F.S. riconosce sostegno da Rhenac Green Tec AG attraverso le parti di questo studio. J.S. e B.B. ha ricevuto finanziamenti dalla DFG (SFB TR175).

Questo protocollo contiene alcuni esempi di come analizzare il comportamento di crescita delle piante di a. thaliana .
1. preparazione
<ol><li>Prima di iniziare, assicurarsi un attento piano su quante piante saranno necessari per fare un'analisi statistica attendibile degli esperimenti e poi preparano la quantità appropriata di pentole. Nota: Attendere sempre la possibilità che alcuni semi non potrebbero germinare.</li>
	<li>Utilizzare una camera climatica con diversi livelli di LED programmabili individualmente per confrontare la crescita delle piante nelle stesse condizioni ambientali generali (materiali tavolo).</li>
</ol>2. pianta crescita e set-up delle luci a LED
<ol><li>Preparare il numero appropriato (a seconda delle diverse condizioni e/o mutanti per essere analizzati) di vasi di cm 6 x 7 con terreno e piantare un seme singolo in ognuna di esse. Nota: In questo caso, sono stati seminati 36 piante per condizioni.</li>
	<li>Vernalizzare per due giorni a 4 ° C.</li>
	<li>Impostare l'umidità relativa dell'aria di 65% e alla temperatura di 22 ° C/16 ° C per un giorno di 16 h / h 8 ciclo notte. Regolare la luce di tutti i livelli per un'intensità di 200 µM/cm2/s1. Fare questo inserendo i rispettivi valori in un programma tramite il touch screen nella parte anteriore della camera climatica. Per confrontare i quattro diverse qualità di luce è possibile impostare i LED per i seguenti parametri come previsto nella tabella 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Identifyier</td>
			<td>395 nm [%]</td>
			<td>440 nm [%]</td>
			<td>3 K [%]</td>
			<td>660 nm [%]</td>
			<td>770 nm [%]</td>
		</tr>
<tr>
<td>"luce solare"</td>
			<td>100</td>
			<td>11</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rosso e blu (RB)</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Blu (B)</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>25</td>
			<td>2</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Red (R)</td>
			<td>90</td>
			<td>2</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: composizione di intensità di luce emessa dai LED
<ol start="4"><li>Monitorare lo spettro d'emissione continuamente, ad esempio utilizzando uno spettrometro calibrato incorporato.</li>
	<li>Disporre le piante in camera climatica su diversi livelli e tenerli coperti con un top trasparente fino a ben sviluppati cotiledoni sono visibili. Assicurarsi che le piante sono sufficientemente innaffiate.</li>
	<li>Monitor e documento piante dall'occhio e fotograficamente come spesso come appropriato, a seconda di quanto velocemente le piante crescono nelle condizioni selezionate, ad esempio ogni due giorni. Assicurarsi di utilizzare un treppiede per la macchina fotografica per garantire l'uguale distanza tra fotocamera e oggetti per tutte le immagini e quindi abilitare i confronti. Utilizzare una barra di scala quando appropriato. Nota: Il termine DAS (giorni dopo la semina) si riferisce alla effettiva piantando i semi tra cui vernalizzazione.</li>
</ol>3. determinazione del rendimento PSII
<ol><li>Utilizzare un fluorimetro impulso-modulato. Impostare la testa di macchina fotografica a una distanza adeguata dalla pianta affinché il rosone completo può essere visto sulla finestra live.</li>
	<li>All'avvio del software viene visualizzata una finestra di "selezionare l'unità". Barrare la casella "MINI" e poi "ok". Scegliere colore "blu" nella finestra a comparsa successiva. Fare clic su "ok". Nota: La fluorescenza di impulso-modulato misura la luce si accende automaticamente. Sul monitor, la finestra immagine viene visualizzata con il parametro di fluorescenza Ft. Una pianta posta sotto la fotocamera ora può essere visto come un'immagine arancia.</li>
	<li>Per mettere a fuoco l'immagine e/o scegliere regioni specifiche della pianta, passare a Live Video spuntando la casella "video live" e ruotare l'anello di regolazione della lente dell'obiettivo. Chiudere la finestra LIVE Video facendo clic sulla casella di uscita in alto a destra.</li>
	<li>Per misurare i parametri fotosintetici, definire un'area di interesse (AOI). Utilizzare l'impostazione predefinita per questo, che è un cerchio che appare automaticamente al centro dello schermo. La casella rossa al lato di esso rappresenta il valore medio di Ft di tutti i pixel all'interno l'AOI. Definire l'AOI appropriato scegliendo dalla casella AOI al pannello di destra, dove sono disponibili diverse forme. Fare clic su "Aggiungi" nella scheda AOI e posizionare il cerchio all'interno dell'area di foglia. Ripetere cinque volte per anta.</li>
	<li>Mantenere le impostazioni (scheda a destra) presso i valori predefiniti forniti dal produttore (tabella 2).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Misura luce</td>
			<td>Int.</td>
			<td>Frequenza</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Atto. Luce</td>
			<td>Int.</td>
			<td>Larghezza</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Correzioni di immagine</td>
			<td>MINI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Trasformazione di immagini</td>
			<td>Batteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>16.7V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Guadagno</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Smorzamento</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Impulso di Sat</td>
			<td>Int.</td>
			<td>No</td>
			<td>Intervallo s</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>Induzione lenta</td>
			<td>Ritardo s</td>
			<td>Orologio s</td>
			<td>Durata s</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>40</td>
			<td>20</td>
			<td>315</td>
		</tr>
<tr>
<td>Absortivity</td>
			<td>Guadagno rosso</td>
			<td>Intensità di rosso</td>
			<td>Intensità NIR</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>340</td>
			<td>25</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Visualizzazione</td>
			<td>Colore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PS Limite</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Inh. Rif. AOI</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Fattore di FM (barrare)</td>
			<td>1.030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: impostazioni predefinite per le misurazioni di PAM come fornito dal produttore.
<ol start="6"><li>Applicare un lampo di luce saturante per eseguire una misurazione di parametri fotosintetici da fluorescente tempra analisi (impulso di saturazione). Prima di ciò, è necessario determinare i coefficienti di tempra misurando la resa massima e minima di fluorescenza di una pianta scuro-adattata. A tal fine, è necessario collocare la pianta al buio (ad es. in un cassetto o scatola scuro) per qualche minuto. Poi mettere la pianta sotto la testa della fotocamera, selezionare le caselle misura e ML (misura la luce), nella riga sotto l'immagine scegliere "Fv/Fm" facendo segnare nel cerchio e scegliere Fo, Fm nella parte inferiore dello schermo. Nota: Fo/Fm rappresenta il rendimento PSII di una pianta scuro-adattato. Così, è il valore a cui la misurazione dopo l'applicazione di luce è normalizzata. La misurazione di Fo/Fm corrente rimarrà fino a quando viene attivato il nuovo Record. Tutti i F e Fm' valori determinati da impulsi di saturazione sono legati alla Fo/Fm e dissetante parametri sono calcolati di conseguenza.</li>
	<li>Trovare questi risultati nella scheda report e selezionare tutte le caselle sul lato destro che sono rilevanti per l'esperimento (ad es. Y (II), qP, qN, ecc.).</li>
	<li>Esportare i risultati in un software di analisi ad es. Di Excel facendo clic sul pulsante Esporta in alto a sinistra e salvare con nome di file appropriato. Generare almeno cinque AOIs per anta e misurare molte foglie della stessa pianta (non dimenticate di poco scuro adattare l'impianto dopo ogni misurazione), così come parecchie piante da una condizione, che può quindi essere valutati statisticamente.</li>
	<li>Per l'analisi statistica generare valori medi e deviazioni standard da tutti AOIs e almeno tre impianti indipendenti per tutti tempo punti/condizioni ed eseguire t-test di uno studente per valutare se i dati sono significativi12. I dati vengono valutati come significativamente differenti quando i valori di p sono inferiori a 0,05.</li>
</ol>4. la determinazione della densità di stomi
<ol><li>Raccogliere tre foglie rosetta completamente espansi da tre piante individuali per condizione in etanolo al 70% in una capsula di Petri vetro e per estrarre la clorofilla. Incubare in questo solvente durante la notte a temperatura ambiente o conservare a 4 ° C.</li>
	<li>Per lo sdoganamento completo da pigmenti, Incubare in soluzione di idrato di cloralio (cloralio idrato: acqua: glicerolo = 8: 2: 1 w/v/w) fino a quando le foglie appaiono completamente bianchi.</li>
	<li>Prendere immagini di microscopia (DIC) della superficie abbagliai interferenza differenziale a 40 ingrandimenti. Contare gli stomi nel campo di visibilità ed estrapolare con l'aiuto della barra della scala di stomi a mm ². Ripetere che questa procedura per almeno 4 foglie per condizioni. Effettuare analisi statistiche, calcolando il valore medio per tutte le foglie di una circostanza e da questo calcolare l'errore medio.</li>
</ol>5. determinazione del peso fresco
<ol><li>Rimuovere tutte le foglie tra cui piccioli da rosette da sei piante per condizione con una lama di rasoio. Pesare immediatamente tutte le foglie e fatti salvi i dati di analisi statistiche come descritto sopra.</li>
</ol>6. determinazione della superficie fogliare Rosetta
<ol><li>Usa le immagini da otto piante per condizione di analizzare graficamente la superficie fogliare. Combinare le immagini per una condizione in una singola immagine e salvare come JPEG o *. TIFF.</li>
	<li>Scaricare il software appropriato (materiali tavolo). Nota: È, ovviamente, possibile applicare qualsiasi altro programma in grado di svolgere questo compito.</li>
	<li>Aprire un file di immagine. Scegliere lo strumento "selezione a mano libera". Circondare tra cui piccioli di una rosetta di foglie. Fai clic su "Analyze - misure set" e controllare "Area", "Min & Max valore di grigio," "Densità integrata" e "Valore di grigio medio." Scegliere decimale appropriato luoghi, è meglio due o tre e fare clic su "ok".</li>
	<li>Per ottenere mm2 pixel invece di utilizzare il comando "set scala". Applicare lo strumento di selezione Straight-line per effettuare una selezione di riga che corrisponde a una distanza nota, ad esempio il diametro di congedo che è facile da calcolare dalla barra della scala delle immagini, quindi aprire la finestra di dialogo Imposta scala e immettere la distanza definita e unità di unità di misura. Poi tornare a "analizzare" e fare clic su "misura".</li>
	<li>Appare una nuova finestra dal titolo "risultati" che contiene i dati rilevanti per la Rosetta corrente. Ripetere questa procedura con tutte le piante nell'immagine e inizializzare le misurazioni di zona per ogni nuovo impianto con Ctrl + M. Nota: Per le più piccole piante con foglie non sovrapposte la "bacchetta" può essere utilizzata per rendere il processo più facile e veloce. Appena foglie iniziano coprendo vicenda, questo strumento non dà risultati affidabili.</li>
	<li>In alternativa, tagliare tutte le foglie e posizionarli in modo che un'immagine panoramica può essere preso e quindi utilizzare lo strumento bacchetta. Prendere in considerazione che, quando si utilizza questo metodo, sono necessari più piante.</li>
	<li>Scegliere "File"-"Salva come" nella finestra dei risultati e generare un nome di file appropriato e una posizione nella directory computer. Il file verrà automaticamente salvato in formato Excel.</li>
</ol>7. preparazione di RNA
<ol><li>Raccogliere tre campioni da dieci piante individuali per ogni condizione. Estrarre RNA totale usando un impianto kit di estrazione di RNA secondo le istruzioni del produttore. Determinare la concentrazione, purezza e integrità RNA utilizzando un bioanalyzer. RNA può essere utilizzato da per esempio RNASeq13per la a valle applicazioni quali l'analisi di espressione di gene o qRT-PCR.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>An, G., Watson, B. D., Chiang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Tobacco,+Tomato,+Potato,+and+Arabidopsis+thaliana+Using+a+Binary+Ti+Vector+System.">Transformation of Tobacco, Tomato, Potato, and Arabidopsis thaliana Using a Binary Ti Vector System.</a> Plant Physiology. 81 (1), 301-305 (1986).</li><li>Schiml, S., Fauser, F., Puchta, H., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromosome and Genomic Engineering in Plants: Methods and Protocols. , 111-122 (2016).</li><li>Rivero, L., Sanchez-Serrano, J. J., Salinas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arabidopsis Protocols. , 3-25 (2014).</li><li>Ubbens, J. R., Stavness, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Plant+Phenomics:+A+Deep+Learning+Platform+for+Complex+Plant+Phenotyping+Tasks.">Deep Plant Phenomics: A Deep Learning Platform for Complex Plant Phenotyping Tasks.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1190), (2017).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Suppression+of+Growth+by+Blue+Light:+OCCURRENCE,+TIME+COURSE,+AND+GENERAL+CHARACTERISTICS.">Rapid Suppression of Growth by Blue Light: OCCURRENCE, TIME COURSE, AND GENERAL CHARACTERISTICS.</a> Plant Physiology. 67 (3), 584-590 (1981).</li><li>Seiler, F., Soll, J., B&#246;lter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Phenotypical+and+Molecular+Analyses+of+Arabidopsis+Grown+under+Fluorescent+and+LED+Light.">Comparative Phenotypical and Molecular Analyses of Arabidopsis Grown under Fluorescent and LED Light.</a> Plants. 6 (2), 24 (2017).</li><li>Janda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+stress+response+in+Arabidopsis+thaliana,+Nicotiana+benthamiana,+Glycine+max,+Solanum+tuberosum+and+Brassica+napus+cultivated+under+polychromatic+LEDs.">Growth and stress response in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Glycine max, Solanum tuberosum and Brassica napus cultivated under polychromatic LEDs.</a> Plant Methods. 11 (1), 31 (2015).</li><li>Olle, M., Vir&#353;ile, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+light-emitting+diode+lighting+on+greenhouse+plant+growth+and+quality.">The effects of light-emitting diode lighting on greenhouse plant growth and quality.</a> Agricultural and food science. 22 (2), 12 (2013).</li><li>Lin, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+red,+blue,+and+white+light-emitting+diodes+on+the+growth,+development,+and+edible+quality+of+hydroponically+grown+lettuce+(Lactuca+sativa+L.+var.+capitata).">The effects of red, blue, and white light-emitting diodes on the growth, development, and edible quality of hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa L. var. capitata).</a> Scientia Horticulturae. 150, 86-91 (2013).</li><li>Castronuovo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+spectrum+affects+growth+and+gas+exchange+of+common+dandelion+and+purple+coneflower+seedlings.">Light spectrum affects growth and gas exchange of common dandelion and purple coneflower seedlings.</a> International Journal of Plant Biology. , (2016).</li><li>Student, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+PROBABLE+ERROR+OF+A+MEAN.">THE PROBABLE ERROR OF A MEAN.</a> Biometrika. 6 (1), 1-25 (1908).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+Genetics.+RNA-Seq.">Essentials of Genetics. RNA-Seq.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Klermund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LLM-Domain+B-GATA+Transcription+Factors+Promote+Stomatal+Development+Downstream+of+Light+Signaling+Pathways+in+Arabidopsis+thaliana+Hypocotyls.">LLM-Domain B-GATA Transcription Factors Promote Stomatal Development Downstream of Light Signaling Pathways in Arabidopsis thaliana Hypocotyls.</a> The Plant Cell. 28 (3), 646-660 (2016).</li><li>Annunziata, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+back+to+nature:+a+reality+check+for+experiments+in+controlled+environments.">Getting back to nature: a reality check for experiments in controlled environments.</a> J Exp Bot. 68 (16), 4463-4477 (2017).</li><li>Palus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japan's+Massive+Indoor+Farm+Produces+10,000+Heads+of+Fresh+Lettuce+Every+Day.">Japan's Massive Indoor Farm Produces 10,000 Heads of Fresh Lettuce Every Day.</a> Smithonian.com. , (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il primo passo nello studio della crescita delle piante è la creazione della camera climatica secondo le condizioni desiderate. Questo è fatto facilmente digitando tutte le variabili nella maschera di programma del rispettivo software (Figura 1A). A questo punto, possono essere implementate molte modifiche modificando il regime di luce e/o temperatura. Assicurarsi di monitorare costantemente la temperatura, l'umidità e condizioni di luce (Figura 2) per impedire guasto tecnico rovinare l'esperimento. Questo è un punto critico per ottenere risultati riproducibili. Anche se questo set-up offre molte variabili e può essere regolato in modo flessibile, ha i suoi limiti. Le luci a LED attualmente disponibili non possono simulare la luce del sole al cento per cento e le condizioni climatiche all'interno di una camera climatica mai completamente possono riflettere quello che sta succedendo fuori15.
Rispetto all'ampiamente usato luci fluorescenti lampadine LED sono più versatili, hanno bisogno di meno energia e non mostrare praticamente nessuna radiazione di calore. Questi vantaggi hanno portato la grande industria di agricoltura coperta per dotare di camere climatiche e serre con LED16. Considerando i grandi successi riportati in questo campo, la tecnica LED troverà sicuramente molte altre applicazioni.
Quando si osserva il fenotipo e soprattutto per determinare la superficie della foglia che è importante tener conto che nelle piante più vecchie foglie sovrapposizione (Figura 3). Così, valutazione grafica di rosette tutto tende ad essere impreciso. In tal caso, è molto più preciso di tagliare tutte le foglie e andare da lì.
La valutazione del comportamento di sviluppo e soprattutto le differenze di crescita e sviluppo in condizioni diverse dipendono da un campione di dimensioni sufficienti. In questo studio, almeno sei impianti sono stati utilizzati per la determinazione del rendimento per esempio fotosintetici (Figura 5), peso fresco (Figura 7), e area fogliare (Figura 8A) ma 30 singoli semi sono stati piantati all'inizio dello studio per garantire che in primo luogo, sufficienti semi germinano, e in secondo luogo, può essere fatta una scelta delle piante "tipiche". Anche all'interno della popolazione stessa, cioè piante in vaso singolo nel vassoio stesso sotto le esatte condizioni stesse, ha mostrato diversi fenotipi. Questo è poi naturalmente riflette la deviazione standard durante l'analisi statistica, ma l'interpretazione dei dati è in genere più affidabile quando si osservano piccoli errori statistici (Figura 8B).
Misurazione delle performance fotosintetici da PAM (Figura 4, Figura 5) può essere fatto per diversi parametri. In questo caso, la messa a fuoco era sul rendimento PSII y (II) come un esempio, ma è possibile anche determinare ad esempio estinzione non fotochimica, il rendimento quantico di dissipazione di energia regolamentati e non regolamentati o remissione luce. Importante qui è di scegliere almeno cinque AOIs per anta uniformemente distribuito su tutta la superficie della foglia e quindi misurare almeno sei foglie dalle piante differenti. Lo svantaggio di questo metodo è che non venga rilevato alcun effetto sulla PSI; a tale scopo, sono necessario diverse apparecchiature.

Arabidopsis thaliana è stato l'organismo modello per i ricercatori di pianta dell'era molecolare per più di due decenni. Diverse caratteristiche rendono questo piccolo rappresentante della famiglia del Brassica un candidato ideale per studi genetici e molecolari: ha un genoma relativamente piccolo con solo cinque cromosomi (rispetto ad es. Nicotiana tabacum con 24 cromosomi) e il suo genoma è stato completamente sequenziato nel 20001. A. thaliana può essere facilmente geneticamente modificato da Agrobacterium infezione2 ed è favorevole alla anche i più recenti strumenti genetici quali CRISPR/Cas3. Anche se piccolo, il ciclo di crescita è abbastanza veloce per fare esperimenti biochimici fattibili dove è necessaria una maggiore quantità di materiale. Le piante crescono su piastre di agar o sul suolo e possono anche essere coltivate come colture liquide4. Arabidopsis possono essere coltivate in armadi climaticamente controllati, ad esempio da Percival, in camere climatiche o in serre. Per essere in grado di confrontare il comportamento di sviluppo e analizzare fenotipi mutanti è fondamentale per fornire riproducibile e al tempo stesso flessibile crescita condizioni5. A seconda del problema scientifico che deve essere affrontato uno potrebbe essere necessario diverse temperature e condizioni di luce costante, diverse intensità di luce o diverse qualità di luce alla stessa temperatura. Luce è un parametro molto critico nella crescita delle piante e la sua influenza è spesso studiata in diversi approcci6. Per garantire la riproducibilità e comparabilità dei dati ottenuti è cruciale assicurare una produzione stabile e applica lo stesso tipo di sorgenti luminose.
Le fonti di luce usuale in serre e camere climatiche sono costituiti da vapori di sodio o lampade fluorescenti, che promuovono la crescita soddisfacente delle piante ma hanno diversi svantaggi. In primo luogo, invecchiano nel tempo che cambia lo spettro d'emissione non solo in intensità ma di qualità (proprie osservazioni). Tuttavia, solo l'intensità è solitamente controllata continuamente affinché un cambiamento nella qualità della luce potrebbe passare inosservato ma ancora avere effetti significativi. In secondo luogo, entrambi i tipi di lampade generano calore a più alta intensità di luce, che a sua volta ha una profonda influenza fisiologica sulla crescita delle piante e potrebbero mascherare qualsiasi effetto luce-dipendente. In terzo luogo, lo spettro d'emissione di queste fonti di luce è invariabile e abbastanza a differenza della luce naturale del sole7. Tutti questi inconvenienti sono stati superati in caso di LED)8,9,10,11. Hanno una lunga durata con a malapena qualsiasi cambiamento in emissione, non producono calore di scarto anche ad altissima intensità di luce e sono molto flessibile riguardo il loro spettro d'emissione.
Qui illustriamo come impostare una camera climatica con luci a LED separati per rosso, blu e luce bianca e seguire diversi parametri di crescita delle piante nel corso del tempo. Misuriamo il peso fresco, area fogliare, densità di stomi e rendimento fotosintetico. Allo stesso tempo, dimostriamo l'importanza di istituire correttamente valutazioni statistiche.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Climatic chamber equipped with LED panels</td>
			<td>Rhenac Green Tec AG</td>
			<td></td>
			<td>These chambers are custom made.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer&#160;</td>
			<td>OceanOptics</td>
			<td>USB-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging PAM</td>
			<td>Walz</td>
			<td>IMAGING-PAM M-Series</td>
			<td>There are several suitable models depending on the broader use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope+ 40x objective</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DM1000</td>
			<td>Other companies also produce suitable microscopes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download from website</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Needs an additional computer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of arabidopsis thaliana growth behavior in different light qualities

I biologi pianta spesso bisogno di osservare il comportamento di crescita della loro specie selezionate. A tal fine, le piante hanno bisogno di costante condizioni ambientali e stabile luce, che sono preferibilmente variabile in qualità e quantità, in modo che possono essere condotti studi in diverse configurazioni. Questi requisiti sono soddisfatti di camere climatiche con luce che emettono luci di diodi (LED), che possono – in contrasto con luci fluorescenti – essere impostate su diverse lunghezze d'onda. I LED sono energia conservazione ed non emettono praticamente alcun calore anche a intensità di luce, che spesso costituisce un problema con altre fonti di luce. Il protocollo presentato fornisce una guida passo passo di come programmare una camera climatica dotata di luci a LED variabile, nonché descrivere diversi approcci per un'analisi approfondita dei fenotipi di crescita. A seconda del set-up sperimentale varie caratteristiche di piante possono essere osservate e analizzate. Qui descriviamo come determinare peso fresco, area fogliare, l'attività fotosintetica e densità stomatica. Dimostriamo che, al fine di ottenere dati affidabili e trarre conclusioni valide che è obbligatorio l'uso di un numero sufficiente di individui per la valutazione statistica. Prendendo troppo poche piante per questo tipo di risultati di analisi in alti errori statistici e di conseguenza meno chiare interpretazioni dei dati.

Osservazione e analisi della crescita delle piante e soprattutto fenotipi da piante mutanti si basano sulle condizioni ambientali stabili e riproducibili. Questi possono essere forniti in camere climatiche. Quantità di luce e soprattutto la qualità dipende criticamente la sorgente luminosa autonomo, che in questo studio è stata fornita da luci a LED.
Figura 1 Mostra un esempio di una camera attrezzata con pannelli a LED. Figura 1A Mostra una schermata del pannello di controllo dove tutte le condizioni climatiche e di luce possono essere regolate. Entro 24 h può essere impostate venti lassi di tempo diversi. In questo esempio, condizioni di giorno lungo con luce/8 16h scuro sono state programmate. Questa camera dispone di quattro livelli che possono essere programmati separatamente in modo che la crescita delle piante a quattro diverse impostazioni di luce può essere studiato sotto esattamente le stesse condizioni ambientali. Superiore sinistro del livello è impostata su un output spettrale che imita la luce del sole per quanto tecnicamente possibile, il superiore rappresenta proprio livello elevato rosso (660 nm) e luce blu (440 nm) con ridotta luce bianca (3K). Livello inferiore sinistro era impostato di elevata luce blu e il livello inferiore principalmente luce rossa. Figura 1B illustra i LED presso le diverse impostazioni come una panoramica (pannello centrale) e i rispettivi zoom-in (piccoli pannelli esterni). La differenza nella qualità della luce può essere facilmente visto dall'occhio.
Uno spettrometro inbuilt costantemente misure, monitora e regola l'uscita spettrale. La figura 2 Mostra lo spettro dal livello superiore sinistro 1.1, che è stato impostato per simulare la luce del sole. Rispetto ad una normale lampadina fluorescente la porzione di UV e luce blu è molto maggiore di7.
Nella Figura 3 un esempio di a. thaliana piante da tutti i giorni quattro condizioni 10, 13 e 17, rispettivamente, dopo la semina è raffigurata. Tutti gli impianti sono stati fotografati dalla stessa distanza da montare la fotocamera su un treppiede. La barra della scala rappresenta 1 cm. Dopo 10 giorni, non molta differenza nella dimensione o il colore può essere discernuto, ma dopo 17 giorni è evidente una crescita più veloce sotto la luce rossa. Oltre a questa analisi visiva, sono state effettuate diverse analisi fisiologiche.
Figura 4 segue le varie fasi delle misurazioni di PAM, che permette di analizzare ad esempio la capacità fotosintetica. In Figura 4A uno screenshot del video dal vivo è indicato, che è l'impostazione per portare la pianta a fuoco per garantire una qualità ottimale delle misurazioni. Invece di concentrarsi su tutta la pianta, si può anche scegliere una singola foglia di analizzare. Figura 4B dimostra l'attuale rendimento fluorescente Ft di una pianta scuro-adattata prima la misura reale è stata avviata. In questo caso, sono stati scelti cinque aree circolari di interesse (AOI). I numeri nelle caselle di rosso accanto ogni AOI dà direttamente il risultato numerico, che possa anche essere salvato sotto forma di una tabella. Per avviare una misurazione dei parametri fotosintetici Fo, Fm è necessario impostare. Uno screenshot di Ft dopo aver fatto questo è raffigurato in Figura 4. Si noti che ora il pulsante "Fo, Fm" non è più attivo. Per avviare una nuova misurazione, "Nuovo Record" deve essere cliccato per cancellare la normalizzazione precedente. Infine, la Figura 4 Mostra l'effettivo rendimento quantico PSII y (II) dopo aver dato un impulso di luce saturante ("SAT-Pulse"). Quantificazione dei dati esemplari è illustrato nella Figura 5. Piante coltivate sotto la luce solare a 200 µM/cm2/s1 (Figura 5A) sono state analizzate 12, 21 e 28 giorni dopo la semina, rispettivamente. I nostri dati dimostrano che la resa PSII è significativamente in foglie da piante coltivate per tre settimane rispetto per 12 giorni. La differenza tra 28 e 12 giorni è ancora significativa, ma il p-valore è più alto. In Figura 4B, PSII rendimenti da piante coltivate per due settimane da diverse qualità di luce sono stati confrontati. Interessante, una crescita permanente sotto la luce contenente un'alta parte della luce blu conduce ad un rendimento significativamente maggiore del PSII. Un simile effetto è stato osservato per le piante coltivate sotto luce rossa arricchita, ma l'aumento è stato di poco inferiore.
Diverse qualità di luce sono stati indicati per effetto stomi sviluppo14. Di conseguenza, è stata studiata la densità stomatica. Figura 6 di seguito viene illustrato l'aspetto di una foglia dopo l'estrazione del pigmento. Cellule epidermiche singole possono essere ben distinte, e stoma può essere facilmente contato. Nella figura, gli stomi individuali sono indicati da un asterisco. Dati dettagliati circa la densità stomatica delle piante dalle diverse impostazioni di luce possono essere trovati altrove9.
Oltre a ispezione visiva (Figura 3) il peso fresco fornisce una buona misura del progresso di crescita. In questo esempio foglie da piante coltivate sotto la "luce solare" dopo 8, 10 e 12 giorni dopo la semina, rispettivamente, sono stati pesati. Valutazione statistica di questi dati può essere visto nella Figura 7. Come previsto, il peso fresco aumenta con il tempo.
Oltre di peso fresco, la zona di foglia è una buona misura per la crescita. Qui, lo sviluppo della pianta è stato seguito da 10, 13 e 17 giorni dopo la semina (Figura 8A). Almeno sei diverse piante sono stati valutati ordinariamente per ottenere dati statistici affidabili. Per dimostrare l'importanza di un campione di elevate dimensioni, è stato calcolato l'errore percentuale del valore medio, analizzando due e sei piante, rispettivamente, (Figura 8B). Ciò significa che è stata determinata la percentuale della deviazione standard per quanto riguarda il valore medio. È molto chiaro che, in caso di un campione di piccole dimensioni, l'errore è 5-10% superiore nel caso di una maggiore dimensione del campione. Aumentando il numero di piante che vengono valutate, l'errore può essere minimizzato, che rende l'interpretazione dei dati molto più chiari.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig1.jpg"> Figura 1: diverse qualità di luce sono forniti da LED. A) Screenshot dal pannello di controllo della camera del LED. Lunghezza del giorno è fissata a 16 h (in alto a destra) e l'intensità della luce è impostata su 200 µmol cm-2 s-1. La qualità della luce è diversa su tutti i quattro livelli: 1.1 rappresenta uno spettro simile alla luce del sole come tecnicamente possibili, 1.2 rappresenta un'alta percentuale di rosso e blu lunghezze d'onda (RB) luce, 2.1 è prevalentemente impostata a blu (B), 2,2 rappresenta principalmente rosso luce (R). B) il pannello centrale mostra una panoramica di tutti i livelli; i pannelli esterni mostrano i singoli livelli in un alto livello di zoom. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig2.jpg"> Figura 2: spettro di lunghezza d'onda da impostazioni di luce solare simulata. Viene mostrato uno screenshot dello spettrometro insito nella camera di LED, che è stato posizionato a livello 1.1. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig3.jpg"> Figura 3: impianto di sviluppo più di una settimana. Rappresentante a. thaliana piante da tutte le quattro condizioni di luce da 10, 13 e 17 DAS. Piante sono stati fotografati con una macchina fotografica reflex digitale su un treppiede. Barra della scala rappresenta 1 cm per tutte le immagini. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig4.jpg"> Figura 4: Screenshots da passaggi rappresentativi delle misurazioni di PAM di piante di a. thaliana . A) Screenshot dalla visualizzazione "Live video" dove può essere regolato il fuoco immagine. B) rendimento corrente fluorescenza Ft prima dell'applicazione di eventuali impulsi di luce. C) rendimento corrente fluorescenza Ft dopo l'impostazione di FM Fo /. D) rendimento quantico che effettuano PSII dopo aver impostato un impulso di luce saturante. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig5.jpg"> Figura 5: rappresentazione grafica del rendimento quantico che effettuano PSII (YII). A) dati da 12, 21 e 28 giorni dopo la semina di piante e coltivati sotto 200 µmol/cm2/s1 sotto luce solare simulata ("luce solare") sottoposti ad analisi di PAM sono stati valutati statisticamente. Vengono mostrati i valori medi di cinque piante e cinque AOIs al giorno. Un asterisco indica una differenza significativa con un valore p < 0,05 rispetto al giorno 12 e due asterischi indicano differenze molto significative con un p-value < 0.02 secondo t-test degli studenti. B) dati da piante coltivate a 200 µmol/cm 2/s1 sotto luce solare simulata (SL), arricchita blue (B) o rosso (R) luce, rispettivamente, sono stati valutati statisticamente. Vengono mostrati i valori medi di cinque piante e cinque AOIs al giorno. Differenze significative sono state calcolate rispetto a "luce del sole."
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig6.jpg"> Figura 6: immagine rappresentativa di stomi a fianco di una foglia di a. thaliana abbagliai. Foglie preparato come descritto sopra e sono stati analizzati visivamente sotto un microscopio chiaro con impostazioni di DIC a 40 ingrandimenti. Gli stomi sono contati nell'area visibile di almeno 4 foglie per condizione. La foto è stata scattata con una videocamera digitale collegata al microscopio tubus. Il numero di stomi per mm ² è calcolato con l'aiuto della barra della scala. Stelle indicano una stomia singola. La barra della scala rappresenta 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig7.jpg"> Figura 7: rappresentazione grafica di peso fresco da a. thaliana piante coltivate presso simulato del sole/200 µmol/cm2/s1. Rosetta di foglie sono stati tagliati da piante, otto, dieci e dodici giorni dopo la semina. Sono rappresentati i valori medi in mg da sei piante al giorno. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig8.jpg"> Figura 8: Valutazione statistica della superficie fogliare di a. thaliana da piante coltivate in condizioni di luce diverse. A) area fogliare da a. thaliana coltivata per 10, 13 e 17 giorni è stata determinata graficamente con ImageJ e dati da n = 6 piante sono stati valutati statisticamente. L'area di foglia da tutte le sei rosette da ogni condizione è stata riassunta e divisa da sei per ottenere il valore medio. Con questo valore, è stata calcolata la deviazione standard, e questo è rappresentato da barre di errore. B) area fogliare graficamente è stata determinata con ImageJ e dati da entrambi n = 2 o n = 6 stabilimenti, rispettivamente, sono stati analizzati statisticamente come descritto per il pannello A. Quindi l'errore in percentuale del valore medio è stato calcolato e rappresentato graficamente. Barre verdi indicano la percentuale di errore dall'analisi di n = 6, blu bar da n = 2 piante. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Analisi del comportamento di crescita dell'Arabidopsis thaliana in diverse qualità di luce | Biologia | Video

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Qui, presentiamo un protocollo per lo studio di comportamento di sviluppo di pianta e soprattutto fenotipi in maniera riproducibile. Vi mostriamo come fornire variabile e allo stesso tempo luce stabile condizione. Adeguata analisi dipendono dal numero di campione sufficiente e valide valutazioni statistiche.

Analisi del comportamento di crescita di Arabidopsis thaliana in diverse qualità di luce

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

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18.8K Views.  Ludwig-Maximilians-Universität. Qui, presentiamo un protocollo per lo studio di comportamento di sviluppo di pianta e soprattutto fenotipi in maniera riproducibile. Vi mostriamo come fornire variabile e allo stesso tempo luce stabile condizione. Adeguata analisi dipendono dal numero di campione sufficiente e valide valutazioni statistiche.

Video: Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Applicazione della Luce cured resina adesiva dentale per montaggio elettrodi o sonde Microdialisi negli esperimenti cronica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

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Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

Isolamento di protoplasti da tessuti di 14-giorni di età piantine di Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Indagare tessuti e risposte fitocromo organo-specifici utilizzando FACS-Cell-assistita di tipo profili specifici di espressione in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video Bioinformatica Analisi delle embrionali umane crescita Colony cellule staminali

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floreale-dip Trasformazione Arabidopsis thaliana Per esaminare PTSO2:: β-glucuronidasi Reporter espressione genica

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

Arabidopsis thaliana Profiling Glycerolipid Polar Cromatografia su strato sottile (TLC) Accoppiato con cromatografia gas-liquido (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semi

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culture sospensione cellulare

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of dormant seeds or that of nondormant seeds irradiated by a far red (FR) light pulse. In order to further gain insight into the molecular genetic mechanisms underlying the germination repressive activity exerted by the endosperm, a &#34;seed coat bedding&#34; assay (SCBA) was devised. The SCBA is a dissection procedure physically separating seed coats and embryos from seeds, which allows monitoring the growth of embryos on an underlying layer of seed coats. Remarkably, the SCBA reconstitutes the germination repressive activities of the seed coat in the context of seed dormancy and FR-dependent control of seed germination. Since the SCBA allows the combinatorial use of dormant, nondormant and genetically modified seed coat and embryonic materials, the genetic pathways controlling germination and specifically operating in the endosperm and embryo can be dissected. Here we detail the procedure to assemble a SCBA.

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

We present the procedure to assemble a seed coat bedding assay (SCBA) from Arabidopsis thaliana seeds. The SCBA was shown to be a powerful tool to explore genetically and in vitro how the endosperm controls seed germination in dormant seeds and in response to light cues. The SCBA is in principle applicable under any situation where the endosperm is suspected to influence embryonic growth.

Un cappotto Seed Bedding Assay per esplorare geneticamente<em&gt; In Vitro</em&gt; Come la Germinazione Controlli endosperma del seme in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Colorazione istochimica di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cellula secondaria Elementi da parete

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

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