1. S. Cerevisiae Kulturen und Protein-Expression
Hinweis: Aβ-Varianten weisen unterschiedliche relative Aggregation Neigungen aufgrund einer Mutation in einem einzigen Rückstand an Position 19 (Phe19) des Aβ42 Peptid (Abbildung 1A). Diese Peptid-Varianten sind mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP), fungiert als eine Aggregation Reporter (Abbildung 1)29versehen.
<ol><li>Plasmide, die Codierung für 20 Aβ42-GFP-Varianten in Hefezellen mit einem BY4741 elterlichen Hintergrund (MATa seine3Δ1 Leu2Δ0 traf15Δ0 ura3Δ0)30zu verwandeln. Jedes Plasmid kodiert für ein Aβ42 Mutant mit GFP durch einen GSSGSSG Linker verschmolzen. Plasmide sind pESC(-URA) und beinhalten die auswählbare Markierung URA329.<ol>
<li>Bereiten Sie das synthetische komplette Medium ohne Uracil (SC-URA) mit den folgenden Komponenten: 1,9 g/L Hefe Stickstoff base Uracil, 5 g/L Ammoniumsulfat und 900 mL DdH2O kombiniert mit 100 mL Glukose 20 % (w/V).</li>
		<li>Eine Kolonie der transformierten Hefezellen in 20 mL des Mediums SC-URA, enthält 2 % Glukose und wachsen Sie die Kulturen über Nacht bei 30 ° C unter Schütteln bei 210 u/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wachsen Sie am nächsten Tag neue Hefekulturen Zellen durch Impfkeimen 100 µL der Übernacht-Kultur in 5 mL frisches SC-URA-Medium.</li>
	<li>Bei einer OD590 von 0,5 die Kulturen bei 3.000 x g für 4 min zentrifugieren, überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in die gleiche Menge an frischer SC-URA-Speichermedium mit 2 % Raffinose.</li>
	<li>Bei 30 ° C unter Agitation bei 210 u/min für 30 min inkubieren. Dann die Zellen bei 3.000 x g für 4 min zentrifugieren und den überstand verwerfen. Aufzuwirbeln Sie die Zellen in frischen SC-URA-Speichermedium mit 2 % Galaktose induzieren die rekombinante Proteinexpression.</li>
	<li>Nach 16 h zur Induktion der Proteinexpression in SC-URA 2 % Galaktose-haltigem Medium Ernte 1 mL der induzierten Zellen in sterilen Mikrozentrifugenröhrchen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 4 Minuten. Hinweis: Die wichtigsten Unterschiede auftreten, nachdem eine Einarbeitungszeit von 16 h. induzierte Hefezellen mit dem Ausdruck Aβ42-GFP-Varianten durch Fluoreszenz-Mikroskopie zur Bestimmung der rekombinanten PROTEINVERTEILUNG innerhalb der Zellen (Abb. 2 b) sichtbar gemacht werden kann.</li>
</ol>(2) Zelle färben
Hinweis: Frischzellen-induzierte sind als Negativkontrolle herstellen eine fluoreszierende Schwelle während einer FC-Analyse erforderlich.
<ol><li>Die 16 h-induzierte Hefezellen übernehmen und bestimmen ihre optische Dichte bei 590 nm (OD590). Verdünnen sie in eine sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ein OD590 von 0,1.<ol>
<li>1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung wie folgt vorbereiten: 8 g NaCl, KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,2 g und 0,24 g KH2PO4 bis 800 mL DdH2O. füllen Sie die Lösung bis zu 1 L DdH2O nach Einstellen des pH-Werts auf 7,4 mit HCl. Filter des Puffers durch einen 0,2 µm-Filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfer mit dem Ausdruck ihrer Zellsuspensionen entsprechend gekennzeichneten Rohre (12 × 75 mm Rundboden Polystyrol) und vor Licht zu schützen. Stellen Sie sicher, dass sie bereit sind, auf das Durchflusszytometer für Analyse, zusammen mit nicht-induzierte und nicht-gefärbten Zellen geladen werden.</li>
	<li>Jede Probe auf eine Endkonzentration von 5 µM die oxidativen Stress-Sonde (z. B. CellROX tiefrot) hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 30 ° C für 30 Minuten im Dunkeln.</li>
	<li>Waschen Sie nach der Inkubation der Zellen 3 Mal mit 1 X PBS und Aufschwemmen sie in das gleiche Volumen des Puffers vor ihrer Analyse von FC.</li>
</ol>(3) Flow Cytometry Analysis
Hinweis: Verwenden Sie eine FC-Setup mit geeigneten Laser und Filter zur Erkennung von GFP und oxidativem Stress Sonde Fluoreszenzsignal. Ein Durchflusszytometer ausgestattet mit 488 nm blaue Laser für den Nachweis der GLP und einem 635 nm rot-Laser für den Nachweis von oxidativem Stress Sonde Fluoreszenz kann verwendet werden. Erwerb der Fluoreszenz Emission von GFP und oxidativem Stress Sonde erfolgt mit einem 530/30 nm BP und ein 660/20 BP Filter, bzw. (Tabelle 1).
<ol><li>Klicken Sie auf Neues Arbeitsblatt Öffnungsklappe und erstellen Sie die folgenden Erwerb Punkt plottet.<ol>
<li>Wählen Sie aus der Symbolleiste das Scatter Plot-Tool und erstellen Sie ein Grundstück mit den Variablen Side Scatter-Area (SSC-A) auf der y-Achse vs. Forward Scatter-Bereich (FSC-A) in einer linearen Skala auf der x-Achse.</li>
		<li>Klicken Sie auf das Scatter Plot-Werkzeug aus der Werkzeugleiste und erstellen Sie ein Grundstück mit der Variablen FL1-Bereich (FITC) auf der x-Achse Vs. FL3-Bereich (APC) in einer logarithmischen Skala auf der y-Achse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klicken Sie auf das Symbol " Instrumenten-Einstellungen ". Klicken Sie auf die Registerkarte " Entschädigung " und legen Sie alle Vergütungsstufen. Klicken Sie auf die Registerkarte " Erwerb " und wählen Sie eine Gesamtanzahl von 20.000 Ereignisse aufgezeichnet werden.</li>
	<li>Klicken Sie auf Durchfluss , um den Durchfluss zu niedrigzu wechseln.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Registerkarte " Acquire " anfangen zu laufen-induzierte, ungefärbten Zellen, und passen Sie die Spannung in den Geräteeinstellungen des Forward und Side Scatter, bis die Bevölkerung in der Mitte-Links-Quadranten verteilt ist.<ol>
<li>Klicken Sie auf das Polygon -Symbol, um eine Region R1 um die Zellpopulation ausgenommen zellenrückstand gesetzt, und verwenden Sie diese geschlossene Population P1 = R1 für alle fluoreszierenden Punkt plottet und Histogramm Darstellungen (Abbildung 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um die PMT-Spannung des Fluoreszenzsignals anzupassen, führen Sie die ungefärbten Zellen im FL1-FL3 Dot Plot, den Gewinn in der Registerkarte " Geräteeinstellung " tuning, bis die Zellen im unteren linken Quadranten verteilt sind.</li>
	<li>Ändern der Probenmaterials auf die induzierte Zellen GFP Fluoreszenz zu messen. Stellen Sie im Register Geräteeinstellung Gain in der FSC-A vs. FL1 (FITC) Wenn die Bevölkerung im rechten unteren Quadranten verteilt wird. Definieren Sie die positiven Zellpopulation mit einem Tor (Tor P2).</li>
	<li>Veränderung der Probe, die nicht induzierten gefärbten Zellen oxidativen Stress durch die Fluoreszenz auf ein FSC-A vs. FL3 (APC) Dot-Plot angezeigt. Tunen Sie die Verstärkung, bis die Zellpopulation im linken oberen Quadranten verteilt wird. Tor der positiven Zellpopulation im P3.</li>
	<li>Machen Sie zwei Histogramm-Grundstücke mit dem Histogramm -Symbol um die Fluoreszenz der Zelle darzustellen. Der Fluoreszenzintensität darzustellen, stellen Sie sicher FL1 (FITC) repräsentieren die GFP Fluoreszenz ist auf der x-Achse und FL3 (APC) repräsentieren die Fluoreszenz in der y-Achse P2 und P3 Populationen bzw. auf einer logarithmischen Skala anwenden. Hinweis: Histogramm Overlays sind eine gute Möglichkeit, Unterschiede zwischen den Fluoreszenz-Profilen von Zellen mit dem Ausdruck Aβ-Varianten zu verdeutlichen.</li>
</ol>(4) rekombinante Protein Immunodetection
<ol><li>Um proteingehalte Ausdruck zu ermitteln, Ernten Sie die Hefekulturen für 16 h durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 6 min induziert, und speichern Sie die Zelle Pellets bei-80 ° C.<ol>
<li>Aufschwemmen der gesammelten Zellen rekombinantes Protein für 16 h mit PBS-Puffer zum Ausdruck zu bringen. 200 µL Zellsuspensionen jedes Aβ42-GFP mutierte zu einem OD-590 20 vorzubereiten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für die Gesamt-Protein Bruchteil Analyse, Ernte 100 µL jeder Mutant durch Zentrifugation bei 14.000 x g für 20 min und Aufschwemmen der Zelle-Pellets in die gleiche Menge an Hefe Lyse Puffer Y-pro (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 % DMSO, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA enthalten 10 mg/mL SB3-14 (Myr Istyl Sulfobetaine) ergänzt mit 1 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF)).<ol>
<li>Inkubieren Sie die Proben für 20 min bei Raumtemperatur unter milden Agitation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentration Extrakt mithilfe des Bradford-Tests. Laden Sie bis zu 5 µg Proteinextrakt jeder Probe auf eine 15 % Acrylamid SDS-PAGE-Elektrophorese Gel und Blot auf eine Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran bei 100 V 60 Minuten.<ol>
<li>Bereiten Sie ein Bradford Reagenz mit 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 in 50 mL 95 % Ethanol gelöst und 100 mL Phosphorsäure 85 % (w/V). Dann, wenn der Farbstoff vollständig aufgelöst ist, verdünnen Sie die Mischung mit DdH2O, 1 L und Filtern sie durch Zellulose Filterpapier kurz vor Gebrauch. Hinweis: Die Bradford-Reagenz sollte sein hellbraun.</li>
		<li>Bereiten Sie einen Standard von Rinderserumalbumin (BSA) von 5-100 µg Protein in 1.000 µL des Bradford-Reagenz.</li>
		<li>Fügen Sie 1 bis 10 µL des Proteins zu 1 mL der Bradford-Reagenz zu extrahieren und die Mischung bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren.</li>
		<li>Messung der Extinktion des Standards und die Proteinproben Extrakt bei OD595.</li>
		<li>Machen Sie für die Analyse ein Grundstück mit der Extinktion-Werte, die für die Normen Vs. µg Protein. Anhand der Standardkurve, bestimmen Sie die Konzentrationen an die original-Samples aus der Menge an Protein, wenn man bedenkt, das Volumen und die Verdünnung, falls vorhanden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spülen Sie die Membran mit 1 x Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS), 0,1 % Tween 20 (TTB), und es mit 5 % (w/V) fettfreie Trockenmilch in 1 X TTBS zu blockieren.<ol>
<li>Um 1 L 10 X TBS vorzubereiten, lösen Sie 24 g Tris-base und 88 g NaCl in 900 mL H2ODd auf und passen Sie den pH-Wert auf 7,6. Fügen Sie DdH2O zu einem Endvolumen von 1 L. Mischen Sie für eine Lösung 1 X 1 Teil 10 X Lager mit 9 Teile des DdH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Membran für 1 h mit einem β-Amyloid Primärantikörper 6E10 verdünnt 1:1,000 brüten und für 1 h bei Raumtemperatur mit einer Sekundärantikörper Ziege Anti-Maus IgG-HRP Konjugat verdünnt 01:10, 000.</li>
	<li>Entwickeln Sie Membranen mit 1 mL Luminata fluoreszierende Reagenz zu und quantifizieren Sie Bänder durch densitometrische Analysen zu, wie im Schritt 5.2 beschrieben.</li>
</ol>(5) Datenanalyse
<ol><li>Um die Daten, die von FC zu analysieren, erstellen Sie eine Tabelle zeigt die mittlere fluoreszente Intensität (MFI) und mittlere Fluoreszenz mit den entsprechenden Standard-Fehler und/oder der Koeffizient der Varianz (CV) für GFP Fluoreszenz und oxidativen Stress.<ol>
<li>Klicken Sie auf die Registerkarte " Inspektor " und die Statistik -Symbol, um die statistischen Daten anpassen, die für jeden Kanal erforderlich sind. Hinweis: Beim Vergleich von Protein-Varianten konvertieren Sie Fluoreszenz Werte Daten zu einer Falte-Over Hintergrund oder Auflösung Metrik (RD): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57470/57470eq1.jpg"> In dieser Metrik die mittlere Probe ist die mittlere Fluoreszenz Problem Proben, das mittlere Steuerelement ist die mittlere Fluoreszenz von Zellen als Steuerelement verwendet und die SD ist die Standardabweichung der mittleren Fluoreszenz. RD-Faktor ist ein genauer Index als MFI-Wert, da es nicht nur den Unterschied zwischen Proben, sondern auch Konten für die Verbreitung der Daten berechnet. Diese Berechnung ist besonders relevant, wenn Daten aus verschiedenen Experimenten vergleichen im Laufe der Zeit durchgeführt. Einmal das RDs berechnet wurden, empfiehlt die Verwendung eines statistischen Tests bestätigen die Bedeutung der beobachteten Unterschiede zwischen Protein-Varianten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifizieren Sie für Protein Immunodetection das rekombinante Protein-Ebene durch Western-Blot mit ImageJ-Software.<ol>
<li>Vor der Analyse Densitometrie wandeln Sie die ursprünglichen raw-Bilder der entwickelten Membran in JPEG-Datei-Format und Graustufen-Modus.</li>
		<li>Stellen Sie Abschnitt Gesetzt Messungen des Menüs " Analyze " zu Grau Mittelwert.</li>
		<li>Klicken Sie auf das Rechteck -Werkzeug von ImageJ und definieren Sie eine Region of Interest (ROI) mit einer einheitlichen Größe für die Band Densitometrie Analyse zu. Zentrieren Sie jedes Band auf der Membran Bild innerhalb des erstellten rechteckigen Rahmens und notieren Sie die Messung eins nach dem anderen mit STRG + M (Maßbefehl).</li>
		<li>Den lokalen Hintergrund neben jedes Band, Anwendung der gleichen Gegend ROI zu messen. Subtrahieren Sie nach der Messung den entsprechenden lokalen Hintergrund aus jedem einzelnen Band.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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S., Vendrell, J., Avil&#233;s, F. X., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+amyloid+protein+aggregation+and+yeast+survival.">Linking amyloid protein aggregation and yeast survival.</a> Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).</li><li>Conchillo-Sol&#233;, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGGRESCAN:+a+server+for+the+prediction+and+evaluation+of+&amp;#34;hot+spots&amp;#34;+of+aggregation+in+polypeptides.">AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of &amp;#34;hot spots&amp;#34; of aggregation in polypeptides.</a> BMC Bioinformatics. 8, 65 (2007).</li><li>Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+sequence-dependent+and+mutational+effects+on+the+aggregation+of+peptides+and+proteins.">Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins.</a> Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).</li><li>Renner, M., Melki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+prionopathies.">Protein aggregation and prionopathies.</a> Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).</li><li>Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+into+insoluble+deposits+protects+from+oxidative+stress.">Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress.</a> Redox Biology. 12, 699-711 (2017).</li></ol>

Eine Vielzahl von Krankheiten ist die Anhäufung von fehlgefaltete Proteine in zellulären Einlagen6,7,8,33verbunden. Wurden viele Anstrengungen unternommen, um die molekularen Mechanismen zu entwirren, die das Auftreten dieser Krankheiten mit rechnerische Ansätze, die nicht ins Konto proteinkonzentrationen nehmen, auslösen oder in-vitro- Ansätze, in denen die Proteinkonzentration w...

Proteostase ist eine wesentliche Determinante des Zellprozesse Fitness und Alterung. In den Zellen bleibt Protein Homöostase durch anspruchsvolle Protein-Qualitätskontrolle, die Netzwerke zielte darauf ab, sicherzustellen, das richtige umfaltung fehlgefaltete Protein Konformere durch Chaperone und/oder ihre gezielten Proteolyse mit mehreren gut erhaltenen Mechanismen1 ,2,3,4,5. Eine große Anzahl von Studien unterstützen die Verbindung zwischen der Entstehung und Progression von ein breites Spektrum von Erkrankungen des Menschen und das Scheitern der proteostase, führt zu Protein misfolding und Aggregation. Zum Beispiel gilt das Vorhandensein von Proteinablagerungen eine pathologische Gütesiegel von vielen neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und Huntington Krankheiten6,7,8, Prionogenic Krankheiten, und nicht-degenerativen Amyloidosen9. Es wurde vermutet, dass frühe Oligomere und Protofibrillar Baugruppen in der Aggregation Reaktion die wichtigsten spüren der Zytotoxizität sind, aberrante Interaktionen mit anderen Proteinen in den überfüllten zellulären Milieu10Aufbau. Darüber hinaus können Protein Einschlüsse (PI) zwischen den Zellen, verbreiten ihre toxische Wirkung11,12übertragen werden. Daher könnte es sein, dass die Bildung von PI in der Tat einen entgiftenden Mechanismus, der das Vorhandensein von gefährlichen aggregierten Arten zu bestimmten Stellen in der Zelle beschränkt darstellen, wo sie verarbeitet oder angesammelt ohne große Nebenwirkungen 13 , 14.
Standard in-vitro- biochemische Ansätze lieferten wichtige Einblicke in die verschiedenen Arten, die Aggregation Reaktionen und ihre Eigenschaften15,16bevölkern. Jedoch Bedingungen verwendet in diesen Tests unterscheiden sich deutlich von denen, die innerhalb der Zelle und ihre physiologische Bedeutung daher in Frage zu stellen. Aufgrund der bemerkenswerten Erhaltung zelluläre Signalwege wie Protein-Qualitätskontrolle, Autophagie oder die Regulierung der zellulären Redox Zustand17,18 unter Eukaryoten19,20,21 ,22,23, die angehende Hefe Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae) entstanden als privilegierte einfaches zellulären Modell, die molekulare Determinanten der Proteinaggregation zu studieren und seiner zugehörigen zytotoxische Wirkung auf biologisch relevante Umgebungen24,25,26.
Protein Aggregation Neigung ist eine Funktion, die von Natur aus in der primären Sequenz codiert. So kann die Bildung der Amyloid-ähnliche Strukturen vorhergesagt werden, basierend auf die Identifikation und Bewertung der Potenz der Aggregation-Förderung Regionen in Polypeptide27. Trotz des Erfolgs der bioinformatische Algorithmen, die in-vitro- Aggregation-Eigenschaften von Proteinsequenzen vorherzusagen, sind sie jedoch noch lange nicht vorhersagen, wie diese Neigungen in in Vivo zytotoxische Wirkung zu übersetzen. Studien, die die Verbindung zwischen den aggregierten Zustand eines gegebenen Proteins und seiner damit verbundenen Zellschädigung in systematischer Weise ansprechen können helfen, um diese rechnerische Einschränkung zu umgehen. Diese Verbindung ist in der vorliegenden Studie, unter Ausnutzung von einer großen Anzahl von Varianten des β-Amyloid Peptids Aβ42 unterscheiden sich nur in einer einzigen Rückstand, aber Anzeige einen fortlaufenden Bereich von Aggregation Neigungen in Vivo28gerichtet. Insbesondere bezeichnet man ein FC-Ansatz für die Konformationsänderungen Arten entfallen die oxidativen Schäden hervorgerufen durch Aggregation neigen Proteine in Hefezellen zu identifizieren. Die Methode bietet viele Vorteile wie Einfachheit, Hochdurchsatz-Fähigkeit und genaue quantitative Messung. Dieser Ansatz ermöglichte es, dass PI eine schützende Rolle gegen oxidativen Stress spielen zu bestätigen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast cells BY4741&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>201388</td>
			<td>Genotype: MATa his3&#916;1 leu2&#916;0 met15&#916;0 ura3&#916;0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pESC(-Ura) plasmid&#160;</td>
			<td>Agilent Genomics</td>
			<td>217454</td>
			<td>Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0626</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7630</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0750</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3991&#160;</td>
			<td>Solution 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX Deep Red Reagent&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10422</td>
			<td>Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-PER protein extraction reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78990</td>
			<td>Liquid cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6050</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>5000205</td>
			<td>Dye reagent for one-step determination of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-amyloid antibody 6E10&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>803001</td>
			<td>Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1721011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Immobilon-P, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata forte</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WBLUF0100</td>
			<td>Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>657338</td>
			<td>Equipped with a 488&#160;nm blue laser for the detection of GFP, and 635&#160;nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td>Protein transference system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000FC</td>
			<td>Electrophoresis system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the impact of protein aggregation on cellular oxidative stress in yeast

Protein misfolding und Aggregation in Amyloid Konformationen haben an der Entstehung und Progression von mehreren neurodegenerativen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht. Allerdings gibt es noch wenig Informationen über wie unlöslichen Protein Aggregate ihre toxische Wirkung in Vivoausüben. Einfaches Modell der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen, wie Bakterien und Hefen, trugen wesentlich zur unsere gegenwärtigen Verständnis der Mechanismen hinter der intrazellulären Amyloid Bildung, Aggregate Ausbreitung und Toxizität. In diesem Protokoll bezeichnet man die Verwendung von Hefe als ein Modell, um die Beziehung zwischen der Entstehung von Protein-Aggregate und ihre Auswirkungen auf die zellulären oxidativen Stress zu sezieren. Die Methode verbindet die Erkennung der intrazellulären löslich/aggregiert Bundesstaat ein Amyloidogenic Protein mit der Quantifizierung der zellulären oxidativen Schäden, die aus ihren Ausdruck mit Durchflusszytometrie (FC). Dieser Ansatz ist einfach, schnell und quantitative. Die Studie zeigt die Technik durch Korrelation der zellulären oxidativen Stress, verursacht durch eine große Anzahl von Amyloid-β-Peptid-Varianten mit ihren jeweiligen inneren Aggregation Neigungen.

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Sammlung von 20 Varianten des Peptids Aβ42 zu beschäftigen, wo Phe19 auf alle natürliche proteinogene Aminosäuren28mutiert worden ist. Die theoretische Aggregation Neigungen dieser Proteine können mit zwei verschiedenen bioinformatische Algorithmen (AGGRESCAN und TANGO31,32) analysiert werden. In beiden Fällen macht diese Analyse eine progressive Abstufung der Agg...

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Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Bewertung der Auswirkungen der Proteinaggregation auf zellulären oxidativen Stress in der Hefe

Proteinaggregation entlockt zellulären oxidativen Stress. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Überwachung der intrazellulären Staaten von Amyloidogenic Proteinen und den oxidativen Stress zugeordnet werden, mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Der Ansatz dient zur Untersuchung des Verhaltens von löslichen und Aggregation neigende Varianten des β-Amyloid Peptids.

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

evaluation-impact-protein-aggregation-on-cellular-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.2K Aufrufe.  Universitat Autònoma de Barcelona. Proteinaggregation entlockt zellulären oxidativen Stress. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Überwachung der intrazellulären Staaten von Amyloidogenic Proteinen und den oxidativen Stress zugeordnet werden, mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Der Ansatz dient zur Untersuchung des Verhaltens von löslichen und Aggregation neigende Varianten des β-Amyloid Peptids.

Serie: Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Forschung

Biochemie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such systems allows for detailed studies of their underlying mechanisms which would not be feasible in vivo. Here, we provide a protocol for the in vitro reconstitution of the MinCDE system of Escherichia coli, which positions the cell division septum in the cell middle. The assay is designed to supply only the components necessary for self-organization, namely a membrane, the two proteins MinD and MinE and energy in the form of ATP. We therefore fabricate an open reaction chamber on a coverslip, on which a supported lipid bilayer is formed. The open design of the chamber allows for optimal preparation of the lipid bilayer and controlled manipulation of the bulk content. The two proteins, MinD and MinE, as well as ATP, are then added into the bulk volume above the membrane. Imaging is possible by many optical microscopies, as the design supports confocal, wide-field and TIRF microscopy alike. In a variation of the protocol, the lipid bilayer is formed on a patterned support, on cell-shaped PDMS microstructures, instead of glass. Lowering the bulk solution to the rim of these compartments encloses the reaction in a smaller compartment and provides boundaries that allow mimicking of in vivo oscillatory behavior. Taken together, we describe protocols to reconstitute the MinCDE system both with and without spatial confinement, allowing researchers to precisely control all aspects influencing pattern formation, such as concentration ranges and addition of other factors or proteins, and to systematically increase system complexity in a relatively simple experimental setup.

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

We provide a protocol for in vitro self-organization assays of MinD and MinE on a supported lipid bilayer in an open chamber. Additionally, we describe how to enclose the assay in lipid-clad PDMS microcompartments to mimic in vivo conditions by reaction confinement.

In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

Untersuchung der Dynamik der zellulären Adhäsion und Ausbreitung von Epithelzellen auf Fibronectin während oxidativen Stresses

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

Beurteilung der Submitochondrialen Proteinlokalisation in angehender Hefe Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...