OCT ist ein Kryokonservierungsmittel, das mit der massenspektrometrischen Analyse nicht kompatibel ist. Mit diesem Protokoll können Forscher OCT aus Geweben entfernen und Sphingolipide mit Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie quantifizieren. Die Herstellung von Gewebetrocknungsdochten, Gewebewaschen und Gewebewiegen wird von April Boyd von der Virginia Commonwealth University demonstriert, und die Lipidextraktion wird von Dr. Jeremy Allegood, Direktor des Virginia Commonwealth Metabolomics and Lipidomics Core, demonstriert.
Reinigen Sie zunächst die chirurgische Schere, indem Sie sie fünf Minuten lang in Methanol eintauchen, gefolgt von einem sauberen Laborgewebe. Wirbeln Sie mit puderfreien Handschuhen das Ende eines Laborgewebes zu einem fein konischen 30 bis 40 Millimeter langen Docht. Schneiden Sie dann mit der mit Methanol gereinigten Schere den Docht am dicken Ende ab und legen Sie ihn in einen sauberen Karton.
Als nächstes schneiden Sie mit der mit Methanol gereinigten Schere vier bis fünf Millimeter von der Spitze einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze ab und legen Sie die Spitze wieder in den Spitzenhalter. Um das OCT aus dem Gewebe abzuwaschen, fügen Sie 10 Milliliter eiskaltes ultrareines entionisiertes Wasser zu jedem Röhrchen hinzu, das menschliches Lungengewebe enthält, und verschließen Sie sie fest. Lassen Sie die Röhrchen 10 Minuten inkubieren.
Wirbeln Sie jedes Röhrchen kräftig durch, bis das gesamte an den Wänden des Röhrchens oder des Gewebepellets abgelagerte Gewebe vollständig resuspendiert ist. Anschließend zentrifugieren Sie die Röhrchen in einer vorgekühlten Schaufelzentrifuge bei 4.000 bis 5.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, öffnen Sie die Röhrchen auf Eis.
Saugen Sie die Waschlösung vorsichtig ab, lassen Sie etwa 0,5 Milliliter des Überstands im Röhrchen, und verschließen Sie dann das Röhrchen erneut. Nachdem Sie den Überstand aus allen Röhrchen entfernt haben, waschen Sie das Gewebe noch zweimal auf die gleiche Weise. Nach den drei OCT-Entfernungswäschen verwenden Sie die vorbereitete verkürzte Pipettenspitze, um 500 Mikroliter eiskaltes PBS in das Röhrchen zu geben.
Resuspendieren Sie das Pellet mit derselben Spitze vorsichtig und geben Sie das gesamte resuspendierte Gewebe in ein vormarkiertes und vorgewogenes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Halten Sie das Röhrchen auf Eis, bis alle Gewebeproben übertragen sind. Pelletieren Sie das Gewebe, indem Sie die Röhrchen in einer vorgekühlten Zentrifuge zentrifugieren, dann vorsichtig so viel PBS wie möglich absaugen, ohne das Pellet zu stören, und legen Sie die Röhrchen wieder auf Eis.
Entfernen Sie mit den zuvor vorbereiteten Gewebetrocknungsdochten vorsichtig die restliche Waschlösung, schließen Sie dann das Röhrchen und legen Sie es auf Eis. Um die Röhrchen zu wiegen, legen Sie jeweils ein Röhrchen in eine kürzlich kalibrierte Teer- und Null-Analysenwaage und schließen Sie die Kammertür. Sobald sich das Gewicht stabilisiert hat, notieren Sie es in einer elektronischen Tabelle.
Stellen Sie das Röhrchen nach dem Wiegen wieder auf Eis und fügen Sie 300 Mikroliter eiskaltes PBS hinzu. Übertragen Sie mit einer verkürzten Pipettenspitze vorsichtig das gesamte Gewebe in zwei Milliliter eiskaltes Methanol in einem vorbeschrifteten Glasrohr mit Schraubverschluss. Lassen Sie vor der Lipidextraktion die internen Lipidstandards des Gewebes und der Massenspektrometrie 20 Minuten lang auf Raumtemperatur ausgleichen, dann wirbeln und tauchen Sie die internen Standardlösungen in ein Ultraschallwasserbad, bis sich die Lipidstandards vollständig aufgelöst haben.
Fügen Sie mit einer Repetierpipette 250 Picomole der internen Massenspektrometriestandards zu jeder Röhre hinzu und verschließen Sie die Röhrchen leicht. Um die Homogenisierung zu erleichtern, stellen Sie das Methanolvolumen auf zwei Milliliter ein und trituieren Sie dann das Gewebe mit einem Homogenisator, indem Sie die Homogenisatorspitze in einer kreisförmigen Bewegung bewegen, die sanft gegen die Rohrwand gedrückt wird. Wenn Klumpen nicht mehr sichtbar sind, verschließen Sie das Röhrchen erneut.
Tauchen Sie die Röhre in einem Winkel von 45 Grad für 5 bis 10 Sekunden in ein Ultraschall-Wasserbad. Fügen Sie dann unter einem Abzug Chloroform und Methanol zu jedem Röhrchen hinzu, um ein Verhältnis von Methanol zu Chloroform zu Wasser von zwei zu eins zu 0,1 zu erreichen. Verschließen Sie die Tuben fest und lassen Sie sie bis zum Ende des Tages auf dem Tisch.
Bevor Sie an diesem Abend gehen, legen Sie die dicht verschlossenen Röhrchen in ein 48 Grad Celsius warmes Wasserbad für eine Inkubation über Nacht. Am folgenden Tag werden Lösungsmittel und lösliche Ablagerungen durch Zentrifugieren pelletiert. Dekantieren Sie dann in einem Abzug den Überstand vorsichtig in vorbeschriftete 13 bis 100 Millimeter Borosilikatglas-Reagenzgläser, die in einem Winkel von 30 bis 45 Grad geneigt sind, um das Dekantieren zu erleichtern.
Verwenden Sie nach dem Dekantieren des Überstands aus allen Röhrchen einen Vakuumkonzentrator bei maximalem Vakuum mit einem anfänglichen einstündigen Heizschritt bei 40 Grad Celsius, um das gesamte Lösungsmittel zu verdampfen, und fügen Sie dann 500 Mikroliter Methanol zu jeder Röhre hinzu. Um die getrockneten Lipidextrakte zu resuspendieren, wirbeln Sie das Röhrchen für 5 bis 10 Sekunden und tauchen Sie das Röhrchen dann in ein Ultraschall-Wasserbad in einem 45-Grad-Winkel mit Drehung für zwei Minuten. Wirbeln Sie das Rohr fünf Sekunden lang erneut und tauchen Sie für eine weitere Minute in das Ultraschall-Wasserbad ein.
Entfernen Sie unlösliche Ablagerungen durch Zentrifugation und dekantieren Sie dann den Überstand in eine vormarkierte Autoinjektordurchstechflasche, die in einem Winkel von 30 bis 45 Grad geneigt ist, um das Dekantieren zu erleichtern. Verschließen Sie die Durchstechflaschen fest, bevor Sie sie bis zur Analyse bei minus 80 Grad Celsius lagern. Die Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie-Analyse nach OCT-Entfernung bestätigt, dass verschiedene kettenlange Spezies von Ceramiden und Monohexosyl-Ceramiden in menschlichen Lungenadenokarzinom-Tumoren im Vergleich zu normalen benachbarten unbeteiligten Geweben signifikant erhöht sind.
Sphingolipid-Standards eluieren nacheinander in der folgenden Reihenfolge:d17:1 Sphingosin, d17:1 Sphingosin-1-phosphat, C12 Lactosyl-Ceramid, C12 Monohexosyl-Ceramid, C12 Sphingomyelin und C12 Ceramid. Für jede dieser Sphingolipidspezies ergibt sich unter Verwendung der Gradienten- und Instrumentierungseinstellungen im Text eine ungefähre positive Verschiebung der Retentionszeit um 0,15 Minuten für jede zweite Kohlenstoffzunahme der Kettenlänge. Längere kettenlange Lipide wie C24 und C26 können jedoch größere Verschiebungen der Retentionszeit aufweisen.
Darüber hinaus führt eine Doppelbindung in der Fettsäure oft zu einer negativen Verschiebung der Retentionszeit um 0,15 Minuten. Daher hat C18:1-Ceramid eine ähnliche Retentionszeit wie C16-Ceramid. Anstatt sich fast ausschließlich auf frisch gesammeltes Gewebe zu verlassen, erweitert dieses Protokoll die Gewebequellen, die für die massenspektrometrische Analyse verwendet werden können, um diejenigen, die kryogen in Biorepositorien gelagert werden.
