1. S. cerevisiae culture e l'espressione della proteina
Nota: Varianti Aβ presentano propensioni di aggregazione relativo diversi a causa di una mutazione in un singolo residuo alla posizione 19 (Phe19) del peptide Aβ42 (Figura 1A). Queste varianti del peptide sono contrassegnate con la proteina fluorescente verde (GFP), che agisce come un'aggregazione reporter (Figura 1)29.
<ol><li>Trasformare i plasmidi codifica per 20 varianti di Aβ42-GFP in cellule di lievito con un BY4741 sfondo parentale (MATa sua3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)30. Ogni plasmide codifica per un mutante di Aβ42 fuso alla GFP da un linker GSSGSSG. I plasmidi sono pESC(-URA) e comprendono il marcatore selezionabile URA329.<ol>
<li>Preparare il supporto completo sintetico senza uracile (SC-URA) con i seguenti componenti: 1,9 g/L azoto lievito base senza uracile, 5 g/L di solfato di ammonio e 900 mL di ddH2O combinato con 100 mL di glucosio 20% (p/v).</li>
		<li>Mettere una colonia delle cellule del lievito trasformato in 20 mL di terreno SC-URA contenente 2% di glucosio e far crescere le colture durante la notte a 30 ° C sotto agitazione a 210 giri/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Il giorno successivo, crescere nuove culture di cellule di lievito inoculando 100 µ l della coltura durante la notte in 5 mL di terreno nuovo SC-URA.</li>
	<li>A un OD590 di 0,5, centrifugare le culture a 3.000 x g per 4 minuti, eliminare il supernatante e risospendere le cellule nello stesso volume di terreno nuovo SC-URA contenente 2% raffinosio.</li>
	<li>Incubare a 30 ° C sotto agitazione a 210 giri/min per 30 min. Centrifugare le cellule a 3.000 x g per 4 minuti, quindi eliminare il supernatante. Risospendere le cellule in mezzo SC-URA fresco contenente 2% galattosio per indurre l'espressione di proteine ricombinanti.</li>
	<li>Dopo 16h di indurre l'espressione della proteina in mezzo SC-URA contenente 2% galattosio, vendemmia 1 mL di cellule indotte in microcentrifuga sterile per centrifugazione a 3.000 x g per 4 min. Nota: Le differenze più rilevanti si verificano dopo un periodo di induzione di cellule di lievito indotto 16 h. esprimendo la varianti di Aβ42-GFP possa essere visualizzato da microscopia di fluorescenza per determinare la distribuzione della proteina ricombinante all'interno delle cellule (Figura 2B).</li>
</ol>2. cellula di colorazione
Nota: Cellule fresche indotto non sono necessari come controllo negativo per stabilire una soglia fluorescente durante un'analisi FC.
<ol><li>Prendere le cellule di lievito indotta da h 16 e determinare la densità ottica a 590 nm (OD590). Diluirli in una soluzione salina tamponato fosfato sterile (PBS) a un OD590 di 0.1.<ol>
<li>Preparare 1 x tamponato fosfato salino come segue: aggiungere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4, e 0,24 g di KH2PO4 a 800 mL di ddH2O. riempire la soluzione fino a 1 L di ddH2O dopo aver regolato il pH 7.4 con HCl. filtrare il buffer su un filtro di 0,2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire le sospensioni delle cellule che esprimono adeguatamente etichettate provette (polistirolo mm turno-fondo di 12 × 75) e proteggerli dalla luce. Assicurarsi che sono pronti per essere caricati sul citometro a flusso per l'analisi, insieme alle cellule indotto non e non tinto.</li>
	<li>Aggiungere la sonda di stress ossidativo (ad es., CellROX profondo rosso) per ogni campione a una concentrazione finale di 5 µM e incubare le cellule a 30 ° C per 30 min al buio.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, lavare le cellule 3 volte con 1x PBS e risospendere li nello stesso volume del buffer prima di loro analisi di FC.</li>
</ol>3. analisi di citometria a flusso di
Nota: Utilizzare un'installazione FC con laser appropriato e filtri per rilevare GFP e segnale di fluorescenza sonda di stress ossidativo. Può essere utilizzato un citometro a flusso dotato di un laser di 488 nm blu per la rilevazione di GFP e un laser 635 nm rosso per la rilevazione della fluorescenza di sonda di stress ossidativo. Acquisizione di fluorescenza emissione di GFP e stress ossidativo sonda viene eseguita con un 530/30 nm BP e un filtro di BP di 660/20, rispettivamente (tabella 1).
<ol><li>Fare clic su Nuovo foglio di lavoro aperto Pannello e creare le seguenti trame di puntino di acquisizione.<ol>
<li>Selezionare lo Scatter Plot strumento dalla barra degli strumenti e creare una trama con le variabili zona Side Scatter (SSC-A) sull'asse y vs Forward Scatter-Area (FSC-A) in una scala lineare sull'asse x.</li>
		<li>Fare clic sullo Scatter Plot strumento dalla barra degli strumenti e creare una trama con le variabili FL1-Area (FITC) sul asse x vs. FL3-Area (APC) in una scala logaritmica sull'asse y.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare clic sull'icona Strumenti impostazioni . Fare clic sulla scheda compensazione e impostare tutti i livelli di compensazione. Fare clic sulla scheda di acquisizione e selezionare un numero totale di 20.000 eventi da registrare.</li>
	<li>Fare clic sull'icona di Portata per passare la portata a bassa.</li>
	<li>Fare clic sulla scheda Acquisisci per avviare l'esecuzione le cellule non-indotta, non macchiate e regolare la tensione nell' Impostazioni dello strumento di avanti e dispersione di lato fino a quando la popolazione è distribuita nel quadrante centrale a sinistra.<ol>
<li>Fare clic sull'icona del poligono per impostare una regione R1 intorno la popolazione delle cellule escluse detriti cellulari e utilizzare questa popolazione gated P1 = R1 per tutte le trame puntino fluorescente e rappresentanze di istogramma (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per regolare la tensione PMT del segnale di fluorescenza, eseguire le cellule senza macchiate nella trama FL1-FL3 dot, tuning il guadagno nella scheda di Impostazione dello strumento , fino a quando le cellule sono distribuite nel quadrante inferiore sinistro.</li>
	<li>Cambiare il campione per le cellule indotte per misurare la fluorescenza di GFP. Nella scheda Impostazione dello strumento , è necessario impostare il guadagno nella FSC-A vs FL1 (FITC) quando la popolazione è distribuita nel quadrante inferiore destro. Definire la popolazione di cellule positive con un cancello (cancello P2).</li>
	<li>Cambiamento del campione indotto non macchiato celle per visualizzare lo sforzo ossidativo dalla fluorescenza su un terreno di dot FSC-A vs FL3 (APC). Sintonizzare il guadagno fino a che la popolazione delle cellule è distribuita nel quadrante superiore sinistro. Porta la popolazione cellulare positiva nel P3.</li>
	<li>Fare due appezzamenti di istogramma con l'icona di istogramma per rappresentare la fluorescenza delle cellule. Per rappresentare l'intensità di fluorescenza, assicurarsi FL1 (FITC) che rappresenta la fluorescenza di GFP è nell'asse x e FL3 (APC) che rappresenta la fluorescenza è nell'asse y, l'applicazione di popolazioni P2 e P3 su una scala logaritmica, rispettivamente. Nota: Istogramma sovrapposizioni sono un buon modo per illustrare le differenze tra i profili di fluorescenza delle cellule che esprimono diverse varianti Aβ.</li>
</ol>4. Immunodetection recombinant della proteina
<ol><li>Per determinare i livelli di espressione della proteina, raccogliere le colture di lievito indotte per 16 h mediante centrifugazione a 4.000 x g per 6 min e conservare il pellet di cellule a-80 ° C.<ol>
<li>Risospendere le cellule raccolte che esprimono la proteina ricombinante per 16 h in PBS. Preparare sospensioni cellulari di 200 µ l di ogni mutante di Aβ42-GFP a un OD590 di 20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per l'analisi di frazione della proteina totale, 100 µ l di ogni mutante della raccolta mediante centrifugazione a 14.000 x g per 20 min e risospendere il pellet cellulare nello stesso volume di tampone di lisi del lievito Y-a (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1% DMSO, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA contenente 10 mg/mL SB3-14 (myr istyl solfobetaina) completati con 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF)).<ol>
<li>Incubare i campioni per 20 min a temperatura ambiente sotto lieve agitazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinare la concentrazione di Estratto di proteine usando l'analisi di Bradford. Caricare fino a 5 µ g di estratto proteico di ogni campione su un gel di elettroforesi SDS-PAGE 15% di acrilammide e macchia su una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) a 100 V per 60 min.<ol>
<li>Preparare un Bradford reagente con 100 mg di Coomassie Brilliant Blue G-250 disciolto in 50 mL di etanolo al 95% e aggiungere 100 mL di acido fosforico 85% (p/v). Poi, quando il colorante è completamente sciolto, stemperate il composto con ddH2O a 1 L e filtrare attraverso carta da filtro cellulosa appena prima dell'uso. Nota: Il reagente di Bradford dovrebbe essere marrone chiaro.</li>
		<li>Preparare un standard di albumina di siero bovino (BSA) che vanno da 5-100 µ g di proteina in 1.000 µ l del reagente Bradford.</li>
		<li>Aggiungere 1-10 µ l di proteina estrarre a 1 mL di reattivo di Bradford e incubare la miscela a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Misurare l'assorbanza dei campioni e la proteina estrarre campioni OD595.</li>
		<li>Per l'analisi, fare una trama con i valori di assorbanza ottenuti per il standard vs. µ g di proteina. Sulla curva standard, determinare le concentrazioni dei campioni originali dalla quantità di proteine, considerando il volume e la diluizione, se presente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risciacquare la membrana con 1x Tris-buffered saline (TBS), 0.1% Tween 20 (Immunotyping) e bloccarlo utilizzando latte in polvere senza grassi 5% (p/v) in 1 x TTBS.<ol>
<li>Per preparare 1 L di 10 x TBS, sciogliere 24 g di Tris base e 88 g di NaCl in 900 mL di H2Odd e regolare il pH a 7,6. Aggiungere ddH2O ad un volume finale di 1 L. Per una soluzione 1x, miscelare 1 parte di stock x 10 con 9 parti di ddH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare la membrana per 1 h con un anticorpo primario di β-amiloide 6E10 diluito 1:1,000 e per 1 h a temperatura ambiente con una capra di anticorpo secondario coniugato IgG-HRP anti-topo diluito 01:10, 000.</li>
	<li>Sviluppare le membrane con 1 mL di reagente fluorescente Luminata e quantificare le bande di analisi densitometrica come descritto al punto 5.2.</li>
</ol>5. analisi dei dati
<ol><li>Per analizzare i dati ottenuti da FC, creare una tabella che mostra l'intensità di fluorescenza media (MFI) e mediana fluorescenza con relativo errore standard corrispondenti e/o il coefficiente di variazione (CV) per fluorescenza GFP e livelli di stress ossidativo.<ol>
<li>Fare clic sulla scheda "Impostazioni" e l'icona di statistiche per personalizzare i dati statistici necessari per ogni canale. Nota: Quando si confrontano le varianti della proteina, convertire dati dei valori di fluorescenza in uno sfondo di piega o metrica ad alta risoluzione (RD): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57470/57470eq1.jpg"> In questa metrica, il campione medio è la media di fluorescenza di campioni di problema, il controllo medio è la media di fluorescenza delle cellule usate come controllo e la SD è la deviazione standard della media di fluorescenza. Fattore di RD è un indice più accurato rispetto valore MFI non solo calcola la differenza tra i campioni, ma anche gli account per la diffusione dei dati. Questo calcolo è specificamente rilevante quando il confronto dei dati provenienti da diversi esperimenti effettuati nel corso del tempo. Una volta sono stati calcolati il RDs, l'uso di un test statistico è consigliabile confermare il significato delle differenze osservate tra varianti della proteina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per proteina immunodetection, quantificare i livelli di proteina ricombinante mediante Western blot utilizzando software ImageJ.<ol>
<li>Prima dell'analisi densitometria, convertire le immagini raw originale della membrana sviluppata in modalità di scala di grigi e il formato di file JPEG.</li>
		<li>Regolare la sezione Impostare misure di menu analizza a Dire valore di grigio.</li>
		<li>Fare clic sullo strumento rettangolo da ImageJ e definire un'area di interesse (ROI) con una dimensione coerente per l'analisi di densitometria di banda. Centro di ciascuna banda sull'immagine della membrana all'interno della cornice rettangolare creata e registrare la misurazione uno utilizzando Ctrl + M (il comando di misurazione).</li>
		<li>Misurare lo sfondo locale adiacente per ogni banda, applicando la stessa area ROI. Dopo la misurazione, sottrarre lo sfondo locale corrispondente da ogni banda individuo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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S., Vendrell, J., Avil&#233;s, F. X., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+amyloid+protein+aggregation+and+yeast+survival.">Linking amyloid protein aggregation and yeast survival.</a> Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).</li><li>Conchillo-Sol&#233;, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGGRESCAN:+a+server+for+the+prediction+and+evaluation+of+&amp;#34;hot+spots&amp;#34;+of+aggregation+in+polypeptides.">AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of &amp;#34;hot spots&amp;#34; of aggregation in polypeptides.</a> BMC Bioinformatics. 8, 65 (2007).</li><li>Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+sequence-dependent+and+mutational+effects+on+the+aggregation+of+peptides+and+proteins.">Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins.</a> Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).</li><li>Renner, M., Melki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+prionopathies.">Protein aggregation and prionopathies.</a> Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).</li><li>Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+into+insoluble+deposits+protects+from+oxidative+stress.">Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress.</a> Redox Biology. 12, 699-711 (2017).</li></ol>

Una vasta gamma di malattie è legata all'accumulo di proteine misfolded in depositi cellulari6,7,8,33. Molti sforzi sono stati fatti per svelare i meccanismi molecolari che determinano l'insorgenza di queste malattie utilizzando approcci computazionali, che non tengono in concentrazioni di proteina di conto, o in vitro si avvicina, in cui la concentrazione nella proteina rimane costan...

Proteostasis è un determinante fondamentale dei processi di fitness e invecchiamento delle cellule. Nelle cellule, omeostasi della proteina è mantenuto da controllo di qualità di proteina sofisticate reti intendevano ad assicurare il corretto ripiegamento di conformeri proteine misfolded da accompagnatori e/o loro proteolisi mirata con diversi meccanismi ben conservati1 ,2,3,4,5. Un gran numero di studi fornisce il supporto per il collegamento tra l'inizio e la progressione di una vasta gamma di malattie umane e il fallimento di proteostasis, che conduce al misfolding e aggregazione. Per esempio, la presenza di depositi proteici è considerata un marchio di garanzia patologico di molti disordini neurodegenerative, quali Alzheimer, Parkinson e malattie6,7,8, di Huntington prionogenic malattie e non degenerativa amiloidosi9. È stato suggerito che presto assembly oligomerici e protofibrillar nella reazione di aggregazione sono i principale elicitori di citotossicità, stabilendo aberrante interazioni con altre proteine nell' affollato ambiente cellulare10. Inoltre, inclusioni di proteina (PI) possono essere trasmessi tra le cellule, propagando il loro effetto tossico11,12. Di conseguenza, potrebbe essere che la formazione di PI potrebbe infatti costituire un meccanismo di disintossicazione che limita la presenza di specie pericolose aggregati a posizioni specifiche in cella, dove possono essere elaborati o accumulati senza effetti secondari importanti 13 , 14.
Standard in vitro approcci biochimici hanno fornito importanti intuizioni le diverse specie che popolano le reazioni di aggregazione e loro proprietà15,16. Tuttavia, le condizioni utilizzate in queste analisi sono chiaramente diverse da quelli che si verificano all'interno della cellula e, pertanto, chiedo loro rilevanza fisiologica. A causa della notevole conservazione delle vie cellulari come controllo di qualità di proteine, l'autofagia o il regolamento del17,stato redox cellulare18 tra eucarioti19,20,21 ,22,23, il lievito Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) è emerso come un modello di cellulare semplice privilegiato per studiare i determinanti molecolari dell'aggregazione proteica e il suo impatto citotossico associato in ambienti biologicamente rilevanti24,25,26.
Propensione di aggregazione della proteina è una caratteristica intrinsecamente codificata nella sequenza primaria. Così, la formazione di amiloide-come le strutture può essere preveduta basato sull'identificazione e la valutazione della potenza di aggregazione-promuovere le regioni polipeptidi27. Tuttavia, nonostante il successo di algoritmi bioinformatici per predire le proprietà di aggregazione in vitro di sequenze proteiche, sono ancora lontano da come queste propensioni si traducono in vivo effetto citotossico di previsione. Gli studi che affrontano il legame tra lo stato aggregato di una data proteina e suoi associato danno cellulare in maniera sistematica possono contribuire ad per aggirare questa limitazione computazionale. Questa connessione è indirizzata nello studio presente, approfittando di un grande insieme di varianti del peptide amiloide-β Aβ42 differiscono solo per un singolo residuo, ma la visualizzazione di un intervallo continuo di aggregazione propensioni in vivo28. In particolare, è descritto un approccio basato su FC per identificare la specie conformazionale contabilità per il danno ossidativo suscitato da aggregazione-incline proteine in cellule di lievito. La metodologia fornisce molti vantaggi come la semplicità, funzionalità di alto-rendimento e accurata misurazione quantitativa. Questo approccio ha permesso di confermare che svolgono un ruolo protettivo contro lo sforzo ossidativo di PI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast cells BY4741&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>201388</td>
			<td>Genotype: MATa his3&#916;1 leu2&#916;0 met15&#916;0 ura3&#916;0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pESC(-Ura) plasmid&#160;</td>
			<td>Agilent Genomics</td>
			<td>217454</td>
			<td>Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0626</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7630</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0750</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3991&#160;</td>
			<td>Solution 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX Deep Red Reagent&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10422</td>
			<td>Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-PER protein extraction reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78990</td>
			<td>Liquid cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6050</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>5000205</td>
			<td>Dye reagent for one-step determination of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-amyloid antibody 6E10&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>803001</td>
			<td>Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1721011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Immobilon-P, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata forte</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WBLUF0100</td>
			<td>Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>657338</td>
			<td>Equipped with a 488&#160;nm blue laser for the detection of GFP, and 635&#160;nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td>Protein transference system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000FC</td>
			<td>Electrophoresis system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the impact of protein aggregation on cellular oxidative stress in yeast

Misfolding e aggregazione amiloide conformazioni hanno riguardati l'insorgenza e la progressione di parecchie malattie neurodegenerative. Tuttavia, ci sono ancora poche informazioni sulla proteina insolubile come aggregati esercitano loro effetti tossici in vivo. Organismi di modello semplice di procarioti ed eucarioti, come batteri e lieviti, hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione attuale dei meccanismi dietro la formazione intracellulare dell'amiloide, propagazione di aggregati e tossicità. In questo protocollo, l'uso del lievito è descritto come un modello da dissezionare il rapporto tra la formazione di aggregati proteici e del loro impatto su stress ossidativo cellulare. Il metodo combina la rilevazione dello stato solubile/aggregati intracellulare di proteina amiloidogenica con la quantificazione del danno ossidativo cellulare derivanti dalla sua espressione mediante citometria a flusso (FC). Questo approccio è semplice, veloce e quantitativa. Lo studio illustra la tecnica correlando lo stress ossidativo cellulare causato da una vasta serie di varianti del peptide amiloide-β con loro propensioni di aggregazione intrinseco rispettivi.

Questo protocollo descrive come impiegare una collezione di 20 varianti del peptide Aβ42 dove Phe19 è stato mutato a tutti naturale proteinogenici aminoacidi28. Le propensioni di aggregazione teorica di queste proteine possono essere analizzati usando due algoritmi bioinformatici diversi (AGGRESCAN e TANGO31,32). In entrambi i casi, questa analisi esegue il rendering di una gradazione progressiva delle te...

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Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Valutazione dell'impatto dell'aggregazione proteica su Stress ossidativo cellulare nel lievito

L'aggregazione della proteina induce stress ossidativo cellulare. Questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio degli Stati intracellulari di proteine amiloidogeniche e lo sforzo ossidativo connesso con loro, mediante citometria a flusso. L'approccio viene utilizzato per studiare il comportamento delle varianti solubile e soggetto a aggregazione del peptide amiloide-β.

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.2K Views.  Universitat Autònoma de Barcelona. L'aggregazione della proteina induce stress ossidativo cellulare. Questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio degli Stati intracellulari di proteine amiloidogeniche e lo sforzo ossidativo connesso con loro, mediante citometria a flusso. L'approccio viene utilizzato per studiare il comportamento delle varianti solubile e soggetto a aggregazione del peptide amiloide-β.

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Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Ricerca

Biochimica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such systems allows for detailed studies of their underlying mechanisms which would not be feasible in vivo. Here, we provide a protocol for the in vitro reconstitution of the MinCDE system of Escherichia coli, which positions the cell division septum in the cell middle. The assay is designed to supply only the components necessary for self-organization, namely a membrane, the two proteins MinD and MinE and energy in the form of ATP. We therefore fabricate an open reaction chamber on a coverslip, on which a supported lipid bilayer is formed. The open design of the chamber allows for optimal preparation of the lipid bilayer and controlled manipulation of the bulk content. The two proteins, MinD and MinE, as well as ATP, are then added into the bulk volume above the membrane. Imaging is possible by many optical microscopies, as the design supports confocal, wide-field and TIRF microscopy alike. In a variation of the protocol, the lipid bilayer is formed on a patterned support, on cell-shaped PDMS microstructures, instead of glass. Lowering the bulk solution to the rim of these compartments encloses the reaction in a smaller compartment and provides boundaries that allow mimicking of in vivo oscillatory behavior. Taken together, we describe protocols to reconstitute the MinCDE system both with and without spatial confinement, allowing researchers to precisely control all aspects influencing pattern formation, such as concentration ranges and addition of other factors or proteins, and to systematically increase system complexity in a relatively simple experimental setup.

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

We provide a protocol for in vitro self-organization assays of MinD and MinE on a supported lipid bilayer in an open chamber. Additionally, we describe how to enclose the assay in lipid-clad PDMS microcompartments to mimic in vivo conditions by reaction confinement.

In Vitro Ricostituzione di Self-Organizing pattern proteico su lipidici supportati

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

Analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

Valutazione delle interazioni tra proteine e proteine utilizzando una tecnica di digestione On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

Esame della dinamica dell'adesione cellulare e della diffusione delle cellule epiteliali su fibronectina durante lo stress ossidativo

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

Valutazione della localizzazione della proteina submitocondriale nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...