bildirdi.
Fenotip gözlemleyerek ve özellikle dikkate almak önemlidir yaprak alanının belirlenmesi için bu büyük bitkilerde örtüşme (şekil 3) bırakır. Böylece, Bütün rozet grafik değerlendirilmesi imprecise olma eğilimindedir. Bu durumda, tüm yaprakları kesip oradan gitmek çok daha doğrudur.
Büyüme davranış değerlendirilmesi ve özellikle farklılıklar büyüme ve gelişme farklı koşullar altında yeterli bir örnek boyutuna bağlıdır. Bu çalışmada en az altı bitkiler örneğin fotosentetik verim (şekil 5), taze ağırlık (Şekil 7), belirlenmesi için kullanılan ve yaprak alanı (şekil 8A) ama 30 bireysel tohum emin olmak için çalışma başlangıcında dikilmiştir ilk, yeterli tohum çimlenme ve ikinci olarak, "tipik" bitkilerin bir seçim yapılabilir. Aynı nüfus, Yani bitkiler tek tencere içinde tam olarak aynı koşullarda, aynı tepsi içinde bile değişen fenotipleri gösterdi. Bu sonra tabii olarak standart sapma istatistiksel çözümleme sırasında yansıtılır, ama küçük istatistiksel hataları (8B rakam) gözlendiğinde veri yorumlanması genellikle daha güvenilirdir.
PAM (şekil 4, şekil 5) tarafından fotosentetik performans ölçümü için birkaç parametre yapılabilir. Bu durumda, PSII verim Y(II) örnek olarak odak oldu ama örneğin olmayan fotokimyasal Şoklama, düzenlenmiş ve sigara düzenlenir enerji dağıtımı veya hafif remisyon kuantum verimi de belirlemek mümkündür. İşte yaprak yaprak yüzeyi boyunca eşit olarak dağıtılmıştır başına en az beş AOIs seçin ve ardından en az altı farklı bitki yapraklarından ölçmek için önemli. Bu yöntemin dezavantajı PSI üzerinde herhangi bir etkileri tespit edilemez olduğunu; Bu amaç için gerekli olan farklı ekipman.

Arabidopsis thaliana model organizma fazla iki yıl için moleküler dönemin bitki araştırmacılar için olmuştur. Çeşitli özellikleri bu küçük temsilcisi Brassica ailesinin genetik ve moleküler çalışmalar için ideal bir aday yapmak: sadece beş kromozomlar ( örneğin tütün için 24 kromozom ile karşılaştırıldığında) ile nispeten küçük bir genom vardır ve genomunu tamamen 20001' sıralı. A. thaliana Agrobacterium enfeksiyon2 tarafından kolayca genetik olarak değiştirilebilir ve mükellef bile en son genetik araçları CRISPR/Cas3gibi. Küçük olmasına rağmen büyüme döngüsünün biyokimyasal deneyler uygun malzeme daha yüksek bir miktar gerektiği yerde yapmak için yeterince hızlı. Bitkiler büyümek Ağar kaplamalar ya da toprak ve hatta sıvı kültürleri4ekili olabilir. Arabidopsis Speed'in kontrollü dolapları, örneğin Percival, üzerinden içinde yetiştirilen iklim odaları veya seralar. Büyüme davranış ve fenotipleri mutantların edebilmek için tekrarlanabilir ve aynı zaman esnek büyüme koşulları5sağlamak için önemlidir. Ele alınması için bilimsel soruna bağlı olarak onlardan farklı sıcaklıklarda ve sabit ışıklı ortamlarda, farklı ışık yoğunluklarda veya farklı ışık nitelikleri aynı sıcaklıkta ihtiyacım olabilir. Işık bitki büyüme çok kritik bir parametredir ve nüfuzunu kez farklı yaklaşımlar6' da okudu. Tekrarlanabilirlik ve karşılaştırılabilir elde edilen veri sağlamak için istikrarlı bir çıkış sağlamak ve ışık kaynakları aynı tür uygulamak önemlidir.
Seralar ve iklimsel chambers her zamanki ışık kaynaklarında sodyum buharı veya floresan lambalar, tatmin edici bitki büyüme teşvik ancak birkaç dezavantajları var oluşur. İlk olarak, onlar sadece yoğunluğu aynı kalitede (kendi gözlemleri) spektral çıkış değiştirir zamanla yaş. Böylece ışık kalitesi bir değişiklik fark edilmeden devam ama hala önemli etkileri vardır ancak, sadece yoğunluğu genellikle sürekli olarak izlenir. İkinci olarak, her iki tür lambalar ısı üretir daha yüksek ışık yoğunluklarını, kendisini bitki büyüme bir derin fizyolojik etkisi vardır ve herhangi bir ışık bağımlı etkisi maske. Üçüncü olarak, alınan spektral bu ışık kaynakları değişmez ve oldukça doğal güneş ışığı7farklı olarak çıktı. Bu sakıncaları LED'ler durumunda üstesinden var)8,9,10,11. Onlar-si olmak uzun ömürlü emisyon ancak herhangi bir değişiklik ile çok yüksek ışık yoğunluklarını, bile atık ısı üretmek değildir ve onların spektral çıkış ile ilgili çok esnektir.
Burada nasıl bir iklimsel odası ayrı LED ışıklar kırmızı, mavi ve beyaz ışık için yer ayarlayın ve bitki büyüme zaman içinde farklı parametreleri takip göstermektedir. Biz taze ağırlık, yaprak alanı, stoma bantlı yoğunluğu ve fotosentetik performansını ölçmek. Aynı zamanda, biz düzgün kadar istatistiksel değerlendirme ayar önemi göstermek.

<table><tbody><tr><td>Climatic chamber equipped with LED panels</td><td>Rhenac Green Tec AG</td><td></td><td>These chambers are custom made.</td></tr><tr><td>Spectrometer&amp;nbsp;</td><td>OceanOptics</td><td>USB-650</td><td></td></tr><tr><td>Imaging PAM</td><td>Walz</td><td>IMAGING-PAM M-Series</td><td>There are several suitable models depending on the broader use.</td></tr><tr><td>Microscope+ 40x objective</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>DM1000</td><td>Other companies also produce suitable microscopes.</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td></td><td></td><td>Free download from website</td></tr><tr><td>Plant RNA extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>74903</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyser</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>Needs an additional computer</td></tr></tbody></table>

analysis of arabidopsis thaliana growth behavior in different light qualities

Bitki biyologlar sık sık onların seçilmiş türler büyüme davranışlarını gözlemlemek gerekir. Bu amaçla, bitkiler farklı kurulumları altında çalışmalar yapılabilir hangi miktar ve kalite olarak tercihen değişken sabit çevre ve istikrarlı ışık koşullarında, gerekir. Bu gereksinimleri iklimsel Odalar floresan ışıklar aksine-için farklı dalga boylarında ayarlanabilir ışık yayan diyot (LED) ışıklar featuring tarafından karşılanmaktadır. LED vardır enerji tasarrufu ve sık sık diğer ışık kaynakları ile ilgili bir sorun oluşturan hemen hemen hiçbir ısıda bile ışık yoğunluklarını, yayarlar. Sunulan Protokolü değişken LED ışıkları ile donatılmış hem de büyüme fenotipleri derinlik analizi için çeşitli yaklaşımlar açıklayan bir iklimsel odası programı konusunda adım adım yönergeler sağlar. Bağlı olarak deneysel set-up büyüyen bitkilerin çeşitli özellikleri gözlenen ve analiz. Burada taze ağırlık, yaprak alanı, fotosentetik etkinlik ve stomatal yoğunluğunu belirlemek nasıl açıklar. Biz sırayla güvenilir veri elde etmek ve bu kişilerin yeterli sayıda istatistiksel değerlendirme için kullanmak için zorunludur geçerli sonuçlara göstermek. Çözümleme sonuçlarını bu tür için çok az sayıda bitki yüksek istatistiksel hataları alarak ve sonuç olarak daha az net Yorumlar verilerin içinde.

Gözlem ve analiz bitki büyüme ve özellikle fenotipleri mutant bitkilerden istikrarlı ve tekrarlanabilir çevresel koşullara güveniyor. Bunlar iklim odasında sağlanabilir. Işık miktarı ve özellikle kalite eleştirel hangi LED ışıklar tarafından sağlanan bu çalışmada istihdam ışık kaynağı bağlıdır.
Şekil 1 LED panelleri ile donatılmış bir iklimsel odası bir örneği gösterilir. Şekil 1A nerede tüm iklim ve ışık koşulları ayarlanabilir kontrol panelinin bir ekran gösterir. 24 saat içinde yirmi farklı zaman dilimlerini ayarlayabilirsiniz. Örneğin, uzun bir günün koşulları 16 ışık/8 h karanlık ile programlanmıştır. Bu odayı bitki büyüme dört farklı ışık ayarları, aynı çevre koşullarında tam olarak okudu hangi ayrı ayrı programlanabilir dört düzeyi özellikleri. Üst düzey sol teknik olarak mümkün olduğu kadar güneş ışığı taklit eden bir spektral çıkış için ayarlanmışsa, üst sağ düzeyi temsil kırmızı yüksek (660 nm) ve mavi ışık (440 nm) az olan beyaz ışık (3 K). Sol alt düzeyine yükseltilmiş mavi ışık ve ağırlıklı olarak kırmızı ışık doğru alt seviyeye ayarlandı. Şekil 1B LED (orta Masası) genel bir bakış ve ilgili zoom-ins (dış küçük paneller) olarak farklı ayarlar gösterilmektedir. Işık nitelikleri farkı kolayca göz tarafından görülebilir.
Dahili bir Spektrometre sürekli ölçer, izler ve spektral çıkış ayarlar. Şekil 2 güneş ışığı taklit etmek için ayarlanan üst sol düzeyindeki 1.1, spektrum gösterir. Standart floresan ampul için karşılaştırıldığında UV ve mavi ışık çok daha yüksek7bölümüdür.
Ekim tasvir sonra şekil 3 ' te A. thaliana örneği tüm dört koşulları 10, 13 ve 17 gün, sırasıyla, bitkiler. Tüm bitkiler aynı mesafede kamera üçayağa monte ederek çekildi. Ölçek çubuğu 1 cm temsil eder. 10 gün sonra boyutu veya rengi pek farkı ayırt edilebilir, ama 17 gün sonra kırmızı ışık altında daha hızlı bir büyüme açıktır. Bu görsel analiz yanı sıra, birçok fizyolojik analizleri yapıldı.
Şekil 4 hangi örneğin fotosentetik kapasiteyi inceliyor PAM ölçümlerin farklı adımlar izlenir. Şekil 4A bir ekran görüntüsü canlı video, hangi bitki odak haline getirmek için ayardır ölçümlerin en iyi kalite için gösterilir. Bütün bitki üzerinde odaklanmak yerine, bir de analiz etmek için tek bir sayfa seçebilirsiniz. Gerçek ölçüm başlamadan geçerli floresan verim Ft dark-adapted bir bitkinin şekil 4B gösterir. Bu durumda, ilgi (AOIs) beş dairesel alanları seçilmiştir. Her AOI yanında kırmızı kutuya sayıları doğrudan bir tablo şeklinde de kaydedilebilmesi için sayısal sonuç verir. Fotosentetik parametreleri Fo ölçüsü başlatmak ayarlamak Fm gerekir. Ft bir ekran görüntüsü-den sonra iş bu rakam 4 ctasvir edilir. Şimdi belgili tanımlık düğme "Fo, Fm" artık etkin değil unutmayın. Yeni bir ölçü başlatmak için "Yeni kayıt" önceki normalleştirme silmek için tıklandığında gerekiyor. Son olarak, şekil 4 d doyurarak hafif darbe ("SAT-darbe") verdikten sonra etkili PSII kuantum verimi Y(II) gösterir. Örnek veri miktar şekil 5' te gösterilen. 200 µM/cm2/s1 (şekil 5A) güneş ışığı altında yetiştirilen bitkileri Ekim, 12, 21 ve 28 gün sırasıyla analiz edildi. Bizim veri PSII verim yaprakları 12 gün üç hafta boyunca yetişen bitkilerden daha yüksek olduğunu göstermektedir. 28 ile 12 gün arasında fark hala önemlidir ama p-değeri yüksektir. Şekil 4B', farklı ışık nitelikleri üzerinden iki hafta boyunca yetişen bitkilerden PSII verimleri karşılaştırıldı. İlginçtir, mavi ışık yüksek bir kısmını içeren ışık altında kalıcı büyüme PSII bir önemli ölçüde daha fazla verim için yol açar. Benzer bir etki için zenginleştirilmiş kırmızı ışık altında yetiştirilen bitkiler gözlendi, ancak artış biraz düşüktü.
Farklı ışık nitelikleri etkisi stoma bantlı geliştirme14' e gösterildi. Bu nedenle, stomatal yoğunluğu araştırılmıştır. Şekil 6 yaprak pigment çıkarma sonra nasıl göründüğünü gösterir. Tek epidermal hücrelerin de ayırt edici olabilir ve stoma kolayca sayılabilir. Bu şekilde, bireysel stoma bantlı bir yıldız işareti ile gösterilir. Farklı ışık ayarları bitkilerden stomatal yoğunluğu hakkında ayrıntılı veriler9başka bir yerde bulunabilir.
Görsel denetleme (şekil 3) yanı sıra taze ağırlık iyi bir ölçü büyüme ilerleme sağlar. Bu örnekte Ekim sonra 8, 10 ve 12 gün sonra sırasıyla, "güneş"ışığı altında yetiştirilen bitkilerin yapraklarından tartıldı. Bu verilerin istatistiksel değerlendirme Şekil 7' de görülebilir. Beklendiği gibi taze ağırlığı zamanla artar.
Taze ağırlık yanı sıra büyüme için iyi bir ölçü yaprak alandır. Burada, bitki geliştirme (şekil 8A) Ekim 10, 13 ve 17 gün gelen izledi. En az altı bireysel bitkiler güvenilir istatistiksel veri elde etmek için düzenli olarak değerlendirildi. Yüksek örnek boyutu önemini göstermek için iki ve altı bitkileri, sırasıyla, analiz üzerinden ortalama değerinin yüzde hatası hesaplanmıştır (şekil 8B). Yani ortalama değeri ile ilgili olarak standart sapma yüzdesi belirlenmiştir. Bir küçük örnek boyutu durumunda hata 5-%10 daha yüksek bir örnek boyutu söz konusu olduğunda daha yüksek olduğu çok açıktır. Değerlendirilen bitkiler sayısını artırarak, hata, hangi veri çok daha net yorumu yapar en aza indirilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig1.jpg"> Şekil 1: farklı ışık nitelikleri LED'ler tarafından sağlanmaktadır. A) ekran LED odasının Denetim Masası'ndan. Gün uzunluğu 16 h (sağ üst) için küme ve ışık şiddeti 200 µmol cm-2 s-1için ayarlanır. Işık kalitesi her dört düzeyde farklıdır: 1.1 temsil eden bir spektrum ışığına teknik olarak mümkün benzer olarak, 1.2 temsil eden kırmızı ve mavi dalga boylarında (RB) ışık oranı yüksek, 2.1 mavi (B), 2.2 temsil ağırlıklı olarak kırmızı ağırlıklı olarak ayarla ışık (R). B) orta Masası tüm düzeyleri; özetini gösterir Dış kapı aynası içinde daha yüksek zoom bireysel düzeyleri göster. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig2.jpg"> Şekil 2: dalga boyu spektrum simüle güneş ışığı ayarlar arasýndan seçim yapýn. 1.1 düzeyinde yerleştirildi dahili Spektrometre LED odasında bir ekran görüntüsü gösterilir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig3.jpg"> Şekil 3: bitki bir hafta içinde gelişme. 10, 13 ve 17 DAS tüm dört ışık koşullarından temsilcisi A. thaliana bitkiler. Bitkiler bir tripod üzerinde bir dijital refleks kamera ile çekildi. Ölçek çubuğu tüm resimler için 1 cm temsil eder. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig4.jpg"> Şekil 4: Ekran görüntüleri temsilcisi adımları A. thaliana bitkilerin PAM ölçümlerin. A) nerede görüntü odak ayarlanabilir "canlı video" görünümden ekran görüntüsü. B) geçerli Floresans verim Ft daha önce herhangi bir ışık darbeleri uygulanması. C) geçerli Floresans verim Ft Fo/Fm. ayarladıktan sonra D) etkileyen PSII kuantum verimi doyurarak ışık nabız ayarladıktan sonra. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig5.jpg"> Şekil 5: grafik gösterimini etkileyen PSII kuantum verimi (YII). A) verilerden sonra Ekim 12, 21 ve 28 gün bitkiler ve PAM analize tabi yetiştirilen küçük 200 µmol/cm2/s1 simüle güneş ışığı altında ("güneş ışığı") istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Beş bitkiler ve günde beş AOIs ortalama değerleri gösterilmiştir. Bir yıldız işareti gösterir bir p-değeri ile önemli bir fark < gün 12 ve iki yıldız belirtmek çok önemli farklılıklar bir p-değeri ile karşılaştırıldığında 0,05 < 0,02 göre Öğrenci t-testi. B) zenginleştirilmiş 200 µmol/cm2 /s1 altında simüle güneş ışığı (SL), mavi yetiştirilen bitkiler (B) veya kırmızı (K) gelen verileri ışık, sırasıyla, istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Beş bitkiler ve günde beş AOIs ortalama değerleri gösterilmiştir. Önemli farklılıklar "güneş ışığı" göre hesaplanmıştır
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig6.jpg"> Şekil 6: stoma bantlı bir A. thaliana yaprak abaxial kenarındaki temsili resim. Yaprakları yukarıda açıklandığı gibi hazırlanmış ve görsel olarak bir ışık mikroskobunda DIC ayarları 40 X büyütme en analiz edildi. Stoma bantlı koşul başına en az 4 yaprak görünür bölgede dikkate alınır. Resmi mikroskop tubus bağlı bir dijital fotoğraf makinesi ile çekilmiş. Stoma bantlı mm² başına ölçek çubuğu yardımı ile hesaplanır. Yıldız tek stoma gösterir. Ölçek çubuğu 200 µm. temsil eden <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig7.jpg"> Şekil 7: grafik olarak gösterilmesi, yetiştirilen A. thaliana bitkilerden taze ağırlık simule güneş ışığı/200 µmol/cm2/s1. Rozet yaprakları bitkilerden sekiz, on ve on iki gün sonra Ekim kesilmiş. Mg günde altı bitkilerden ortalama değerleri tasvir edilmektedir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig8.jpg"> Şekil 8: A. thaliana yaprak alanı farklı ışık koşulları altında yetişen bitkilerden istatistiksel değerlendirilmesi. A) A. thaliana 10, 13 ve 17 gün boyunca yetişen yaprak alandan grafik olarak ImageJ ve veri n ile belirlenen = 6 bitkiler istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Her durum tüm altı rozet yaprak alanından özetlenebilir ve altı ortalama değerlerini elde etmek için ayrılmıştır. Bu değer ile standart sapma hesaplanır ve bu hata çubukları tarafından temsil edilir. B) yaprak alanı grafik olarak ImageJ ve her iki n gelen verileri ile belirlenen 2 veya n = = 6 bitkiler, sırasıyla, A. paneli için açıklandığı gibi istatistiksel analiz edildi O zaman hata ortalama değer yüzdesi olarak hesaplanır ve grafik olarak tasvir. Yeşil çubuklarını göster yüzde hata çözümlemesi n = 6, Mavi çubuklar n = 2 bitkiler. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities at JoVE.com

Arabidopsis thaliana Büyüme Davranışının Farklı Işık Kalitelerinde Analizi | Biyoloji | Video

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Burada, bitki büyüme davranış ve özellikle fenotipleri tekrarlanabilir bir şekilde eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Değişken ve aynı zaman istikrarlı ışık koşulları sağlamak için nasıl gösterir. Uygun analizleri yeterli örnek numaraları ve geçerli istatistiksel değerlendirme bağlıdır.

Farklı ışık nitelikleri Arabidopsis thaliana büyüme davranış analizi

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

analysis-arabidopsis-thaliana-growth-behavior-different-light

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant Biology

Plant Responses to the Environment

SCIENTISTS IN ACTION

18.8K Görüntüleme.  Ludwig-Maximilians-Universität. Burada, bitki büyüme davranış ve özellikle fenotipleri tekrarlanabilir bir şekilde eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Değişken ve aynı zaman istikrarlı ışık koşulları sağlamak için nasıl gösterir. Uygun analizleri yeterli örnek numaraları ve geçerli istatistiksel değerlendirme bağlıdır.

Video: Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Using Changes in Leaf Transmission to Investigate Chloroplast Movement in Arabidopsis thaliana

Chloroplast movement in leaves has been shown to help minimize photoinhibition and increase growth under certain conditions. Much can be learned about chloroplast movement by studying the chloroplast positioning in leaves using e.g., confocal fluorescence microscopy, but access to this type of microscopy is limited. This protocol describes a method that uses the changes in leaf transmission as a proxy for chloroplast movement. If chloroplasts are spread out in order to maximize light interception, the transmission will be low. If chloroplasts move towards the anticlinal cell walls to avoid light, the transmission will be higher. This protocol describes how to use a straightforward, home-built instrument to expose leaves to different blue light intensities and quantify the dynamic changes in leaf transmission. This approach allows researchers to quantitatively describe chloroplast movement in different species and mutants, study the effects of chemicals and environmental factors on it, or screen for novel mutants e.g., to identify missing components in the process that leads from light perception to the movement of chloroplasts.

Using Changes in Leaf Transmission to Investigate Chloroplast Movement in Arabidopsis thaliana

Many plant species change the positioning of chloroplasts to optimize light absorption. This protocol describes how to use a straightforward, home-built instrument to investigate chloroplast movement in Arabidopsis thaliana leaves using changes in the transmission of light through a leaf as a proxy.

Arabidopsis thaliana'daki Kloroplast Hareketini Araştırmak için Yaprak İletiminde Değişiklikleri Kullanma

Chloroplast movement in leaves has been shown to help minimize photoinhibition and increase growth under certain conditions. Much can be learned about ...

Çevre

Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental transitions in plants. Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) is the first F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)-based biosensor that allows monitoring of cellular GA levels in vivo. By measuring a fluorescence emission ratio of nuclear localized-GPS1 (nlsGPS1), spatiotemporal mapping of endogenously and exogenously supplied GA gradients in different tissue types is feasible at a cellular scale. This protocol will describe how to image nlsGPS1 emission ratios in three example experiments: steady-state, before-and-after exogenous gibberellin A4 (GA4) treatments, and over a treatment time-course. We also provide methods to analyze nlsGPS1 emission ratios using both Fiji and a commercial three-dimensional (3-D) micrograph visualization and analysis software and explain the limitations and likely pitfalls of using nlsGPS1 to quantify gibberellin levels.

Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) is the first F&#246;rster resonance energy transfer-based biosensor for measuring the cellular levels of gibberellin phytohormones with a high spatiotemporal resolution. This protocol reports on the method to visualize and quantify cellular gibberellin levels using the genetically encoded nlsGPS1 biosensor in Arabidopsis hypocotyls and root tips.

NlsGPS1 Förster rezonans enerji kullanarak görüntülenmesi hücresel Giberellin düzeyleri (FRET) biyoalgılayıcı aktarma

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental ...

Gelişim Biyolojisi

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Biyoloji

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through nanoindentations with an atomic force microscope (AFM) coupled with an optical inverted fluorescence microscope. The method consists of applying controlled forces to the sample while measuring its deformation, allowing quantifying parameters such as the apparent Young's modulus of cell walls at subcellular resolutions. It requires a careful mechanical immobilization of the sample and correct selection of indenters and indentation depths. Although it can be used only in external tissues, this method allows characterizing mechanical changes in plant cell walls during development and enables the correlation of these microscopic changes with the growth of an entire organ.

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

The atomic force microscopy indentation protocol offers the possibility to dissect the role of the physical properties of the cell wall of a particular cell of a tissue or organ during normal or constrained growth (i.e., under water deficit).

Canlı Arabidopsis Köklerinin Epidermal Hücrelerinin Fiziksel Özelliklerini İncelemek için Atomik Kuvvet Mikroskobu

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

Yaprak Reflektasyonu ve Klorofil Floresan Analizlerinin Eşzamanlı Ölçümleri ile Fotosentetik Davranışların Değerlendirilmesi

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...

Biyomühendislik

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure the strength of immune activation in Arabidopsis thaliana following treatment with elicitor molecules. Presented first is a method for capturing the rapidly-induced and dynamic oxidative burst, which can be monitored using a luminol-based assay. Presented second is a method describing how to measure immune-induced inhibition of seedling growth. These protocols are fast and reliable, do not require specialized training or equipment, and are widely used to understand the genetic basis of plant immunity.

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

This paper describes two methods for quantifying defense responses in Arabidopsis thaliana following exposure to immune elicitors: the transient oxidative burst, and the inhibition of seedling growth.

Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

Arabidopsis Kök Gravitropic Müdahale Yüksek çözünürlüklü Zaman lapsed Resim Toplama Masaüstü Tarayıcılar kullanma

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.

Hücre Bölünmesi ve Genişleme Kinematik Analizi: Büyüme ve Örnekleme Gelişim Bölgeleri Hücresel Temeli Quantifying<em&gt; Zea mays</em&gt; Yapraklar

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called thigmomorphogenesis. In past decades, several signaling components have been identified and reported for being involved in the mechanotransduction (e.g., calcium ion binding proteins and jasmonic acid biosynthesis enzymes). However, the relatively slow pace of research in the study of force signaling or thigmomorphogenesis is largely attributed to two reasons: the requirement for laborious human hand-manipulated touch induction of thigmomorphogenesis and the force strength errors associated with people&#8217;s hand-touch. To enhance the efficiency of external force loading on a plant organism, an automatic touch-force loading machine was built. This robotic arm-driven hair brush touches provide a labor-saving and easily repeatable touch-force simulation, unlimited rounds of touch repetition and adjustable touch strength. This hair touch-force loading machine can be used for both large scale screening of touch-force signaling mutants and the phenomics study of plant thigmomorphogenesis. In addition, touch materials such as human hair, can be replaced with other natural materials like animal hair, silk threads and cotton fibers. The automated moving arms on the machine may be equipped with water sprinkling nozzles and air blowers to mimic the natural forces of rain drops and wind, respectively. By using this automatic hair touch-force loading machine in combination with the hand-performed cotton swab touching, we have investigated the touch response of two force signaling mutants, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) and MKK2 plants. The phenomes of the touch-force loaded wild type plants and two mutants were evaluated statistically. They have exhibited significant differences in touch response.

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A gentle touch-force loading machine is built from human hair brushes, robotic arms and a controller. The hair brushes are driven by robotic arms installed on the machine and move periodically to apply touch-force on plants. The strength of machine-driven hair touches is comparable to that of manually applied touches.

Bir model tesisi Arabidopsis thaliana Thigmomorphogenesis çalışması Için bir işgücü tasarrufu ve tekrarlanabilen dokunma-Force sinyalizasyon mutant ekran Protokolü

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

Farklı ışık nitelikleri Arabidopsis thaliana büyüme davranış analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler