1. S. cerevisiae 문화와 단백질 표정
참고: Aβ 변종 전시 Aβ42 펩 티 드 (그림 1A)의 위치 19 (Phe19)에서 단일 잔류물에 돌연변이 인해 다른 상대 집계 경향. 이 펩 티 드 이체는 녹색 형광 단백질 (GFP), 집계 기자 (그림 1)29역할으로 태그 됩니다.
<ol><li>플라스 미드 BY4741 부모의 배경 (타 그의3Δ1 레이2Δ0 만난15Δ0 ura3Δ0)30효 모 세포로 20 Aβ42-GFP 변종에 대 한 인코딩 변환. 각 플라스 미드 GSSGSSG 링커에 의해 GFP를 융합 하는 Aβ42 돌연변이 인코딩합니다. 플라스 미드는 pESC(-URA) 이며 선택 가능한 마커 URA329를 포함.<ol>
<li>다음 구성 요소와 uracil (사우스 캐롤라이나-우 라) 없이 합성 완전 한 매체 준비: 1.9 g/L 효 질소 uracil, 5 g/L 황산 암모늄과 900 mL ddH2O의 기본 20% (w/v) 포도 당 100ml와 결합.</li>
		<li>2% 포도 당을 포함 하는 SC-우 라 중간의 20 mL로 변형 된 효 모 세포에의 한 식민지를 넣고 하룻밤 동요 210 rpm에서 30 ° C에서 문화를 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 날, 신선한 SC-우 라 중간의 5 mL에 접종 100 µ L의 숙박 문화에 의해 새로운 효 모 세포 배양 성장.</li>
	<li>에는 OD590 0.5, 원심 4 분 3000 x g에서 문화, 상쾌한, 삭제 고 resuspend 동일한 양의 신선한 SC-우 라 중 2% 유를 포함 하는 셀.</li>
	<li>30 분 동안 210 rpm 동요에서 30 ° C에서 품 어. 그리고 4 분 3000 x g에서 세포를 원심는 상쾌한을 삭제 합니다. 재조합 형 단백질 표정 유도 2% 갈 락 토스를 포함 하는 신선한 SC-우 라 매체에 셀 resuspend</li>
	<li>단백질 표정 2% 갈 락 토스를 포함 하는 사우스 캐롤라이나-우 라 중간에 유도의 16 h 후 4 분 3000 x g에서 원심 분리 하 여 살 균 microcentrifuge 관에 유도 세포의 1 mL를 수확. 참고: 가장 관련성이 높은 차이 발생 후 Aβ42 GFP 변종 표현 16 h. 유도 효 모 세포의 유도 기간 형광 현미경 검사 법 (그림 2B) 셀 안에 재조합 단백질 분포를 결정 하 여 구상 될 수 있다.</li>
</ol>2. 세포 얼룩
참고: 신선한 비 유발 세포는 FC 분석 동안 형광 임계값을 설정 하는 부정적인 컨트롤으로 구성 해야 합니다.
<ol><li>16 h 유발 효 모 세포를가지고 고 590에서 그들의 광학 밀도 결정 nm (OD590). 0.1의 OD590 를 버퍼링 하는 멸 균 인산 염 분 (PBS)에 그들을 희석.<ol>
<li>버퍼링 인산 염 분 x 1을 다음과 같이 준비: NaCl, KCl, 나2HPO4, 1.44 g의 0.2 g의 8 g을 추가 하 고 KH2포4 ddH2오의 800 mL의 0.24 g pH 7.4에 조정 후 1 L ddH2O의 솔루션 작성 HCl. 버퍼 0.2 µ m 필터를 통해 필터링.</li>
	</ol>
</li>
	<li>레이블이 표시 된 튜브 (12 × 75 m m 라운드 하단 폴리스 티 렌)을 표현 하는 세포 정지를 전송 하 고 빛에서 그들을 보호. 그들은 비 유도 및 비-얼룩진 셀 함께 분석에 대 한 교류 cytometer에 로드할 준비가 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>5 µ M의 최종 농도에 각 샘플을 (예를 들어, CellROX 딥 레드) 산화 스트레스 프로브를 추가 하 고 어둠 속에서 30 분 동안 30 ° C에 세포를 품 어.</li>
	<li>부 화, 후 셀 1 x PBS로 3 회 세척 하 고 FC 그들의 분석 전에 버퍼의 동일한 볼륨에 그들을 resuspend.</li>
</ol>3. 교류 Cytometry 분석
참고: 적절 한 레이저와 필터는 FC 설치를 사용 하 여 GFP와 산화 스트레스 프로브 형광 신호를 감지. 교류 cytometer GFP의 발견을 위한 488 nm 청색 레이저와 산화 스트레스 프로브 형광의 탐지를 위한 635 nm 빨간 레이저를 사용할 수 있습니다. GFP와 산화 스트레스 프로브 방출 형광의 인수는 각각 530/30 nm BP 필터와 660/20 BP 필터 수행 (표 1).
<ol><li>새 워크시트 패널 열기 에 클릭 하 고 다음 인수 점 플롯을 만들.<ol>
<li>도구 모음에서 분산형 플롯 도구 를 선택 하 고 A를 만들기 음모 쪽 분산형-지역 변수 (SSC-)는 y 축 대 앞으로 피해 지역에 (FSC-A)는 x 축에 선형 눈금에.</li>
		<li>도구 모음에서 분산형 플롯 도구 를 클릭 하 고 x 축 대에 변수 FL1 지역 (FITC)와 음모를 만들. FL3 지역 (APC)는 y 축에 로그 눈금.</li>
	</ol>
</li>
	<li>악기 설정 아이콘을 클릭 합니다. 보상 탭을 클릭 하 고 모든 보상 수준을 설정 합니다. 인수 탭에서 클릭 하 고 기록 20000 이벤트의 총 수를 선택 합니다.</li>
	<li>유량 아이콘 낮은흐름 속도 전환 하려면 클릭 합니다.</li>
	<li>취득 탭 비 유도, 흠 없는 세포 실행 시작을 클릭 하 고 인구 중간 왼쪽 사분면에 배포 될 때까지 측면 분산형 및 앞으로의 악기 설정 에서 전압을 조정 합니다.<ol>
<li>다각형 아이콘 세포 인구 세포 파편을 제외 하 고 주변 지역 R1 설정을 클릭 하 고이 문이 인구 p 1을 사용 하 여 모든 형광 점 플롯과 히스토그램 표시 (그림 3)에 대 한 R1 =.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 신호의 PMT 전압을 조정 하려면 셀 낮은 왼쪽된 사분면에 배포 될 때까지 튜닝 악기 설정 탭에서 이득 FL1 FL3 점 플롯에 흠 없는 셀을 실행 합니다.</li>
	<li>GFP 형광을 측정 하는 유도 셀에 샘플을 변경 합니다. 악기 설정 탭에서 인구 오른쪽 아래 사분면에 배포 될 때에는 FSC-A 대 FL1 (FITC) 이득을 설정 합니다. 게이트 (게이트 P2) 긍정적인 세포 인구를 정의 합니다.</li>
	<li>변경 샘플 비 유발 산화 스트레스는 FSC-A 대 FL3 (APC) 도트 음모에 형광으로 표시 하려면 셀 스테인드. 튜닝 이득 셀 인구는 왼쪽 위 사분면에서 배 부 될 때까지. P3에 긍정적인 세포 인구 게이트입니다.</li>
	<li>확인을 셀 형광을 나타내는 히스토그램 아이콘 두 히스토그램 플롯 합니다. 형광 강도 나타내는 FL1 (FITC) GFP 형광을 나타내는 x 축, 이며 FL3 (APC) 형광을 나타내는 y에 로그 눈금에 P2 및 P3 인구를 각각 적용 있는지 확인 합니다. 참고: 막대 그래프 오버레이 다른 Aβ 이체를 표현 하는 셀의 형광 프로필 간의 차이 설명 하기 위해 좋은 방법입니다.</li>
</ol>4. 재조합 단백질 Immunodetection
<ol><li>단백질 표정 수준 결정, 16 h에 대 일 분, 4000 x g에서 원심 분리에 의해 유도 된 효 모 배양 수확을-80 ° c.에 셀 펠 릿 저장<ol>
<li>PBS에 16 h에 대 한 재조합 단백질을 표현 하는 수집 된 셀 resuspend 20의 OD590 를 각 Aβ42 GFP 돌연변이의 200 µ L 셀 정지를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>총 단백질 분수 분석에 대 일 분 14000 x g에서 원심 분리 하 여 각 돌연변이의 100 µ L를 수확 하 고 효 모 세포의 용 해 버퍼 Y의 동일한 볼륨에 셀 펠 릿 resuspend-(50 mM Tris HCl pH 8.0, 1 %DMSO, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA 10 mg/mL SB3-14 (myr 포함 된 당 istyl sulfobetaine) 보충 1 m m phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF)).<ol>
<li>온화한 동요에서 실 온에서 20 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bradford 분석 실험을 사용 하 여 단백질 추출 농도 결정 합니다. 15% 아크릴 SDS 페이지 젤 전기 이동 법에 60 분 100 V에서 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막에 오 각 샘플의 단백질 추출의 최대 5 µ g를 로드 합니다.<ol>
<li>브래드 퍼 드 Coomassie 화려한 블루 G-250의 100 밀리 그램으로 시 약 50ml 95% 에탄올에에서 용 해 하 고 85% (w/v) 인산의 100ml를 추가 준비. 다음, 염료 해산 완전히 ddH2O 1 l 혼합물을 희석 하 고 그냥 사용 하기 전에 셀 루 로스 필터 종이 통해 필터링. 참고: 브래드 퍼 드 시 해야 될 빛 갈색.</li>
		<li>소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 브래드포드 시 약 1000 µ L에서 단백질의 5-100 µ g에서 배열의 표준 준비.</li>
		<li>1-10 µ L 단백질의 브래드포드 시의 1 mL에 추출 하 고 품 어 5 분 동안 실내 온도에 혼합물을 추가 합니다.</li>
		<li>표준과 마약595에서 단백질 추출 물 샘플의 흡 광도 측정 한다.</li>
		<li>분석을 위해 표준 대에 대 한 얻은 흡 광도 값으로 음모를 확인 합니다. 단백질의 µ g입니다. 표준 곡선에 따라 달라 집니다, 있는 경우 볼륨 및 희석, 고려는 양의 단백질에서 원래 샘플의 농도 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>린스 Tris 버퍼 염 분 (TBS), x 1 막 0.1% Tween 20 (TTBS), 1 x TTBS의 5% (w/v) 무 지방 건조 우유를 사용 하 여 차단 하 고.<ol>
<li>10 x TBS의 1 리터를 준비 하려면 기본 트리 스의 24 g와 H2Odd 900 mL에 NaCl의 88 g을 녹이 고 pH 7.6 조정. DdH2O l. 1의 최종 볼륨을 추가 10 x 재고 1 일부 ddH2o.의 9 부분 혼합 1 x 솔루션에 대 한</li>
	</ol>
</li>
	<li>기본 β 아 밀 로이드 항 체 희석 6E10 1:1,000와 함께 1 시간에 대 한 막 품 어 그리고 이차 항 체 염소와 실 온에서 1 h에 대 한 반대로 마우스 IgG HRP 공액 희석 1:10, 000.</li>
	<li>막 Luminata 형광 시 약의 1 mL를 사용 하 여 개발 및 단계 5.2에서에서 설명한 densitometric 분석 하 여 밴드를 계량 합니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>FC에서 얻은 데이터를 분석 하려면 표시 의미 형광 강도 (MFI) 테이블을 만듭니다와 그 해당 표준 오류 또는 GFP 형광 및 산화 스트레스 수준에 대 한 차이 (CV)의 계수 중간 형광.<ol>
<li>관리자 탭 및 통계 아이콘 각 채널에 필요한 통계 데이터를 사용자 지정을 클릭 합니다. 참고: 비교할 때 단백질 이체, 접이식 배경 또는 해상도 통계 (RD)에 형광 값 데이터 변환: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57470/57470eq1.jpg"> 이 통계에서 평균 샘플 문제 샘플의 평균 형광, 평균 컨트롤은 컨트롤을 사용 하는 셀의 평균 형광 이며 SD는 평균 형광의 표준 편차. RD 요소 MFI 값 보다 더 정확한 인덱스는 그것 뿐만 아니라 샘플 뿐만 아니라 데이터의 확산을 위한 계정 사이의 차이 계산 합니다. 이 계산은 시간이 지남에 수행 다른 실험 데이터를 비교 하는 때 특히 적합 합니다. 일단는 RDs를 계산 통계 시험의 사용은 단백질 이체의 관찰 된 차이점의 중요성을 확인 하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단백질 immunodetection에 대 한 재조합 단백질 수준 서쪽 오 점 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 계량.<ol>
<li>Densitometry 분석 하기 전에 개발 된 막의 원래 raw 이미지를 JPEG 파일 형식와 회색조 모드 변환.</li>
		<li>회색값 의미 분석 메뉴의 설정 측정 섹션을 조정 합니다.</li>
		<li>ImageJ에서 사각형 도구를 클릭 하 고 밴드 densitometry 분석에 대 한 일관 된 크기와 관심 (ROI)의 영역을 정의. 만든된 사각형 프레임 안에 막 이미지에 각 밴드 센터 고 측정 Ctrl + M (측정 명령)를 사용 하 여 하나 하나를 기록 합니다.</li>
		<li>동일한 투자 수익 영역을 적용 하는 각 밴드에 인접 한 로컬 백그라운드를 측정 합니다. 측정 후 각각의 개별 밴드에서 해당 로컬 백그라운드를 뺍니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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S., Vendrell, J., Avil&#233;s, F. X., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+amyloid+protein+aggregation+and+yeast+survival.">Linking amyloid protein aggregation and yeast survival.</a> Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).</li><li>Conchillo-Sol&#233;, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGGRESCAN:+a+server+for+the+prediction+and+evaluation+of+&amp;#34;hot+spots&amp;#34;+of+aggregation+in+polypeptides.">AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of &amp;#34;hot spots&amp;#34; of aggregation in polypeptides.</a> BMC Bioinformatics. 8, 65 (2007).</li><li>Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+sequence-dependent+and+mutational+effects+on+the+aggregation+of+peptides+and+proteins.">Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins.</a> Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).</li><li>Renner, M., Melki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+prionopathies.">Protein aggregation and prionopathies.</a> Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).</li><li>Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+into+insoluble+deposits+protects+from+oxidative+stress.">Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress.</a> Redox Biology. 12, 699-711 (2017).</li></ol>

다양 한 질병 세포 예금6,,78,33으로 misfolded 단백질의 축적에 연결 된다. 많은 노력 계정 단백질 농도를 고려 하지 않습니다, 계산 방법을 사용 하 여 이러한 질병의 발병을 트리거하는 분자 메커니즘을 해명 되었습니다 또는 생체 외에서 접근, 어떤 단백질 농도 반응 동안 상수 남아 있습니다. 그...

Proteostasis 셀 체력과 노화 프로세스의 근본적인 결정 이다. 셀, 네트워크는 올바른 refolding misfolded 단백질 conformers의 보호자 또는 그들의 타겟된 베이스로 몇 가지 잘 보존 메커니즘1 보장 하기 위한 정교한 단백질 품질 관리에 의해 단백질 항상성 유지 ,2,3,,45. 연구의 많은 발병과 인간의 질병의 광범위 한 범위와 proteostasis, 단백질 misfolding 및 집계의 실패의 진행 사이의 링크에 지원을 제공 합니다. 예를 들어, 단백질 예금의 존재는 많은 신경 퇴행 성 질환, 알츠하이머병, 파 킨 슨 병, 등, 헌팅턴의 질병6,7,8의 병 적인 특징을 간주 됩니다. prionogenic 질병, 고 퇴행 성 비 amyloidoses9. 그것은 집계 반응에서 초기 oligomeric 및 protofibrillar 어셈블리 붐비는 셀룰러 환경10다른 단백질 들과 탈 선 상호 작용을 설정 하는 세포 독성의 주요 elicitors는 건의 되었다. 또한, 전파 하는 그들의 독성 효과11,12셀 사이의 단백질 포함 (PI)를 전송할 수 있습니다. 따라서, PI의 대형 셀, 어디 처리 될 수 있다 또는 주요 부작용 없이 축적에서 특정 위치에 위험한 집계 된 종의 존재를 제한 하는 해독 메커니즘 구성 실제로 수 있습니다. 수 있습니다. 13 , 14.
표준 체 외에서 생 화 확 적인 접근 집계 반응와 그들의 속성15,16종에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 했다. 그러나, 이러한 분석 실험에서 사용 하는 조건 셀 내에 발생 하는 명확 하 게 다른 있으며, 따라서 그들의 생리 적인 관련성 질문. 세포질 통로 단백질 품질 관리, autophagy, 진핵생물19,20,21 중 세포질 산화 환 원 상태17,18 의 규제 등의 주목할 만한 절약 때문에 ,,2223, 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 단백질 집단의 분자 결정 요인 연구 특권 간단한 세포 모델 나왔다 그리고 생물학으로 관련 환경24,,2526에 관련 된 세포 독성 영향.
단백질 집계 성향 본질적으로 기본 순서로 인코딩 기능입니다. 따라서, 아 밀 로이드 같은 구조의 형성 예측할 수 있습니다 식별 및 집계 추진의 힘의 평가에 따라 지역 polypeptides27에. 그러나, 예측 단백질 시퀀스의 생체 외에서 집계 속성 bioinformatic 알고리즘의 성공에도 불구 하 고 그들은 여전히 이러한 경향 vivo에서 세포 독성 영향으로 번역 하는 어떻게 예측까지 있습니다. 체계적인 방식으로 주어진된 단백질의 집계 상태 및 그것의 관련 된 세포 손상을 사이 연결 하는 연구는 전산이 한계를 우회 하는 데 도움이 있습니다. 이 연결은 현재 연구, 아 밀 로이드 β 펩 티 드 Aβ42 단일 잔류물에만 서로 다른 하지만 집계 경향 vivo에서28의 연속 범위 표시의 이체의 큰 세트의 활용에서 해결 됩니다. 특히, 구조적 종 효 모 세포에서 집계 하기 쉬운 단백질에 의해 elicited 산화 손상에 대 한 회계를 식별 하는 FC 기반 접근 방식을 설명 합니다. 방법론에는 단순, 높은 처리 능력, 그리고 정확한 양적 측정 등 많은 이점을 제공합니다. 이 방법은 PI 놀이 산화 스트레스에 대 한 보호 역할을 확인 가능 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast cells BY4741&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>201388</td>
			<td>Genotype: MATa his3&#916;1 leu2&#916;0 met15&#916;0 ura3&#916;0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pESC(-Ura) plasmid&#160;</td>
			<td>Agilent Genomics</td>
			<td>217454</td>
			<td>Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0626</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7630</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0750</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3991&#160;</td>
			<td>Solution 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX Deep Red Reagent&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10422</td>
			<td>Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-PER protein extraction reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78990</td>
			<td>Liquid cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6050</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>5000205</td>
			<td>Dye reagent for one-step determination of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-amyloid antibody 6E10&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>803001</td>
			<td>Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1721011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Immobilon-P, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata forte</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WBLUF0100</td>
			<td>Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>657338</td>
			<td>Equipped with a 488&#160;nm blue laser for the detection of GFP, and 635&#160;nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td>Protein transference system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000FC</td>
			<td>Electrophoresis system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the impact of protein aggregation on cellular oxidative stress in yeast

단백질 misfolding 및 녹말 체 conformations로 집계 발병 및 여러 신경 퇴행 성 질환의 진행에 관련 되어있다. 그러나, 여전히 약간의 정보는 어떻게 불용 성 단백질에 대 한 집계는 그들의 독성 효과 비보를 발휘. 단순 간결한 및 진 핵 모형 유기 체, 박테리아와 효 모, 등 세포내 녹말 체 형성, 집계 전파 및 독성 뒤에 있는 메커니즘의 우리의 현재 이해에 크게 기여 했다. 이 프로토콜에서 효를 사용 하 여 단백질의 형성 및 세포질 산화 스트레스에 미치는 영향 관계를 해 부 모델로 설명 합니다. 메서드는 amyloidogenic 단백질의 세포내 수용 성/집계 상태 감지 세포 산화 손상 cytometry (FC)을 사용 하 여 식에서 결과의 정량화 결합 합니다. 이 방법은 간단 하 고 빠르며, 양적입니다. 연구는 그들의 각각 고유한 집계 경향으로 아 밀 로이드 β 펩 티 드 이체의 큰 세트에 기인한 세포질 산화 스트레스를 연관 하 여 기법을 보여 줍니다.

이 프로토콜 어디 Phe19은 모든 자연 proteinogenic 아미노산28변경 되었습니다 Aβ42 펩 티 드의 20 이체의 컬렉션을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 이 단백질의 이론적인 집계 경향 두 다른 bioinformatic 알고리즘 (AGGRESCAN와 탱고31,32)를 사용 하 여 분석할 수 있습니다. 두 경우 모두에서이 분석 집계 추세, ascribing, 일반?...

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Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

효 모 세포 산화 스트레스에 단백질 집단의 영향 평가

단백질 집계 세포 산화 스트레스 elicits. 이 프로토콜 amyloidogenic 단백질의 세포내 주와 관련 된, cytometry 사용 하 여 산화 스트레스 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 접근은 아 밀 로이드 β 펩 티 드의 가용성과 집계 경향이 이체의 동작을 연구 하는 데 사용 됩니다.

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

evaluation-impact-protein-aggregation-on-cellular-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.2K 조회수.  Universitat Autònoma de Barcelona. 단백질 집계 세포 산화 스트레스 elicits. 이 프로토콜 amyloidogenic 단백질의 세포내 주와 관련 된, cytometry 사용 하 여 산화 스트레스 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 접근은 아 밀 로이드 β 펩 티 드의 가용성과 집계 경향이 이체의 동작을 연구 하는 데 사용 됩니다.

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Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such systems allows for detailed studies of their underlying mechanisms which would not be feasible in vivo. Here, we provide a protocol for the in vitro reconstitution of the MinCDE system of Escherichia coli, which positions the cell division septum in the cell middle. The assay is designed to supply only the components necessary for self-organization, namely a membrane, the two proteins MinD and MinE and energy in the form of ATP. We therefore fabricate an open reaction chamber on a coverslip, on which a supported lipid bilayer is formed. The open design of the chamber allows for optimal preparation of the lipid bilayer and controlled manipulation of the bulk content. The two proteins, MinD and MinE, as well as ATP, are then added into the bulk volume above the membrane. Imaging is possible by many optical microscopies, as the design supports confocal, wide-field and TIRF microscopy alike. In a variation of the protocol, the lipid bilayer is formed on a patterned support, on cell-shaped PDMS microstructures, instead of glass. Lowering the bulk solution to the rim of these compartments encloses the reaction in a smaller compartment and provides boundaries that allow mimicking of in vivo oscillatory behavior. Taken together, we describe protocols to reconstitute the MinCDE system both with and without spatial confinement, allowing researchers to precisely control all aspects influencing pattern formation, such as concentration ranges and addition of other factors or proteins, and to systematically increase system complexity in a relatively simple experimental setup.

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

We provide a protocol for in vitro self-organization assays of MinD and MinE on a supported lipid bilayer in an open chamber. Additionally, we describe how to enclose the assay in lipid-clad PDMS microcompartments to mimic in vivo conditions by reaction confinement.

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

세포 부착의 역학 을 검사 하 고 산화 스트레스 동안 Fibronectin에 상피 세포의 확산

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...