Name: fetal mouse cardiovascular imaging using a high-frequency ultrasound (30/45mhz) system
Uploaded: 2018-05-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System at JoVE.com

Wir danken den Tierphysiologie Kern, Abteilung für Molekulare Medizin an der UCLA für die Bereitstellung von technischer Unterstützung und freien Zugang zu der Vevo 2100-Ultraschall-biomikroskopie (UBM)-System. Diese Studie wurde unterstützt durch das NIH/Child Health Research Center (5K12HD034610/K12), die UCLA-Kinder Discovery Institute und heute und Morgen Kinder Fonds und David Geffen School of Medicine Research Innovation Award, M. Touma.

Die University of California, Los Angeles, Animal Care und Use Committee genehmigt alle Verfahren, die in diesem Protokoll angezeigt. Die Experimente wurden im Rahmen einer laufenden Studie unter aktiven Tier Protokolle, genehmigt durch die institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der University of California, Los Angeles, Kalifornien, USA. Tierische Handhabung und Pflege folgten die Standards des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
1. Vorbereitung des Hochfrequenz-Ultraschalls-Imaging-System
<ol><li>Aktivieren Sie die Ultraschall-imaging-System und die Physiologie-Überwachungseinheit.</li>
	<li>Schließen Sie den 30/45 MHz-Schallkopf.</li>
	<li>Legen Sie die entsprechenden Scan-Kopf auf der Halterung in der Nähe der bildgebungsplattform.</li>
	<li>Die Kardiale Messprogramm Option.</li>
	<li>Ort der Ultraschall gel kopfüber in seinem vor-Erwärmung Container setzen auf 37 ° C.</li>
	<li>Bestätigen Sie entsprechenden Schlauchsystem für die Anästhesie zu und überprüfen Sie die Ebenen aus Sauerstoff und Isofluran.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die imaging-Plattform und den Arbeitsbereich.</li>
	<li>Legen Sie die Wärme der imaging Plattform weiterhin eine Konstante Körpertemperatur und Herzfrequenz der Dämme.</li>
</ol>2. Schwangere Maus Vorbereitung
<ol><li>Legen Sie die schwangere Maus (C57/BL6)-Damm in der Anästhesie-Induktion-Kammer.</li>
	<li>Induzieren Sie Anästhesie mittels inhalativer Isofluran (Isofluran 2 % - 3 %), gemischt mit 100 % Sauerstoff (100 % O2) bei einer Durchflussrate von 200 mL/min in der Induktion Kammer kontinuierlich geliefert.</li>
	<li>Das sedierten Tier auf die imaging Plattform in Rückenlage zu übertragen.</li>
	<li>Bieten Sie stationäre Sedierung mit einer Gesichtsmaske, verbunden mit der Anästhesie Schlauch System liefert Isofluran (1,0-1,5 %) mit 100 % O2 bei 200 mL/min gemischt. Achtung: Steuern Sie das Austreten von betäubende Gas mithilfe einer Lüftungsanlage ausgestattet mit einen Kohlefilter, Kanister Satz enthält.</li>
	<li>Kleben Sie die Glieder sanft zu den eingebetteten elektrokardiographischen Elektroden nach Anwendung der Elektroden-Gel zu erreichen, ständige Überwachung der mütterlichen Herz- und Atemwegserkrankungen Raten.</li>
	<li>Der Pegel der Isofluran weiterhin eine durchschnittliche Herzfrequenz (450 + /-50 Schläge/min (Bpm)).</li>
	<li>Aufrechterhaltung der Körpertemperatur innerhalb eines Bereichs von 37,0 ° C +/-0,5 ° C. Überwachen Sie die Körpertemperatur und die Herzfrequenz auf die Physiologie-Controller-Einheit angezeigt wird.</li>
	<li>Dokumentieren Sie die Vitalfunktionen der sediert Maus alle 15 min in den bildgebenden Verfahren.</li>
	<li>Bewertung des Anästhesie durch die Auswertung der Maus Haltung, Herzfrequenz und Reaktion bis zu den Zehen drückt.</li>
	<li>Bewerben Sie ophthalmologische Balsam (1 Tropfen in jedes Auge), um Augentrockenheit und Hornhaut Schaden zu verhindern.</li>
	<li>Entfernen Sie das Fell aus der Mitte des Brusthöhe an den unteren Extremitäten mit einer Enthaarungscreme Ultraschall Dämpfung zu minimieren. Creme 1-1,5 min nach Anwendung durch den Wechsel von nassen und trockenen Gaze wischt, um Schäden an der Haut zu entfernen.</li>
</ol>(3) Embryo Identifikation
<ol><li>Ertasten der Bauchwand sanft zum Suchen der Föten und verteile sie.</li>
	<li>Kommentieren Sie jeder Embryo auf dem Damm Bauch und mit einem Marker definieren Sie ihre anterior-posterioren und dorsal-Ventral Orientierungen.</li>
	<li>Verwenden Sie den Muttermund sediert dam als Wahrzeichen. Beschriften Sie die Föten auf die Links und rechts uterine Hörner als L1, L2, L 3, etc. (linke Seite) und R1, R2, R3, usw. (rechts), bzw. (Abbildung 1A). Achtung: Vermeiden Sie die Verbreitung der Feten mit Nachdruck. 1-2 Föten in jedem Wurf überschneiden sich mit den anderen, um ihre Positionierung und bildgebenden unzuverlässig. Diese Föten von der Analyse auszuschließen.</li>
</ol>(4) fetalen Herzens Visualisierung und Annotation
<ol><li>Tragen Sie vorgewärmten Ultraschallgel auf den Bauch auf und verteilen Sie es sorgfältig durch, um Blasenbildung zu vermeiden. Fügen Sie zusätzliche Menge des Gels auf dem Gebiet der Bildgebung Scan.</li>
	<li>Die Ultraschallsonde auf der mechanischen Halterung und mobilisieren Sie allmählich in Richtung der Haut die dicken Gelschicht Kontakt während der Suche nach das schlagende Herz Scan B-Modus (Abbildung 1) zu.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Scan B Modus um 2-D-Bilder zu erhalten. Verwenden Sie die Blase als Wahrzeichen zu identifizieren den ersten Fötus positioniert in der rechten oder der linken Uterus Horn und markieren Sie ihn als R1 oder L1, beziehungsweise.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Rechte und linke Ausrichtung des einzelnen Fötus in Echtzeit durch Verschieben der bildgebungsplattform in der Horizontalebene. Scannen von Kopf Schwanz um die Schnauze, die Gliedmaßen und der Wirbelsäule als Landmarken (Abbildung 1 b, 1 Video) zu beschriften.</li>
	<li>Visualisieren Sie das schlagende Herz zu und mit Anmerkungen versehen Sie, der linke Ventrikel (LV) und den rechten Ventrikel (RV). Verwendung Doppler Farbmodus zur Optimierung der Herz-Visualisierung (Abbildung 1 C-G, Videos 1 - 2).</li>
	<li>Klicken Sie auf Scan B Modus um ein Parasternal kurze Achse-Ansicht zu erhalten haben die LV und RV in ihrer maximalen Durchmesser in der Mitte des Datenrahmens Erwerb angezeigt. Starten Sie live Imaging (Abbildung 1 b-C).</li>
	<li>Ändern Sie die Ausrichtung der Maus im Hinblick auf die Scan-Flugzeuge, um einen längs vierkammer-Blick (Abbildung 1) zu erhalten. Ermitteln Sie zuerst die restlichen Strukturen des Herzens wie Atrien, interventricular Septum und Links und rechts Abfluss Traktate. Als nächstes müssen Sie die ventrikulären und Vorhofflimmern Kammern in ihrer maximalen Durchmesser angezeigt. Starten Sie Bildaufnahme.</li>
	<li>Letzten Endes die suboptimale, schiefe Bilder ausschließen. Klicken Sie auf Cini Daueraufzeichnung "Cineloops" erhalten für ein Minimum von 10 s, dann speichern Sie die aufgezeichneten Bilder.</li>
</ol>5. Bewertung der fetalen Herzfrequenz und linksventrikulären Funktion
<ol><li>Klicken Sie der Scan M-Modus um kardiale Bilder aus vier-Kammer-Flugzeuge (Video 3) zu erhalten.</li>
	<li>Zeigen Sie die Liste der Aufnahmen für die Analyse, sobald die Bilder aller Embryonen abgeschlossen sind.</li>
	<li>Letzten Endes die suboptimale, schiefe Bilder ausschließen.</li>
	<li>Klicken Sie auf Analyse , Wandstärke Messen und die Links/rechts-ventrikuläre Innendurchmesser bei Diastole (LVID, d; RVID, d) und Systole (LVID, s; RVID, s), wie in Abbildung 2dargestellt.</li>
	<li>Bestimmen Sie die durchschnittliche fetale Herzfrequenz durch das Spielen jedes M-Modus aufgezeichnet Ermittlung und Berechnung der Messung einen Flow-Zyklus, der folgende Ablauf Zyklus (den Abstand zwischen benachbarten Gipfeln).</li>
	<li>Führen Sie mehrere Messungen (mindestens 5 pro Ablaufverfolgung) um die durchschnittliche Herzfrequenz (Abbildung 2) zu erhalten.</li>
	<li>Messen Sie die zeitlichen Veränderungen zwischen linken ventricular diastolische Innendurchmesser (d LVID) und linken ventricular Innendurchmesser am Ende Systole (LVID, s) in dem Herzzyklus. Berechnen Sie gebrochene Verkürzung Prozentsatz (FS %) wie folgt: FS % = [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d] X100.</li>
	<li>Führen Sie mehrere Messungen (mindestens 5 pro Ablaufverfolgung) um die FS % Durchschnittswerte zu erhalten.</li>
</ol>6. Bewertung der kardiopulmonalen Strömungsparameter
<ol><li>Passen Sie dem Sektor in einem Winkel des Erwerbs weniger als 60o. Klicken Sie Doppler gepulsten Doppler Messungen aus dem 2-D vier-Kammer-Bildgebung Flugzeug mit einer 45-MHz-Schallkopf durchführen.<ol>
<li>Zunächst visualisieren Sie die Verzweigung der Lungenarterie, die richtige Ausflusstrakt zu identifizieren. Als nächstes klicken Sie auf gepulsten Doppler um den Strömungsverlauf durch die Lungen- und Aortenklappen (Abb. 3A, Video 4) zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erhalten Sie pulmonale Durchflussmessungen von gepulsten Doppler Ablaufverfolgung, einschließlich Gipfel systolischen Geschwindigkeit (PkV), Beschleunigung der Zeit (AT) und Auswurf Zeit (ET).</li>
	<li>Führen Sie mehrere Messungen (mindestens 5 pro Ablaufverfolgung) um durchschnittlichen Messwerte zu erhalten, wie in Abbildung 3A (rechts) dargestellt.</li>
	<li>Berechnen die AT / ET Ratio für jeden Abfluss Ventil als Indikator für den Abfluss Traktate Durchgängigkeit und Durchblutung.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Mitral- und Aortenklappe Strömungsmuster von apikalen vier Kammer 2-D-Ansichten mit gepulsten Doppler zu erhalten. Ermitteln Sie zuerst die linken Vorhofflimmern und linke ventrikulären Kammern. Als nächstes legen Sie die gepulsten Doppler Probenmenge für die Aufnahme der Mitral-Zufluss Doppler Muster und Mess Frühe Diastolische Geschwindigkeit (E) und atrial Kontraktion Geschwindigkeit (A) (Abb. 3 b)24,25.</li>
	<li>Doppler-Beispiel Lautstärke um die Aorta Doppler Jet Muster zu erhalten. Verwenden Sie die Aorten-Doppler Jet tracing um Beschleunigung (AT) und Auswurf Zeit (ET) zu messen, wie in Abbildung 3 b (rechts) gezeigt (Video 5)</li>
</ol>7. Bewertung der Feto-plazentaren Achse
<ol><li>Verwenden Sie den Doppler Farbscan uterine Arterie und Feto-plazentaren Kreislauf Baum visualisieren, indem mit den 45 MHz-Schallkopf (Abb. 4A).</li>
	<li>Identifizieren Sie die Nabelschnur Schiffe (zwei Arterien und eine Vene) im Segment der Nabelschnur, Intra-Fruchtwasser kurz nachdem die Schnur aus dem fetalen Bauch verlässt.</li>
	<li>Ort gepulsten Doppler Probenvolumen Nabelarterie Strömungsmuster (Abb. 4A) zu erhalten.</li>
	<li>Vaskuläre Peak Strömungsparameter einschließlich der Beschleunigung der Zeit (Zeitpunkt), Auswurf (ET) zu messen, und peak Strömungsgeschwindigkeit am Ende Systole (PkV, s) mit gepulsten Doppler scanning Datensatz (Abbildung 4 b).</li>
	<li>Erhalten Sie 5 aufeinander folgenden Wellenformen in jedem Gefäß, in das Fehlen von Kindsbewegungen und mütterliche Atembewegungen, zur Messung der durchschnittlichen Geschwindigkeit für jedes Schiff.</li>
	<li>Fahren Sie mit der nächsten Embryo.</li>
</ol>8. Post-Bildgebung Tier Überwachung
<ol><li>Schalten Sie den Isofluran-Container nach Abschluss den imaging-Prozess.</li>
	<li>Überwachung der Körpertemperatur, Atemfrequenz und Herzfrequenz während der Erholungsphase weiter.</li>
	<li>Die Gesichtsmaske und die angeschlossenen Leitungssystem zu entfernen, sobald der Damm spontane Bewegungen beginnt.</li>
	<li>Der dam mit dem entsprechenden Gehäuse und Fortfahren Sie Beobachtung nach institutionellen postoperativ Standardprotokolle.</li>
	<li>Die Zeit, um volle Wiederaufnahme der normalen Aktivität zu dokumentieren.</li>
</ol>9. die Leistungsanforderungen und technische Überlegungen
<ol><li>Begrenzen Sie die Bearbeitungszeit für ~ 8 Feten bis ca. 1 h, die negativen Auswirkungen der verlängerten Anästhesie auf Vitalparameter und physiologische Parameter zu vermeiden.</li>
	<li>Komplette Ausbildung mit 8-10 schwangeren Mäusen, Techniken für Bildmuster Erwerb und Flow Ablaufverfolgung in einem kurzen Zeitrahmen zu optimieren.</li>
</ol>

<ol>
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Kein Interessenkonflikt erklärt.

Herz-Kreislauf-Fehlbildungen und Krankheiten werden von genetischen Faktoren und Umwelteinflüssen19wesentlich beeinflusst. Wir haben bisher einen signifikanten Einfluss der mütterlichen kalorische Restriktion, initiiert während des zweiten Trimesters auf Feto-plazentaren Kreislauf fließen und fetalen Herzfunktion9gezeigt.
Pränatale Hypoxie ist eine weitere gemeinsame Stressfaktor während der fetalen Entwicklung, die Ungeheuer der Feto-plazentaren Physiologie und Herz-Kreislauf-System beeinträchtigen können. Die pränatale Hypoxie Exposition kann tiefer im Zusammenhang mit einer KHK führt zu schlechten Perinatale Anpassung an postnatalen Lebens auswirken. Die abnorme Herzfrequenzen kardiale Indizes in dieser Studie nachgewiesen sind in der Tat wichtige Indikatoren der Herzbelastung und veränderte plazentare Kreislauf Physiologie und somit wesentliche primäre Elemente für die Erkennung der Entwicklungsschäden dar und konsequente hämodynamischen Veränderungen, die in Reaktion auf pränatale hypoxischer Stress führt zu frühen Herzinsuffizienz weiter ausgesprochen werden können. Entgegen den Erwartungen hatte Hypoxie ausgesetzt Föten niedrigere Herzfrequenzen. Dieses Phänomen kann unreife kardiale Selbstregelung Mechanismen im fetalen Mäuse als Reaktion auf Hypoxie bei GD18.5 widerspiegeln. Die genaue Pathogenese bleibt jedoch unbekannt.
Obwohl andere erweiterte bildgebende Verfahren, wie z. B. fetale kardiale MRT ermöglichen live Darstellung der kardialen Strukturen während der Entwicklung20, ist der hämodynamische Status oft durch statische Bilder und langwierige Verfahren verloren. Nicht-invasive Ultraschall-Technologie erlaubt auf der anderen Seite in Vivo dynamische Darstellung, die die Grundlinie Physiologie unterhält. Darüber hinaus kann mit der Verfügbarkeit von hochfrequenten Schallköpfe mit Erhöhung der Auflösung, die Visualisierung des fetalen Herzens in unterschiedlichen Entwicklungsstadien von jedem einzelnen Fötus mehr bei transgenen Mäusen machbar durch die Optimierung der fetalen annotation Methoden. Schließlich sind die Kosten pro Experiment weit weniger mit dieser Methode.
In einem früheren Bericht von Kim GH Et Al.bereitgestellt die Autoren wichtige und neue Erkenntnisse über bildgebende Plan-Optimierung für die Datenerfassung mithilfe von einer vorherigen Generation von Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung System21. Ein weiterer Bericht von Zhou YQ Et Al., etablierte standardisierte Basisberechnungen der fetalen Zirkulation auf physiologischer Ebene mithilfe einer Hochfrequenz-Ultraschall mit Farbe Doppler System22ausgestattet. Daher das Protokoll hier vorgestellten vorher festgelegten Protokolle ergänzt und erweitert, um eine umfassende Methode zu skizzieren, die machbar und praktisch in Echtzeit in einer experimentellen Umgebung ist. Eine erweiterte und hochsensiblen Hochfrequenz-Ultraschall-System wurde in dieser Studie verwendet, die Feto-plazentaren Schaltung als Ganzes gescannt. Das skizzierte Protokoll ist einfache und standardisierte, dieses leistungsstarke System effektiv wie gezeigt durch das erreichen quantifizierbarer Messungen der Hypoxie-Auswirkungen auf den fetalen Kreislauf bei Mäusen bei GD18.5 zu beschäftigen.
Dennoch sollten wir anerkennen wichtige Einschränkungen und Herausforderungen der tödliche kardiale Bildgebung: Erstens die Narkose-Mittel, insbesondere Isofluran, können die physiologische Parameter des Fötus beeinträchtigen. Längerer Anästhesie, Haarausfall und Ultraschall Gel führt zu Unterkühlung, die die Herzfrequenz und hämodynamische Indizes der Damm als auch die Föten beeinflussen können. Derzeit gibt es keine Methode, die Höhe der Anästhetika und deren Auswirkungen auf den Fötus zu bewerten. Um diese Einschränkung zu umgehen, titrieren wir inhalierte Isofluran Ebenen sorgfältig, um entsprechende Sedierung der Dämme, unter Wahrung ihrer basale Herzfrequenz und Vitalfunktionen zu erreichen. Zweitens ist die Visualisierung von Föten, die tief in den Bauch befinden schwierig und suboptimal, führt zum Ausschluss von diesen Föten aus der endgültige Datenanalyse. Der Farbdoppler ermöglicht verbesserte Optimierung von bildgebenden Abschnitte und angemessene Ausrichtung zwischen dem Schallkopf und Blutfluss. Drittens erfordert gleichzeitige Analyse alle Föten des Betreibers Effizienz in eine schnelle und genaue Visualisierung und Bild Erwerb schnell, impliziert die Bedeutung der praktischen Ausbildung.
Wichtige Schritte in dieser Methode müssen schließlich betont werden, einschließlich 1) Vorbereitung des Systems. (2) Erhaltung eine stabile Körpertemperatur und Herzfrequenz für die schwangere Maus. (3) Optimierung des Durchfluss von Isofluran weiterhin Grundlinie physiologischen Zuständen der Embryonen, verlässliche Daten zu erwerben. (4) einheitliche und effiziente Bildakquisition innerhalb der kürzest möglichen Zeit. (5) Gestational Alter, Geschlecht und Tier Sorte sind wichtige Variablen, die die Ergebnisse erheblich beeinträchtigen können. Experimentelle Protokoll sollte daher sorgfältig geplant werden, für diese Variablen zu berücksichtigen, durch die Einbeziehung abgestimmte Kontrollen aus dem gleichen Tier-Stamm in Datenanalyse und Interpretation.
Zusammenfassend ist ein Hochfrequenz-Ultraschall-System eine effektive Methode zur phänotypischen Charakterisierung des fetalen kardiovaskulären Systems in Utero mit experimentellen und wissenschaftlichen Wert und mögliche zukünftige Anwendungen, die möglicherweise zu erreichen beinhalten 1) Verständnis der physiologischen Dynamik während der kardialen Entwicklung. (2) erreichen umfassende phänotypische Analyse von genetischen Modellen von CHDs. 3) Erläuterung der Auswirkungen Feto-plazentaren Zirkulation auf kardiale Kammer Entwicklung, Reifung und Anpassung zu betonen. (4) Durchführung von Ultraschall geführte fetalen Injektion um Toxine, teratogene oder Therapeutika in Zukunft studieren. (6) Umsetzung der Speckle-Ablaufverfolgung und Belastungsanalyse, dass Fähigkeiten, detaillierte regionale myokardiale Funktion der entwickelnden Myokard zu erhalten als Grundlage für zukünftige Studien dienen können.

Angeborene Fehlbildungen des Herzens sind heterogene strukturelle Mängel, die während der frühen kardiale Entwicklung auftreten. Aktuelle technische Fortschritte der betrieblichen Abläufe führten zu signifikanten Verbesserungen in den Überlebensraten von Säuglingen mit CHDs1,2. Lebensqualität ist jedoch oft gefährdeten sekundär zu längeren Krankenhausaufenthalt und Bedürfnisse für chirurgische Reparatur Verfahren1,2,3,4,5in Szene gesetzt. Vorgeburtliche Erkennung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen von CHDs ist entscheidend, um frühe Interventionen, neue Präventionsstrategien durchzuführen und die lebenslange Ergebnisse6,7zu verbessern planen.
Obwohl mehrere genetische und umweltbedingte Faktoren in der Pathogenese der CHDs verwickelt waren, bleibt zur Gründung der Kausalität ein ungedeckter Bedarf zur Verbesserung der diagnostischen, therapeutischen und präventiven Strategien1,8,9 ,10,11,12. Darüber hinaus öffnet untersuchen die Rolle der in Utero Stressfaktoren und epigenetische Modifikatoren neue Schauplätze für künftige Untersuchungen11,12. Das letzte Jahrzehnt erlebte in der Tat schnelle Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation wie Einzel-Nukleotid Polymorphie (SNP) Microarray, ganze Exome Sequenzierung und genomweite Methylierung Studien, deren Nutzung bei der Untersuchung der genetischen Ursachen der komplexen menschlichen Krankheiten, einschließlich CHDs1,8,9,10,11 ebnet den Weg zu identifizieren, neue Mutationen und genetische Varianten, die bislang nicht für ihre Pathogenität in geeigneten Tiermodellen getestet.
Unter die andere Krankheit Modellsystemen ist Maus Tiermodell der Wahl, nicht nur für die Untersuchung von Mechanismen der CHDs während der frühen Cardiogenesis13,14,15,16, sondern auch zu erläutern deren Auswirkungen auf kardiale Kammer Reifung und Funktion am späten Schwangerschaft im pränatalen und perinatalen Stressfaktoren. Durchführung von in-Vivo phänotypischen Charakterisierung eines mutierte Maus fetalen Herzens während der frühen und späten Stadien der Entwicklung, ist daher wichtig zu verstehen, die Rolle dieser genetischen Variationen und Umweltfaktoren auf kardiale Entwicklung und die möglichen zukünftigen Auswirkungen auf Kammer spezifischen Reifung Prozesse bei Mäusen.
Früherkennung und Diagnose von Herzfehlern während der Entwicklung ist entscheidend für interventionelle Planung17,18. Als sichere, einfache, portable und wiederholbare, fetale Sonographie in der Tat die Standard imaging Technik für kardiale Beurteilung in der Klinik geworden. Fetalen Kreislauf Bewertung mittels Doppler-Ultraschall hat in der klinischen Praxis nicht nur für den Nachweis von Herzfehlern, sondern auch, vaskulären Anomalien, Plazenta-Insuffizienz und intrauterine Wachstumsretardierung zu erkennen und zu beurteilen, verbreitet Die fetalen Wohlbefinden als Reaktion auf in Utero Beleidigungen einschließlich Hypoxämie, mütterliche Erkrankung und Drogen Toxizität17,18. Parallel zu seinen Wert bei der Bewertung von menschlichen Fehlern und Krankheiten hat Ultraschall Beurteilung der fetalen Mäuse zunehmende Dienstprogramm in experimentelle Einstellungen19,20,21,22gewonnen, 23. Insbesondere kann fetale Herz-Ultraschall (Echokardiographie) sequentielle in Vivo Visualisierung des Herzens entwickeln. Viele experimentelle Studien haben Ultraschall-Imaging-Technologie verwendet, um fetale Herz-Kreislauf-Entwicklung in fetalen Transgene Mäuse zu beobachten. Doppler-Ultraschall ist besonders nützlich, um die pathophysiologische Parameter, wie die Strömungsmuster im fetalen Kreislauf unter physiologischen Herausforderungen oder Krankheit Bedingungen10,19aufzuklären gewesen. Bei Mensch und Tier kann abnormale Flow oder Sauerstoff Blutversorgung für den Fötus aus verschiedenen Bedingungen führen, die fetalen Umwelt in der Gebärmutter stören und beeinflussen die Fetoplacental Achse, einschließlich der plazentare Auffälligkeiten, mütterliche Hypoxie, Schwangerschafts-Diabetes und pharmazeutisch induzierten vaskulären Zusammenziehung15,22. Daher wird Etablierung standardisiertere Methoden zum Ausführen von Doppler Ultraschall auf fetale Mäuse enorm Zukunftsstudien CHDs stärken durch die Erleichterung der Überwachung fließstrukturen und wichtige hämodynamische Indizes der Herz-Kreislauf-Schaltungen während verschiedenen Entwicklungsstadien kardiale in genetischer Mausmodelle.
Hochfrequenz-Ultraschall ist ein leistungsstarkes Tool zum Messen der Entwicklungs- und physiologische Parameter des Herz-Kreislauf-Systems in Mausmodellen und menschliche Krankheiten18entstanden. Diese Technologie hat in den letzten Jahren weiterentwickelt worden. Wir und andere Forscher haben die Machbarkeit dieses Systems zur Durchführung von Ultrahochfrequenz Ultraschall Studien über die fetalen Maus Herz15,19,20,21,22 gezeigt. ,23. Das System ist ausgestattet mit Doppler Fluss Farbzuordnung und linear-Array-Sensoren, die zweidimensionale, dynamische Bilder bei hoher Frequenz (30 bis 50 MHz) Frameraten zu generieren. Diese Vorteile, im Vergleich zu niederfrequenten Ultraschall-Systeme und die vorherige Generation der Hochfrequenz Ultraschall21,22, bieten die notwendige Empfindlichkeit und Auflösung für eingehende Beurteilung der fetalen Kreislauf System, inklusive umfassende Charakterisierung von Herzen Strukturen, Kammer-Funktion und Fluss-Indizes der fetalen Mäuse in experimentelle Einstellungen. Hier erläutern wir Methoden, um schnelle Beurteilung der Herz-Lungen-Kreislauf und Feto-plazentaren Zirkulation an embryonalen Tag E18.5 in Vivo mit einem Hochfrequenz-System durchführen. Wir entschieden uns für einen 30/45 MHz Wandler, der einer axialen Auflösung von etwa 60 µm und einer lateralen Auflösung von 150 µm bietet. Jedoch kann ein höhere Frequenz-Wandler (40/50 MHz), früher Entwicklungsstadien zu analysieren, indem Sie folgen einen ähnlichen methodischen Ansatz gewählt werden. Die ausgewählten M-Modus ermöglicht die Visualisierung von Gewebe mit hoher zeitlicher Auflösung Ebenen (1.000 Bilder/s) in Bewegung. Zu guter Letzt zeigen wir die Machbarkeit der hohen Ultraschall für detaillierte umfassende phänotypischen Charakterisierung der fetalen Herz-Kreislauf-hämodynamischen Status und Funktion bei Mäusen zu Studienbeginn und in Reaktion auf Stress pränatale Hypoxie.

<table><tbody><tr><td>Vevo 2100</td><td>VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td><td>N/A</td><td>High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA</td></tr><tr><td>inbred mice (c57/BL6)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>N/A</td><td>Inbread wild type mouse strain</td></tr></tbody></table>

fetal mouse cardiovascular imaging using a high-frequency ultrasound (30/45mhz) system

Angeborene Herzfehler (CHDs) sind die häufigste Ursache von Morbidität Kindheit und frühe Sterblichkeit. Vorgeburtliche Erkennung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen von CHDs ist entscheidend für neue präventive und therapeutische Strategien zu erfinden. Mutierte Maus-Modellen sind mächtige Werkzeuge zu entdecken, neue Mechanismen und Umweltstress Modifikatoren, die kardiale Entwicklung und deren mögliche Veränderung im CHDs fahren. Bemühungen um die Kausalität von diesen vermeintlichen Mitwirkende gewesen ist jedoch beschränkt auf histologische und molekularbiologische Untersuchungen in Tierversuchen nicht überleben, in denen die Überwachung die wichtigsten physiologischen und hämodynamischen Parameter oft abwesend. Live-imaging-Technologie ist ein wesentliches Instrument herstellen die Ätiologie der CHDs geworden. Vor allem Ultraschall-Bildgebung kann ohne chirurgisch die Föten pränatal eingesetzt werden so dass Aufrechterhaltung ihrer Grundlinie Physiologie während der Überwachung der Auswirkungen von Umweltbelastungen auf die hämodynamische und strukturellen Aspekte der kardialen Kammer Entwicklung. Hier benutzen wir das Hochfrequenz-Ultraschall (30/45)-System, um das Herz-Kreislauf-System im fetalen Mäuse beim E18.5 in Utero an der Grundlinie und als Reaktion auf pränatale Hypoxie Exposition zu untersuchen. Wir zeigen die Machbarkeit des Systems, kardiale kammergröße, Morphologie, linksventrikulären Funktion, fetale Herzfrequenz und Nabelarterie Fluss Indizes und deren Veränderungen im fetalen Mäuse ausgesetzt systemischen chronischen Hypoxie in Utero in Echtzeit zu messen Zeit.

Statistische Analysen der Herz- und hämodynamische Indizes wurden offline durchgeführt. Die Mittel von 5 aufeinander folgenden Messungen in 3 optimale Bilder wurden berechnet. Die Daten wurden geäußert, da ± SEM Student tbedeuten-Test diente der interfraktionellen Arbeitsgruppe Vergleiche zu schließen. Ein P -Wert des ≤0.05 galt als statistisch signifikant.
Im Anschluss an das oben genannte Protokoll gekennzeichnet wir die Auswirkungen der chronischen Exposition gegenüber pränatale Hypoxie auf die Herz-Kreislauf-Status des fetalen Mäuse am späten Schwangerschaft durch den Erwerb von Real-Time hochfrequente Ultraschall Aufnahmen auf die C57/BL6 zeitlich Schwangere Mäuse an Tag (GD) 18,5.
Nach Gründung der Zuchtgruppen wurde die erfolgreiche Paarung bestätigt. Zeitgesteuerte schwanger Dämme wurden in Käfigen unter einem 12 h hell-dunkel-Regime mit Nahrung und Wasser Ad Libitum bis beibehalten. Bei GD14.5 bekamen die schwangere Mäuse entweder zugunsten der normoxiezustand Gruppe (gehalten in der Luft) oder der Hypoxie-Gruppe (in 10 % FiO2 induzieren systemischer Hypoxie Hypoxie Kammer platziert). Nach der Geburt blieb die Dämme und ihre Welpen bis postnatale 7.Tag (P7) ihre versuchsbedingung zugewiesen.
In insgesamt 6 Dämme wurden in diesen Experimenten untersucht und 42 Feten wurden erfolgreich auf GD18.5 abgebildet. Von diesen wurden 36 Föten gewonnene Daten für die spätere Analyse (Tabelle 1) verwendet. Analyse der fetalen Herzfrequenz bei GD18.5 zeigten, dass hypoxische Föten fetale Bradykardie (niedriger Herzfrequenz) litt und erlebt deutlichen Rückgang der fetalen Herzfunktion Indizes (EF und FS %) (Tabelle 1). Bemerkenswerterweise wurden Spitze Strömungsgeschwindigkeiten (PkVs) der Nabelarterie PkVs bei Hypoxie-exponierten Feten (Abbildung 4 b und Tabelle 1) gesenkt. Darüber hinaus der Nabelarterie Beschleunigung Zeit/Auswurf Zeit (an / ET) Verhältnisse offenbart deutlich niedrigere Werte in der hypoxischen im Vergleich zu den Inklusieve Föten, was darauf hindeutet Nabelschnur vaskulären Strömungswiderstand erhöht. Zustimmend, stieg rechtsventrikuläre Wandstärke bei Hypoxie-exponierten Feten gemessen auf 2-D/M-Modus Bilder (Abbildung 5). Da die RV dominierende Pumpenfunktion während der fetalen Entwicklung, übernimmt während die Plazenta als primären vaskulären Bettes für Sauerstoffanreicherung dient, empfehlen diese Daten gemeinsam erhöhter Strömungswiderstand im Feto-plazentaren Kreislauf Kreislauf führt zu RV Hypertrophie. Wichtig ist, gegenüber Hypoxie ausgesetzt Neugeborene frühen postnatalen Letalität. RV-Versagen und erhöhten Gefäßwiderstand durch chronische Exposition gegenüber pränatale Hypoxie induziert sind potentiell Ursache beitragen. Andere Faktoren wie die Redox-Toxizität infolge Re Sauerstoffversorgung Verletzungen, schlechte Ernährung und mütterliche Krankheit werden nicht ausgeschlossen. Trotzdem noch den genauen zugrunde liegenden Mechanismus der pränatale Hypoxie induzierte kardiale Pathogenese und die frühen Letalität der Föten in zukünftigen Studien festgelegt werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57210/57210fig1.jpg"> Abbildung 1: Fetale Mäuse Annotation und Herz Visualisierung in Utero mit B-Scanmodus und Farbe Doppler Verhör. (A) schematische Darstellung des fetalen Mäuse Kennzeichnung und Beschriftung (L: Links, R: rechts). (B) repräsentatives Bild von der anatomischen Orientierungspunkte: ein Fötus, die Ausrichtung des fetalen Herzens Tag 18,5 von Parasternal kurze Achse Ansicht der linke Ventrikel (LV), rechter Ventrikel (RV) und interventricular Septum (IVS) führen. (C) repräsentatives Bild von Parasternal kurze Achse Blick auf LV und RV mit Farbe Verhör Herz Kammer Visualisierung zu erleichtern. (D) längs vierkammer-Blick auf das LV und RV, verließ Atria (LA) und rechten Herzvorhof (RA) Farbdoppler. (E) längs vierkammer-Blick auf LV und RV, mit Farbe Doppler Verhör, um die Visualisierung von Abfluss Traktaten zu erleichtern: rechter Ventrikel Ausflusstrakt (RVOT), linke Herzkammer Ausflusstrakt (LVOT), Aorta (AO) und rechten Ventrikel Abfluss Darm-Trakt (RVOT). (F) repräsentative Farbe Doppler Verhör des RVOT und PA. (G) repräsentative Farbe Doppler Verhör des LVOT und AO. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57210/57210fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57210/57210fig2.jpg"> Abbildung 2: Beurteilung der fetalen Herzfrequenz und linksventrikulären Funktion. (A) Vertreter M-Modus Ablaufverfolgung aus der langen Achse 4-Kammer-Blick auf GD 18.5 gewonnen. (LV: Links Ventrikel; RV: Rechten Ventrikel; LA: Linker Vorhof; RA: rechter Atrium). (B) Vertreter (als Zeilen) Quantifizierungsmethode ventrikuläre Dimensionen einschließlich Links- und rechtsventrikuläre Innendurchmesser bei Diastole (LVID, d; RVID, d) und Systole (LVID, s; RVID, s), linke und Rechte Ventrikelwand Dicke bei Diastole (LVAW, d; Vaughan Williams, d), Interventricular Septum (IVS), und Schlag zu Schlag Messung des HR werden aus den vier Kammer imaging Flugzeug. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57210/57210fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57210/57210fig3.jpg"> Abbildung 3: Pulsed Wave Doppler Rückverfolgung der fetalen Lungen, Aorten- und Mitralklappe Flow Indizes. (A) repräsentatives Bild der Lungenarterie gepulsten Doppler Ablaufverfolgung (links). Quantifizierungsmethoden (Zeilen) der pulmonalen Fluss Indizes PkV (Peak Velocity), bei (Beschleunigung), ET (Auswurf Zeit) werden angezeigt (rechts) aus der längs-vierkammer-Blick. (B) repräsentatives Bild der Mitral- und Aortenklappe Gepulste Doppler Strömungsmuster (links) und Quantifizierung der Mitralklappe Fluss Indizes E (Frühe Diastolische Geschwindigkeit) und (atrial Kontraktion) und Aorta fließen Indizes um ET und PkV (rechts) gezeigt, von der vierkammer-Abbildungsebene. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57210/57210fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57210/57210fig4v2.jpg"> Abbildung 4: Beurteilung der Feto-plazentaren Zirkulation. (A) Vertreter Bild der Feto-plazentaren Kreislauf Schaltungen mit Farbe Doppler Verhör (oben) und mütterlichen ECG Records (unten). (B) Repräsentatives Bild der gepulsten Doppler Erfassung und Quantifizierung Messungen (Zeilen) der Nabelarterie Fluss Indizes in Hypoxie (oben) und normoxiezustand Kontrolle ausgesetzt fetalen Mäuse (unten). PkV (Peak Velocity), bei (Beschleunigung), ET (Auswurf-Zeit). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57210/57210fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57210/57210fig5.jpg"> Abbildung 5: Bewertung der rechten Ventrikel Wanddicke in Hypoxie behandelt fetalen Mäuse. (A, B) Vertreter M-Modus Ablaufverfolgung von der Längsachse vierkammer-Blick auf GD 18.5 in normoxiezustand und Hypoxie Bedingungen erhalten. LV: Links Ventrikel, RV: rechten Ventrikels, die rechtsventrikuläre Wand. Linien zeigen die quantitative Messungen der RVW Dicke in Systole (s) und Diastole (d). (C) RVW s Quantifizierung zeigt erhöhte RVW Dicke in fetalen Hypoxie-behandelten Mäusen im Vergleich zu normoxiezustand. Fehlerbalken: Standardfehler von Mittelwert. (D) repräsentative Querschnittsbilder der fetalen Herzen bei GD 18.5 Darstellung erhöht RV Wandstärke Hypoxie behandelt und normoxiezustand behandelt. Ursprüngliche Vergrößerung 10 X. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57210/57210fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parameter Einheit</td>
			<td>Normoxiezustand</td>
			<td>Pränatale Hypoxie</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zahl der erfolgreich abgebildeten Feten</td>
			<td>20</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>Postnatale Sterblichkeit</td>
			<td>5 %</td>
			<td>68,75 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hämodynamischen Parameter</td>
			<td>(Mittelwert ± SEM)</td>
			<td>(Mittelwert ± SEM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fetale Herzfrequenz, bpm</td>
			<td>138 ± 4</td>
			<td>89 ± 8 ***</td>
		</tr>
<tr>
<td>Linke Herzkammer EF %</td>
			<td>71,2 ± 3</td>
			<td>55 ± 2 **</td>
		</tr>
<tr>
<td>Linke Herzkammer FS %</td>
			<td>43 ± 2</td>
			<td>29 ± 4 **</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lungenarterie PkV, mm/s</td>
			<td>102 ± 10</td>
			<td>129 ± 8 **</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lungenarterie AT ET-Verhältnis</td>
			<td>0,42 ± 0,05</td>
			<td>0,35 ± 0.03*</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nabelarterie PkV, mm/s</td>
			<td>58 ± 4</td>
			<td>40 ± 1.5* **</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nabelarterie bei ET-Verhältnis</td>
			<td>0,5 ± 0,03</td>
			<td>0,42 ± 0.025*</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nabelader PkV, mm/s</td>
			<td>13 ± 1,2</td>
			<td>19.6 ± 3 **</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nabelschnur venösen und arteriellen Verzögerung, ms</td>
			<td>122 ± 4</td>
			<td>238 ± 20 *</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">EF, Auswurffraktion; FS, gebrochene Verkürzung; NA, nicht zur Verfügung; NS, nicht signifikant; PkV, Peak-Geschwindigkeit; PkV, d, Peak Geschwindigkeit während der Diastole; PkV, s, Spitze Geschwindigkeit während der Systole; Der Student t-Test wurde zur interfraktionellen Unterschiede ableiten. P < 0,005. ** P < 0,01. * P < 0,05 stellt einen signifikanten Unterschied bei konzerninternen vergleichen. Studenten t-Test. Non-Bedeutung war leer.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: hämodynamische Parameter Inklusieve und hypoxischen fetalen Mäuse am Tag 18,5. EF, Auswurffraktion; FS, gebrochene Verkürzung; PkV, Peak-Geschwindigkeit; AT, Beschleunigung der Zeit; ET, Auswurf Zeit. Der Student t -Test wurde zur interfraktionellen Unterschiede ableiten. *** P < 0,005. P < 0,01, und * P < 0,05 stellt einen signifikanten Unterschied im konzerninternen Vergleich.
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/57210/57210vid1v2.jpg"> Video 1: B-Modus kurze Achse Blick. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57210/Video_1-B_mode-Short_axis_View.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/57210/57210vid2v2.jpg"> Video 2: Farbe Doppler – apikale längs Blick. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57210/Video_2-Color_Doppler-Apical_Longtudinal_View.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/57210/57210vid3v2.jpg"> Video 3: M-Modus. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57210/Video_3-M-Mode.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/57210/57210vid4v2.jpg"> Video 4: Lungenarterie – gepulsten Doppler. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57210/Video_4-Pulmonary_Artery_Pulsed_wave_Doppler.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>

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Herz-Kreislauf-Bildgebung bei fetalen Mäusen mit einem Hochfrequenz-Ultraschallsystem mit 30/45 MHz | Entwicklungsbiologie | Video

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Fetale kardiovaskuläre Bildgebung mit einem Hochfrequenz-Ultraschall (30 / 45MHZ) Maus

Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung der fetalen Maus bildgebenden Auflösung verbessert und bieten präzise nicht-invasive Charakterisierung der kardialen Entwicklung und strukturelle Mängel. Die hier beschriebenen Protokoll soll in Echtzeit fetalen Mäuse Echokardiographie in Vivodurchführen.

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

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Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Human Biology

Circulatory and Pulmonary Systems

SCIENTISTS IN ACTION

11.5K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung der fetalen Maus bildgebenden Auflösung verbessert und bieten präzise nicht-invasive Charakterisierung der kardialen Entwicklung und strukturelle Mängel. Die hier beschriebenen Protokoll soll in Echtzeit fetalen Mäuse Echokardiographie in Vivodurchführen.

Serie: Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Murine Echocardiography and Ultrasound Imaging

Rodent models of cardiac pathophysiology represent a valuable research tool to investigate mechanism of disease as well as test new therapeutics.1 Echocardiography provides a powerful, non-invasive tool to serially assess cardiac morphometry and function in a living animal.2 However, using this technique on mice poses unique challenges owing to the small size and rapid heart rate of these animals.3 Until recently, few ultrasound systems were capable of performing quality echocardiography on mice, and those generally lacked the image resolution and frame rate necessary to obtain truly quantitative measurements. Newly released systems such as the VisualSonics Vevo2100 provide new tools for researchers to carefully and non-invasively investigate cardiac function in mice. This system generates high resolution images and provides analysis capabilities similar to those used with human patients. Although color Doppler has been available for over 30 years in humans, this valuable technology has only recently been possible in rodent ultrasound.4,5 Color Doppler has broad applications for echocardiography, including the ability to quickly assess flow directionality in vessels and through valves, and to rapidly identify valve regurgitation. Strain analysis is a critical advance that is utilized to quantitatively measure regional myocardial function.6 This technique has the potential to detect changes in pathology, or resolution of pathology, earlier than conventional techniques. Coupled with the addition of three-dimensional image reconstruction, volumetric assessment of whole-organs is possible, including visualization and assessment of cardiac and vascular structures. Murine-compatible contrast imaging can also allow for volumetric measurements and tissue perfusion assessment.

This video demonstrates use of a rail-mounted high-frequency ultrasound probe to perform echocardiography on an anesthetized mouse. The methods describe both conventional two-dimensional and M-mode measurements of cardiac function in addition to newer, more powerful tools such as color Doppler, strain analysis, as well as general and targeted contrast imaging.

Murine Echokardiographie und Ultraschall-Bildgebung

Rodent models of cardiac pathophysiology represent a valuable research tool to investigate mechanism of disease as well as test new therapeutics.1  ...

Forschung

Medizin

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

Contrast Imaging in Maus Embryonen Verwendung von Hochfrequenz-Ultraschall

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Entwicklungsbiologie

Murine Fetal Echocardiography

Transgenic mice displaying abnormalities in cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding the molecular mechanisms underlying both normal cardiovascular function and the pathophysiological basis of human cardiovascular disease. Fetal and perinatal death is a common feature when studying genetic alterations affecting cardiac development 1-3. In order to study the role of genetic or pharmacologic alterations in the early development of cardiac function, ultrasound imaging of the live fetus has become an important tool for early recognition of abnormalities and longitudinal follow-up. Noninvasive ultrasound imaging is an ideal method for detecting and studying congenital malformations and the impact on cardiac function prior to death 4. It allows early recognition of abnormalities in the living fetus and the progression of disease can be followed in utero with longitudinal studies 5,6. Until recently, imaging of fetal mouse hearts frequently involved invasive methods. The fetus had to be sacrificed to perform magnetic resonance microscopy and electron microscopy or surgically delivered for transillumination microscopy. An application of high-frequency probes with conventional 2-D and pulsed-wave Doppler imaging has been shown to provide measurements of cardiac contraction and heart rates during embryonic development with databases of normal developmental changes now available 6-10. M-mode imaging further provides important functional data, although, the proper imaging planes are often difficult to obtain. High-frequency ultrasound imaging of the fetus has improved 2-D resolution and can provide excellent information on the early development of cardiac structures 11.

Fetal and perinatal death is a common feature when studying genetic alterations affecting cardiac development. High-frequency ultrasound imaging has improved 2-D resolution and can provide excellent information on early cardiac development and is an ideal method to detect the impact on cardiac structure and function prior to death.

Murine fetale Echokardiographie

Transgenic mice displaying abnormalities in  cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding  the molecular mechanisms ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

Eine neue Verwendung des dreidimensionalen Hochfrequenz-Sonographie zur frühen Schwangerschaft Charakterisierung in der Maus

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Fetal Echocardiography and Pulsed-wave Doppler Ultrasound in a Rabbit Model of Intrauterine Growth Restriction

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ultrasound and fetal echocardiography. Increasingly, these imaging modalities are being employed clinically to examine cardiac function and assess wellbeing in utero, thereby guiding timing of birth decisions. Here, we used a rabbit model of IUGR that allows analysis of cardiac function in a clinically relevant way. Using isoflurane induced anesthesia, IUGR is surgically created at gestational age day 25 by performing a laparotomy, exposing the bicornuate uterus and then ligating 40-50% of uteroplacental vessels supplying each gestational sac in a single uterine horn. The other horn in the rabbit bicornuate uterus serves as internal control fetuses. Then, after recovery at gestational age day 30 (full term), the same rabbit undergoes examination of fetal cardiac function. Anesthesia is induced with ketamine and xylazine intramuscularly, then maintained by a continuous intravenous infusion of ketamine and xylazine to minimize iatrogenic effects on fetal cardiac function. A repeat laparotomy is performed to expose each gestational sac and a microultrasound examination (VisualSonics VEVO 2100) of fetal cardiac function is performed. Placental insufficiency is evident by a raised pulsatility index or an absent or reversed end diastolic flow of the umbilical artery Doppler waveform. The ductus venosus and middle cerebral artery Doppler is then examined. Fetal echocardiography is performed by recording B mode, M mode and flow velocity waveforms in lateral and apical views. Offline calculations determine standard M-mode cardiac variables, tricuspid and mitral annular plane systolic excursion, speckle tracking and strain analysis, modified myocardial performance index and vascular flow velocity waveforms of interest. This small animal model of IUGR therefore affords examination of in utero cardiac function that is consistent with current clinical practice and is therefore useful in a translational research setting.

We describe examination of fetal cardiac function with contemporary functional fetal echocardiography and fetoplacental Doppler ultrasound using the VisualSonics VEVO 2100 microultrasound in a surgically induced model of intrauterine fetal growth restriction in a rabbit.

Fetale Echokardiographie und Pulsed-Wave-Doppler-Ultraschall in einem Kaninchen-Modell von Intrauterine Growth Restriction

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease and injury regional estimates, World Health Organization, 2004). Surgeries that often compromise the quality of life are required to correct heart defects, reminding us of the importance of finding the causes of CHD. Mutant mouse models and live imaging technology have become essential tools to study the etiology of this disease. Although advanced methods allow live imaging of abnormal hearts in embryos, the physiological and hemodynamic states of the latter are often compromised due to surgical and/or lengthy procedures. Noninvasive ultrasound imaging, however, can be used without surgically exposing the embryos, thereby maintaining their physiology. Herein, we use simple M-mode ultrasound to assess heart rates of embryos at E18.5 in utero. The detection of abnormal heart rates is indeed a good indicator of dysfunction of the heart and thus constitutes a first step in the identification of developmental defects that may lead to heart failure.

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Ultra-high frequency ultrasound is a powerful live imaging tool to examine cardiac abnormalities in small animals. Its noninvasiveness allows maintaining the physiologic state of embryos. Herein, we show the use of M-mode ultrasound to measure the heart rates of embryos at E18.5 in utero.

In utero Messung der Herzfrequenz in Mouse von Nichtinvasive M-Mode-Echokardiographie

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and painless, and the application is easy, fast, and can be done anywhere, even with mobile devices. During pregnancy, ultrasound imaging is standardly used to closely monitor fetal development. The technique is important to assess intrauterine growth restriction (IUGR), a pregnancy complication with short- and long-term health consequences for both the mother and fetus. Understanding the process of IUGR is indispensable for developing effective therapeutic strategies. 
The ultrasound system used in this manuscript is an ultrasound device produced for the analysis of small animals and can be used in various research fields, including pregnancy research. Here we describe the usage of the system for in vivo analysis of fetuses from natural killer (NK) cell/mast cell (MC)-deficient mothers that give birth to growth-restricted pups. The protocol includes preparation of the system, handling of the mice before and during measurements, and the usage of the B-mode, color doppler mode, and pulse-wave doppler mode. Fetal size, placental size, and blood supply to the fetus were analyzed. We found reduced implantation sizes and smaller placentas in NK/MC-deficient mice from mid-gestation onwards. In addition, MC/NK-deficiency was associated with absent and reversed end diastolic flow in the fetal Arteria umbilicalis(UmA) and an elevated resistance index. The methods described in the protocol can easily be used for related and non-related research topics.

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Here we describe the technique of high frequency ultrasound for in vivo analysis of fetuses in mice. This method allows the follow-up of fetuses and the analysis of placental parameters as well as maternal and fetal blood flow throughout pregnancy.

Hochfrequenz-Ultraschall für die Analyse der fetalen und plazentaren Entwicklung In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...

Is My Mouse Pregnant? High-Frequency Ultrasound Assessment

The mouse is the mammalian animal model of choice for many human diseases and biological processes. Developmental biology often requires staged-pregnant mice to determine evolving processes at various timepoints. Moreover, optimal and efficient breeding of model mice requires an assessment of timed pregnancies. Most commonly, mice are mated overnight, and the presence of a vaginal plug is determined; however, the positive predictive value of this technique is suboptimal, and one needs to wait to know if the mouse is truly pregnant. High-resolution ultrasound biomicroscopy is an effective and efficient tool for imaging: 1) Whether a mouse is pregnant; 2) What gestational stage the mouse has reached; and 3) Whether there are intrauterine losses. In addition to the embryos and fetuses, the investigator must also recognize common artifacts in the abdominal cavity so as not to mistake these for a gravid uterus. This article provides a protocol for imaging along with illustrative examples.

High-resolution ultrasound can help streamline experiments requiring timed-pregnant mice by determining the state of pregnancy, gestational age, and pregnancy losses. Presented here is a protocol to illustrate methods to assess mouse pregnancies as well as potential pitfalls (image artifacts) that may mimic pregnancy.

Ist meine Maus schwanger? Hochfrequenz-Ultraschalluntersuchung

The mouse is the mammalian animal model of choice for many human diseases and biological processes. Developmental biology often requires staged-pregnant ...

Ultrafast Doppler Ultrasound for Hepatic Microvasculature Analysis in Mice

Imaging and Quantification of the Hepatic Vasculature of Mice Using Ultrafast Doppler Ultrasound

Non-invasive in vivo imaging of the vasculature is a powerful tool for studying disease mechanisms in rodents. To achieve high sensitivity imaging of the microvasculature using Doppler ultrasound methods, imaging modalities employing the concept of ultrafast imaging are preferred. By increasing the frame rate of the ultrasound scanner to thousands of frames per second, it becomes possible to improve the sensitivity of the blood flow down to 2 mm/s and to obtain functional information about the microcirculation in comparison to a sensitivity of around 1 cm/s in conventional Doppler modes. While Ultrafast Doppler ultrasound (UFUS) imaging has become adopted in neuroscience, where it can capture brain activity through neurovascular coupling, it presents greater challenges when imaging the vasculature of abdominal organs due to larger motions linked to breathing. The liver, positioned anatomically under the diaphragm, is particularly susceptible to out-of-plane movement and oscillating respiratory motion. These artifacts not only adversely affect Doppler imaging but also complicate the anatomical analysis of vascular structures and the computation of vascular parameters. Here, we present a qualitative and quantitative imaging analysis of the hepatic vasculature in mice by UFUS. We identify major anatomical vascular structures and provide graphical illustrations of the hepatic macroscopical anatomy, comparing it to an in-depth anatomical assessment of the hepatic vasculature based on Doppler readouts. Additionally, we have developed a quantification protocol for robust measurements of hepatic blood volume of the microvasculature over time. To contemplate further research, qualitative vascular analysis provides a comprehensive overview and suggests a standardized terminology for researchers working with mouse models of liver disease. Furthermore, it offers the opportunity to apply ultrasound as a non-invasive complementary method to inspect hepatic vascular defects in vivo and measure functional microvascular alterations deep within the organ before unraveling blood vessel anomalies at the micron scale levels using ex vivo staining on tissue sections.

Ultrafast Doppler ultrasound (UFUS) with high spatial resolution (100 &#956;m) and sensitivity represents a suitable noninvasive imaging modality for obtaining a comprehensive qualitative overview of the hepatic vasculature. UFUS also facilitates quantitative measurements of the microvasculature, aiming to enhance our understanding of vascular disease mechanisms.

Non-invasive in vivo imaging of the vasculature is a powerful tool for studying disease mechanisms in rodents. To achieve high sensitivity imaging of the ...

High-frequency Ultrasound Imaging of the Abdominal Aorta

Source: Amelia R. Adelsperger, Evan H. Phillips, and <a href="https://www.jove.com/author/Craig+J._Goergen">Craig J. Goergen</a>, Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, West Lafayette, Indiana
High-frequency ultrasound systems are used to acquire high resolution images. Here, the use of a state-of-the-art system will be demonstrated to image the morphology and hemodynamics of small pulsatile arteries and veins found in mice and rats. Ultrasound is a relatively inexpensive, portable, and versatile method for the noninvasive assessment of vessels in humans as well as large and small animals. These are several key advantages that ultraound offers compared to other techniques, such as computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and near-infrared fluorescence tomography (NIRF). CT requires ionizing radiation and MRI can be prohibitively expensive and even impractical in some scenarios. NIRF, on the other hand, is limited by the penetration depth of light required to excite the fluorescent contrast agents.
Ultrasound has limitations in terms of imaging depth; however, this may be overcome by sacrificing resolution and using a lower frequency transducer. Abdominal gas and excess body weight can severely diminish image quality. In the first case, the propagation of sound waves is limited, while in the latter case, they are attenuated by overlying tissues, such as fat and connective tissue. As a result, no contrast or faint contrast may be observed. Finally, ultrasound is a highly user-dependent technique, requiring the sonographer to be familiar with anatomy and to be able to work around issues, such as the appearance of imaging artifacts or acoustic interference.

High-frequency Ultrasound Imaging and Image Acquisition

Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung der Bauchaorta

Source: Amelia R. Adelsperger, Evan H. Phillips, and Craig J. Goergen, Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, West Lafayette, 
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