Diese Arbeit wurde vom kanadischen Institut für Gesundheitsforschung (CIHR) (MOP-97774) und dem Natural Sciences and Engineering Research Council von Kanada (: 480619 NSERC, Zuschuss nr) finanziert. KS ist ein Empfänger einer KRESCENT New Investigator Award (ein Joint Verleihung des Kidney Foundation von Kanada, kanadische Gesellschaft Nephrologie und kanadischen Institute of Health Research) und einer frühen Researcher Award von der Ontario Ministerium für Forschung und Innovation. FW wird von einem Li Ka Shing Stipendium unterstützt.

1. Transformation von E. coli mit dem pGEX-RhoA (G17A) Construct <ol><li> Bereiten LB-Agar durch Auflösen von 2,5 g und 1,5 g LB-Agar in 100 ml dH 2 O. Autoklaven und kühlen auf geschätzte 50-55 ° C, die als Faustregel gilt, ist, wenn die Flasche bequem gehalten werden kann. </li><li> Bereiten Ampicillin (Amp) Lager durch Auflösen von 50 mg / ml in dH 2 O. Spritzenfilter und frieren Aliquots ungenutzt. Fügen Sie 100 ul Amp Lager (Endkonzentration 50 ug / ml) auf die LB-Agar vom 1.1. Swirl zu mischen und gießen Sie in 10 cm bakterielle Gerichte (15-20 ml / Schale). Erlauben zu verfestigen (15-30 min.) Und Lagerung unbenutzter Platten bei 4 invertiert ° C für 2-3 Wochen. </li><li> Um E. Transformation Coli, schnell aufgetaut eines Aliquots DH5a kompetenten Zellen in einem Eisbad. Fügen Sie 1 ul pGEXRhoA (G17A) DNA verdünnt auf 25-50 ng / ul. Flick das Rohr zu mischen und auf Eis für 30 Minuten inkubieren. Hitzeschock bei 42 ° C für 45 Sekunden und Platz zurück auf Eis für 2 Minuten. Zusatz von 900 mu &amp;; L SOC-Medium wachsen und für eine Stunde bei 37 ° C unter Schütteln. </li><li> Verteilt 50-100 ul der transformierten Bakterien auf einer LB-Agar-Amp Platte mit einem abgewinkelten sterilen Pasteurpipette. Inkubieren Sie die Platte wieder richtig herum in einem 37 ° C Inkubator für 5 Minuten und dann invertieren und über Nacht wachsen. </li><li> Eine einzelne Kolonie von der Platte wird zur Herstellung des GST-markierte Protein (Schritt 2.1) aufgenommen werden kann. Für die zukünftige Verwendung, wickeln und lagern Platten bei 4 ° C für ca. 3 Wochen invertiert. Darüber hinaus können Bakterienstämme mehr langfristiger Lagerung wachsenden einzelnen Kolonien in 2 ml sterilem LB-Amp über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln hergestellt werden. Mischen Sie einen aliquoten mit sterilem 80% Glycerin im Verhältnis 1:1 und einfrieren bei -80 ° C </li></ol> 2. Vorbereitung der GST-RhoA (G17A) Perlen <ol><li> Bereiten LB durch Zugabe von 25 g auf 1 L LB dH 2 0 und Autoklavieren. Beim Abkühlen werden 50 pl Amp ab Lager bis 50 ml LB (50 mu g / ml Endkonzentration). Impfen mit einem gut isolierten colony der transformierten Bakterien wachsen bei 37 ° C über Nacht unter Rühren. Wenn bei voller Dichte (OD 600&gt; 1,0) mit 450 ml LB-Amp verdünnen und zu wachsen für weitere 30 Minuten bei 37 ° C </li><li> Vorbereiten einer 100 mM Stammlösung von Isopropyl BD-thiogalactopyranosid (IPTG) durch Auflösen von 0,238 g in 10 ml dH 2 O Shop in Aliquots bei -20 ° C. Induzieren Bakterien Rho-Protein durch Zugabe von 500 ul 100 mM IPTG bis zu 500 ml-Kultur (eine Endkonzentration von 100 pM) zu erzeugen. Absenken der Temperaturen auf 22-24 ° C wachsen und für ~ 16 h Stunden. </li><li> Spin Kultur bei 3600 g für 10 Minuten bei 4 ° C Bei Bedarf können die 500 ml Kultur in 50 ml Röhrchen für Zentrifugation aufgeteilt werden. Freeze-Pellet (e) für mindestens 1 Stunde (oder am besten über Nacht) bei -80 ° C </li><li> Planen 200 ml Lyse-Puffer enthaltend 20 mM HEPES (0,95 g) / pH 7,5, 150 mM NaCl (1,75 g), 5 mM MgCl 2 (0,203 g), 1% TX-100 (2 ml). Stammlösungen hergestellt von 1M DTT (1,542 g in 10 ml dH 2 O) Und 100 mM PMSF (0,174 g/10 ml EtOH). Um Lysepuffer + Vorbereitung, Ergänzung mit 10 ml 1 mM DTT (10 ul der Vorrat reicht) und 1 mM PMSF (100 ul der Vorrat reicht) und ein komplettes Mini Protease Inhibitor Tablette. </li><li> Arbeiten auf Eis, 10 ml Lysepuffer + zu den Pellets aus Schritt 2.3. Resuspendieren durch vorsichtiges Vortexen und Pipettieren. Schaumbildung vermeiden. Mit Ultraschall auf Eis für 1 Minute bei Einstellung 4 mit 50% Puls. Drehen Sie das beschallte Lysat bei 15.000-20.000 g für 15 Minuten bei 4 ° C, und entfernen Sie das geklärt Sonifikat (Überstand) in ein steriles 15 ml Tube verschlossen. </li><li> Bereiten Sie die Glutathion-Sepharose durch vorsichtiges Mischen der ursprünglichen Röhrchen, das eine 75% Gülle und Transfer 335 ul in eine 15 ml Tube. Verwenden Sie eine breite Bohrung Spitze, Perlen pipettieren. 10 ml kaltem PBS, und Spin 500 g für 5 Minuten bei 4 ° C Überstand verwerfen, 1 ml Lysepuffer + an die Beads und Spin wie bei früheren waschen. Überstand verwerfen und Add-Lysepuffer + eine 50% ige Aufschlämmung herzustellen. </li><li> Fügen Sie 250 ul Equilibrated Kügelchenaufschlämmung zu dem Überstand aus Schritt 2.5. Drehen bei 4 ° C für 45 Minuten. </li><li> Planen 500 ml HBS, enthaltend 20 mM HEPES (2,38 g) / pH 7,5 und 150 mM NaCl (4,38 g) in dH 2 O Bereiten Stammlösungen 1 M MgCl 2 (0,952 g in 10 ml dH 2 O) und 1 M DTT (1,542 g in 10 ml dH 2 O). Um HBS + vorbereiten, ergänzen 100 ml kurz vor Gebrauch mit 5 mM MgCl 2 (50 ul ab Lager lieferbar) und 1 mM DTT (100 ul ab Lager). </li><li> Drehen der Kügelchen aus Schritt 2,7 bei 500 g für 5 Minuten bei 4 ° C Verwerfen des Überstandes und Waschen Perlen 2x mit 10 ml Lysepuffer + und 2x mit 10 ml HBS +. Nach dem letzten Waschen, eine 50% ige Aufschlämmung durch Resuspendieren der Kügelchen in HBS + BD mit BaculoGold Protease-Inhibitor (20 ul 50x BD BaculoGold / ml) ergänzt. </li><li> Verdünnen Sie 10 ul der abschließenden Vorbereitung Perlen mit 2x Laemmli-Probenpuffer mit β-Mercaptoethanol. Make Rinderserumalbumin (BSA)-Standards. Verwenden Sie ein 2 mg / ml Stammlösung (0,02 g BSA in 10 ml dH 2 O). Mischen Sie 10 ul Lager mit 10 ul Laemmli (20 ug endg.); 5 ul Lager mit 5 &amp;mgr; l dH 2 O und 10 ul Laemmli (10 ug endg.); und 2,5 ul Lager mit 7,5 ul dH 2 O und 10 ul Laemmli (5 ug endg.). Kochen Sie alle Proben (5 min). Drehen des Wulstes Probe und ausgeführt Überstand mit BSA-Standards und Molekulargewichtsmarker auf einem 10% SDS-Polyacrylamid-Gel. </li><li> Bereiten Sie die Coomassie Blau-Färbung (0,1 g in 10 ml Essigsäure, 40 ml Methanol und 50 ml dH 2 O) und der Entfärber-Lösung (500 ml dH 2 O, 400 ml Methanol und 100 ml Essigsäure). Lagerung bei Raumtemperatur. Färben des Gels für 20-30 Minuten, entfernen Sie den Farbstoff (es können mehrere Male wiederverwendet werden) und spülen Sie mit entfärben Lösung zweimal. Fahren Sie mit unter leichtem Schütteln für mehrere Stunden entfärben, bis Banden deutlich sichtbar sind. </li><li> Schätzen Sie die Konzentration von GST-RhoA (G17A) gekoppelt an die Beads mit den BSA-Standards als Referenz (Abb. 2). Aliquot ein gleiches Volumen an Kügelchen, ~ 10-15 ug Protein in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Shop Kügelchen bei 4 ° C innerhalb eines Tages zu verwenden. Einfrieren bei -80 ° C in HBS + / Glycerin im Verhältnis 3:1 bis auf wenige Tage zu benutzen. </li></ol> 3. GEF-Pulldown Assay mit Nukleotid-freien RhoA (G17A) Perlen <ol><li> Wachsen Zellen in 10 cm Schalen bis zur Konfluenz. Serum für mindestens 3 Stunden zu berauben und zu behandeln, als erforderlich. </li><li> Planen Lysepuffer + wie in Schritt 2.4. Bereiten Sie genug Lysepuffer für 700 ul / Schale plus einige zusätzliche Betrag, der für Pipettierfehlern ermöglichen. In der Protease-Inhibitoren unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Arbeiten auf Eis, entfernen Kulturmedium aus dem Geschirr zu waschen und mit eiskalter HBS. Entfernen Sie alle HBS und fügen Sie 700 ul Lysepuffer + zu jedem Gericht. Swirl Platten, um alle Bereiche abzudecken, kratzen und zu sammeln Lysate in nummerierte 1,5 ml Röhrchen. Zentrifugieren bei 15.000 g für 1 min bei 4 ° C Der Überstand wird für den Assay verwendet werden. </li><li> Wenn Ihr Handy die Nummer ist gleichwertig in allenGerichte getestet wird, kann man auch tun, eine Protein-Assay, und bewegen bis 3,5 Schritt. Andernfalls Messung der Proteinkonzentration von jedem Überstand unter Verwendung von Bio-Rad Protein Assay praktischen und Ausgleichen der Überstand für Volumens und der Konzentration. Die Menge des gesamten Proteins hängt von den Zelltypen verwendet werden (typischerweise 1-1,5 mg Protein für LLC-PK1-Zellen). </li><li> Entfernen Sie 30 ul von jedem Überstand und mischen sich mit 30 ul 2x Laemmli-Probenpuffer reduziert, aufkochen und beiseite stellen für Schritt 3.7. Die restlichen Überstände Aliquots der GST-RhoA (G17A) Kügelchen aus Schritt 2.12. Drehen für 45 Minuten bei 4 ° C </li><li> Spin Kügelchen bei 6800 g für 10 Sekunden bei 4 ° C Verwerfen des Überstandes und Waschen der Kügelchen 3x mit Lysepuffer, Spinning in der gleichen Weise zwischen Wäschen. Entfernen Sie den letzten Waschen unter Verwendung einer 1 ml-Spritze mit einer 30 G Nadel ausgestattet und mit 20 ul 2x Laemmli-Probenpuffer reduziert. Kochen für 5 min. Spin zu Pellet-Beads und entweder den Überstand sofort (bevorzugt) oder lagern Sie es eint -80 ° C für eine spätere Analyse. </li><li> Führen Sie 20 ul insgesamt Zelllysaten und alle der gefällten Proteinproben auf den entsprechenden Prozentsatz SDS-Polyacrylamidgel für die Größe der GEF Sie studieren. Erkennen Sie Ihre GEF der Wahl durch Western-Blot unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Teil 1 und 2 des Protokolls beschreibt die Herstellung von GST-RhoA (G17A), die mit GSH-Sepharose-Kügelchen und ihre Prüfung durch SDS-PAGE (siehe Gliederung des Protokolls auf Abb. 1). Eine typische Coomassie-gefärbten Gel wird auf 2 gezeigt. Die Probe mit dem eluierten Protein sollte eine einzelne Bande bei etwa 50 kDa (Abb. 2, Spur 6) enthalten. Die Konzentration des Proteins kann unter Verwendung der BSA Referenzproben werden. Im Beispiel Abb. 2, wird die Konzentration von RhoA (G17A) auf etwa 15 μg/10 ul sein. So wurden Aliquots von 10 ul / Röhrchen vorbereitet. Die typische Ausbeute<html> in unserer Hand liegt bei 15-20 ug Protein aus 10 ml Lyse der Bakterien. Teil 3 des Protokoll beschreibt die Affinität Präzipitationsassay (siehe Übersicht auf Abb. 1). Ein erfolgreicher Test GEF Erkennen der Aktivierung des Austauschs Faktor GEF-H1 ist auf Abb. 3 dargestellt. Die RhoA (G17A) Protein erfasst eine GEF-H1 von der Kontrolle (unbehandelt) Zelllysate, was darauf hindeutet, dass GEF-H1 basale Aktivität aufweist. Der Betrag fällt jedoch Erhöhungen der Zellen mit der inflammatorischen Zytokins Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) behandelt wurden, im Einklang mit der Vorstellung, dass TNF-α GEF-H1 5,7 aktiviert. Wichtig ist, zeigen die gesamten Zelllysate ähnliche Mengen GEF-H1 in der Kontrolle und der behandelten Probe, was darauf hindeutet, dass die Behandlung nicht verändert GEF-H1 Ebenen und der Eingang in dem Assay verwendet wird, gleich. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> 1. Übersicht des Protokolls. ove_content &quot;&gt; <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentatives Ergebnis der Raupe Vorbereitung Protokoll. Ein Coomassie gefärbtes Gel mit erfolgreichen GST-RhoA (G17A) Perle Vorbereitung gezeigt. Perle Probe und BSA-Protein Standards wurden durch SDS-PAGE unter Verwendung eines 10% Acrylamid-Gel aufgetrennt. Um die Perlen zu testen, wird 10 ul der abschließenden Kügelchenaufschlämmung mit GST-RhoA (G17A) 1:1 mit reduzierenden Laemmli-Probenpuffer und für 5 Minuten gekocht verdünnt. Die Kügelchen wurden kurz zentrifugiert der Überstand auf das Gel aufgetragen. Die folgenden Proben wurden geladen: Spur 1: Molekulargewichtsmarker (MW) (FroggaBio Blueye vorgefärbt Protein Leiter); Lanes 2-4: 5, 10 und 20 ug Bovine Serum Albumin (BSA); Spur 5 ist leer; Spur 6: 10 ul der frisch zubereiteten RhoA (G17A) Perlen. Nach der Trennung abgeschlossen ist, wird das Gel gefärbt mit Coomassie-Blau angefärbt und anschließend an Proteine ​​zu offenbaren. Das Molekulargewicht des GST-RhoA (G17A)-Protein ist etwa 50<html> kDa und läuft auf dem Niveau des 48 kDa-Marker. Die Konzentration des GST-Rho-Protein in diesem besonderen Beispiel wird auf etwa 15 μg/10 ul Aufschlämmung vorliegen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> Abbildung 3. Vertreter GEF-Aktivierungs-Assay zeigt TNF-α-induzierte Aktivierung von GEF-H1. Konfluente LLC-PK1-Zellen wurden mit 10 ng / ml TNF-α für 5 Minuten behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen lysiert und aktive GEFs erfasst wurden unter Verwendung von GST-RhoA (G17A) gebundenen Perlen. Die Anwesenheit von GEF-H1 in der ausgefällten Proteine ​​(oben Blot) und Ganzzelllysat Proben (unten Blot) wurde unter Verwendung Western-Blot mit einem Anti-GEF-H1-Antikörper (Cell Signaling). Bitte beachten Sie die erhöhte Menge an ausgefallenen GEF-H1 im Vergleich zu nicht behandelten Zellen im Vergleich zu den entsprechenden TNF-α-Eingänge behandelt, was auf ein erfolgreiches Ergebnis. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4. Ein &quot;schlechtes Ergebnis&quot;. Obwohl die GEF Pulldown-Assay hier in Folge irgendeiner GEF-H1 von den Kügelchen eingefangen gezeigt, die ausgefallenen Mengen von Steuerung und TNF-α-behandelten Zellen gleich sind. TNF-α So hat ein Know-Aktivator von GEF-H1 in diesem Fall nicht induzieren die Aktivierung. In diesem speziellen Experiment späteren Fehlersuche vorgeschlagen, dass die TNF-α verwendet nicht frisch genug und wahrscheinlich verschlechtert.

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	<li>Jaffe, A. B., Hall, A. R. h. o. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+biochemistry+and+biology.">GTPases: biochemistry and biology.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).</li><li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF+means+go:+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors.">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li><li>Garcia-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+activated+GAPs+and+GEFs+in+cell+lysates.">Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates.</a> Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF-H1+Mediates+Tumor+Necrosis+Factor-{alpha}-induced+Rho+Activation+and+Myosin+Phosphorylation:+role+in+the+regulation+of+tubular+paracellular+permeability.">GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability.</a> J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).</li><li>Waheed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal+regulated+kinase+and+GEF-H1+mediate+depolarization-induced+Rho+activation+and+paracellular+permeability+increase.">Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+mediates+tumor+necrosis+factor-alpha-induced+activation+of+the+ERK/GEF-H1/RhoA+pathway+in+tubular+epithelium.">The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium.</a> J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).</li><li>Garcia-Mata, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+a+GEF+by+its+tail.">Catching a GEF by its tail.</a> Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).</li><li>Dubash, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+RhoA+localizes+to+the+nucleus+and+is+activated+by+Net1+and+DNA+damage+signals.">The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals.</a> PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).</li><li>Guilluy, G., Dubash, A. D., Garc&#237;a-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RhoA+and+Rho+GEF+activity+in+whole+cells+and+the+cell+nucleus.">Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus.</a> Nature Protocols. , (2011).</li><li>Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins.">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).</li><li>Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Lsc/p115+RhoGEF+and+LARG+in+regulating+RhoA+activity+downstream+of+adhesion+to+fibronectin.">A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin.</a> J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier vorgestellte Methode ist die einzige verfügbare nicht-radioaktive Aktivierungs-Assay für GEFs, die den aktiven Pool von GEFs in Zellen folgen können. Der Test ist ähnlich wie die Ausfällung Assays für folgende Aktivierung der kleinen GTPasen sowie GEFs gegen Rac und Cdc42 verwendet. Diese Assays verwenden verschiedenen GST-markierte Proteine ​​und leichte Unterschiede bei den hier beschriebenen, aber die grundlegenden Schritte sind die gleichen. Somit ist dieses Protokoll leicht für andere GTPase und GEF Aktivierungsassays angepasst werden. Das vorgestellte GEF-Assay wurde kürzlich für den Antrag auf Kernfraktionen 9,10 geändert. Mit weiteren Modifikationen könnte Testen von GEF Aktivierung in anderen subzellulären Kompartimenten auch möglich. Wir verwenden die Methode vorgestellt, um die Aktivierung von GEFs in epithelialen Zelllinien 5,6,7 studieren. Mit ein wenig Optimierung, sollte dieser Test ausreichend sein, um von einem beliebigen GEFs Zelllinie zu erkennen. Wenn adapting zu einem bestimmten Zelltyp, finden Sie die optimale Zellzahl, Volumen Lysepuffer und Nachweisverfahren für das GEF zu prüfen (eine gute Antikörper für Western-Blot ist wichtig). Bei der Ersteinrichtung des Assays ist es ratsam, einen Reiz, der bekanntlich die GEF von Interesse zu aktivieren verwenden. Bei Verwendung eines unbekannten Reiz, immer mit einem Positiv-Kontrolle zu überprüfen, ob Ihr Test funktioniert. Dieser Assay kann verwendet werden, um die Aktivierung von bekannten GEFs durch Western-Blotting nachzuweisen. Es ist jedoch auch geeignet, um unbekannte GEFs identifizieren. Zu diesem Zweck sollte festgehalten GEFs von Kontrolle und stimulierten Proben auf einem mit Coomassie-gefärbten Gel analysiert werden. Bands, die nur in stimulierten Proben erscheinen, enthalten möglicherweise aktiviert GEFs und können für die Identifizierung durch Massenspektrometrie (zB 5) gesendet werden. Schließlich wird ein Warnhinweis. Der Assay basiert auf der Annahme, dass die posttranslationale Modifikationen machen GEFs aktiv nach Zelllyse bleiben erhalten basiert. Tatsächlich ist dies eindeutig der ca.sich für eine Reihe von GEFs, und da die Betriebe, hat dieser Assay von verschiedenen Gruppen verwendet worden, um die Aktivierung unterschiedlicher GEFs, einschließlich GEF-H1, p115RhoGEF und XPLN (zB 5,11,12,13) ​​zu erfassen. Die Erhaltung des aktiven Zustand jedoch möglicherweise nicht bei allen GEFs passieren, und daher ist es denkbar, dass dieser Test nicht für alle GEFs arbeiten. Es muss auch angemerkt werden, dass viele GEFs Aktivität auszuüben zu mehr als einem kleinen GTPasen. Wenn also eine spezifische GEF studiert wird, wird empfohlen, diesen Test mit GEF Niederschlag Assays für andere kleine GTPasen, sowie funktionelle Studien, RhoA, Rac1 und Cdc42 zu ergänzen. Kritische Schritte in dem Protokoll: Kolonien von transformierten Bakterien sollte aus frischen, gut vorbereitet Platten abgeholt werden, um eine angemessene Auswahl von Amp, gute Auswuchs und Ertrag zu gewährleisten. Voraussetzungen für die Transformation kompetenter Zellen von anderen Herstellern stammen können variieren und sollte konsultiert werden. </p&gt; Alle Schritte des Proteins Herstellung Protokoll (aus Schritt 2.3) und der Assay (aus Schritt 3.2) bei 4 ° C mit kalten Lösungen und Zentrifugen durchgeführt werden. Bakterienlyse (Schritt 2.5) sollte gründlich und vollständig, um eine homogene Suspension zu erhalten. Wenn Lysieren der Bakterien, Wirbel und das Lysat pipettieren abwechselnd unter Halten desselben bei 4 ° C und sicherzustellen, Ultraschallbehandlung auf Eis zu verhindern Denaturierung des Proteins erfolgt. Wenn Sie ein anderes Modell des Ultraschallgeräts kann Bedingungen angepasst werden müssen. Die Inkubation von Sonifikat mit den Kügelchen sollten immer bei 4 ° C auf einem Rotator getan werden, um eine ausreichende Bindung zu gewährleisten, und darauf zu halten das Timing in Einklang gebracht werden. GST-Rho-Mutanten sind etwas instabil, wenn sie in Bakterien exprimiert, so ist es am besten vorbereiteten Perlen sofort oder innerhalb weniger Tage zu verwenden. Die Präzipitationsassay (Teil 3) ist an der Zeit und Temperatur empfindlich, einAktive GEFs leicht aus dem Zelllysat verloren, sollte so Schritte so schnell wie möglich durchgeführt werden. Der folgende Abschnitt enthält einige Hinweise zur Fehlersuche. Keine oder nur sehr geringe Menge des mutierten Proteins Rho in der endgültigen Herstellung Wulst: Dies kann durch eine ineffiziente Induktion, unzureichend Lyse der Bakterien, oder ein Verlust des Proteins während des Herstellungsverfahrens oder Lagerung verursacht werden. Zur Behebung einiger dieser Möglichkeiten können Proben von Bakterien vor und nach der Induktion analysiert werden. Wenn es schlechte Induktion des Proteins wiederholen Sie den Vorgang mit einer Kolonie von einer frisch ausgestrichenen Platte oder aus Re-transformierte kompetente Zellen. Verschiedene IPTG-Konzentrationen und Induktionszeiten sollte auch getestet werden. Wenn die Lyse unzureichend ist (dh das Protein bleibt in der Pellet anstelle der Überstand) Variieren Salz und Detergenzkonzentrationen im Lysepuffer versucht werden. Alternate Beschallung Zeiten undEinstellungen sollten berücksichtigt werden, und die Proben vor und nach der Beschallung kann mittels Mikroskopie überprüft werden, um die Effizienz der Lyse zu bestimmen. Nr. ausgefällt GEF, obwohl das GST-Protein, das auf den Kügelchen ist: Dies kann aufgrund von technischen Problemen während der Fällung Assay oder durch eine reale Abwesenheit der Aktivierung des untersuchten GEF mit dem Stimulus. Verwenden Sie immer ein Stimulus bekannt als Positiv-Kontrolle zu überprüfen, ob Ihr Test funktioniert. Verwenden Sie die vorbereiteten Perlen innerhalb von wenigen Tagen. Wenn der Niederschlag Assay erfasst nicht nachweisbare Mengen des GEF unter allen Bedingungen untersucht, ob Ihr GEF vorhanden ist, und ist gut erkennbar in der Überstand nach Zentrifugation, die für den Test (Schritt 3.3) verwendet werden soll. Achten Sie darauf, alle Puffer und Protease-Inhibitoren sind frisch, und alle Schritte auf dem Eis so schnell wie möglich. Erhöhen Sie die Menge an Protein-Eingang (zB durch Verwendung von Lysaten von 2 Platten / Probe). Wenn der Niederschlag Assay zeigt basalen Niederschlägenzung Ihrer GEF, aber keinen Unterschied zwischen der Kontrolle und stimulierten Proben (Abb. 4) zu sehen, starten Fehlersuche durch die Überprüfung, dass die eingesetzten Stimulus mit anderen bekannten Effekte (z. B. durch den Nachweis Aktivierung anderer Signalwege) gearbeitet. Erwägung ziehen, den Behandlungsbedingungen und / oder Konzentrationen. Verlassen Sie sich auf Daten aus der Literatur, wie Ihre Berichterstattung Stimulus Rho oder andere Signalisierung aktiviert, um wahrscheinlich Zeiten und Konzentrationen vorherzusagen. Bei der Optimierung der Behandlungszeit, verwenden sowohl kurze und lange Zeit Punkte, wie GEF Aktivierung wahrscheinlich das Beste, nachweisbar zu einem Zeitpunkt vor gut nachweisbar Rho-Aktivierung. Schließlich könnte der gleiche Reiz in einem variablen Grad der Aktivierung aufgrund einer Änderung in Zelle Reaktionsfähigkeit durch den Durchgang Nummer verursacht, Zellkonfluenz, etc. führen

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> Wird bald verfügbar sein </td><td> Erstellt im Labor von Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (Ref. 3) </td></tr><tr><td> DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> Shop -80 ° C </td></tr><tr><td> SOC-Medium </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> Halten sterilen </td></tr><tr><td> Glycerin </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> Shop Lager bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Agar </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (IsoPropyl BD-thiogalactopyranosid) </td><td> Calbio-chem </td><td> 420322 </td><td> Lagerung der Stammlösung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutathion-Sepharose-Kügelchen </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10x </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> Fügen Sie erst bei der Anwendung </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> Fügen Sie erst bei der Anwendung </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> Fügen Sie erst bei der Anwendung </td></tr><tr><td> Protease Inhibitor 50x </td><td> BD Baculo-Gold </td><td> 51-21426Z </td><td> Fügen Sie erst bei der Anwendung </td></tr><tr&gt; <td> Kompletter Mini, EDTA-free 10x </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td> Fügen Sie erst bei der Anwendung </td></tr><tr><td> 2x Laemmli-Probenpuffer </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> Fügen Sie erst bei der Anwendung </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue </td><td> Bio-Rad </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> CALEDON </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td> CALEDON </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Rad Protein Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> Blueye Leiter </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reagenzien verwendet. <table border="1"><tbody><tr><td> Name der Ausrüstung </td><td> Firma </td&gt; <td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> RC-5B-Zentrifuge </td><td> Sorvall </td><td> SS-34 Rotor </td><td> Verwenden Sie bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Sorvall-Thermo Scientific </td><td> ST-16R </td><td> Verwenden Sie bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Micro-Zentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Verwenden Sie bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Bakterielle Schüttler </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG CH-1403 Bottmingen </td><td> Verwendung bei 37 ° C oder bei 22 ° C </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> Branson </td><td> Sonifier-450 </td><td> Verwenden Sie bei RT </td></tr><tr><td> Rotator </td><td> Glas-Col </td><td> 099A CR4012 </td><td> Verwenden Sie bei 4 ° C </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Besondere Einrichtungen verwendet.

affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates

Die Proteine ​​der Rho-Familie kleiner GTPasen sind zentrale Regulatoren des Zytoskeletts und steuern eine Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Zellwanderung, Genexpression, Zellzyklus-Progression und Zell-Adhäsion ein. Rho-Proteine ​​sind molekulare Schalter, die aktiv sind in GTP-gebundenen und inaktiv im GDP-gebundenen Zustand. Ihre Aktivierung wird von einer Familie der Guanin-Nukleotid-Austausch-Faktor (GEF) vermittelt wird. Rho-GEFs bilden eine große Familie, mit überlappenden Spezifitäten 2. Obwohl viele Fortschritte bei der Identifizierung der GEFs durch bestimmte Signale aktiviert worden sind, gibt es noch viele Fragen in Bezug auf die restlichen Weg-spezifische Regulation dieser Proteine. Die Anzahl der Rho-GEFs über 70, und jede Zelle exprimiert mehrere GEF Protein. Zudem aktivieren viele dieser Proteine ​​nicht nur Rho, aber andere Mitglieder der Familie und trägt zu der Komplexität der regulatorischen Netzwerke. Wichtig ist, erkundenwie GEFs geregelt erfordert eine Methode, um den aktiven Pool von einzelnen GEFs in Zellen durch verschiedene Stimuli aktiviert folgen. Hier bieten wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für eine Methode verwendet, um zu bewerten und zu quantifizieren, die zur Verfügung stehenden aktive Rho-spezifischen GEFs mit einer Affinität Präzipitationsassay. Dieser Test wurde vor ein paar Jahren im Labor Burridge 3,4 entwickelt und wir haben es in der Niere röhrenförmigen Zelllinien 5,6,7 verwendet. Der Assay nutzt ein &quot;Nukleotid frei&quot; Mutante RhoA, mit einer hohen Affinität für aktive GEFs. Die Mutation (G17A) macht das Protein zu binden, nicht in der Lage GDP oder GTP und dieser Zustand ahmt den Zwischenzustand, die mit dem GEF gebunden ist. Ein GST-getaggte Version dieses mutierte Protein wird exprimiert und gereinigt aus E. coli, gebunden an Glutathion-Sepharose-Kügelchen und zur Fällung von aktiven GEFs aus Lysaten von unbehandelten und stimulierten Zellen. Da die meisten GEFs werden über posttranslationale Modifikationen oder Entlassung aus hemmenden Bindungen, ihren aktiven Zustand aktiviertwird in Zelllysaten erhalten, und sie können durch diesen Test 8 erkannt werden. Gefangen Proteine ​​können für bekannte GEFs sondiert werden durch Detektion mit spezifischen Antikörpern unter Verwendung von Western-Blotting oder durch Massenspektrometrie analysiert, um unbekannte GEFs durch bestimmte Stimuli aktiviert zu identifizieren.

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Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

Das hier vorgestellte Verfahren beschreibt ein Assay zur spezifischen Aktivierung von RhoA GDP / GTP (GEFs) in kultivierten Zellen unter Verwendung eines mutierten RhoA GST-Fusionsprotein, das eine hohe Affinität für aktiviert GEFs hat folgen. GEFs aus Zelllysaten durch Western-Blotting und quantifiziert durch Densitometrie erkannt ausgefällt.

Affinity Niederschlag von Active Rho-GEFs Mit Hilfe eines GST-markiertes Mutant Rho-Protein (GST-RhoA (G17A)) aus epithelialen Zelllysate

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

affinity-precipitation-active-rho-gefs-using-gst-tagged-mutant-rho

Research

JoVE Journal

Biology

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

16.5K Aufrufe.  St. Michael's Hospital. Das hier vorgestellte Verfahren beschreibt ein Assay zur spezifischen Aktivierung von RhoA GDP / GTP (GEFs) in kultivierten Zellen unter Verwendung eines mutierten RhoA GST-Fusionsprotein, das eine hohe Affinität für aktiviert GEFs hat folgen. GEFs aus Zelllysaten durch Western-Blotting und quantifiziert durch Densitometrie erkannt ausgefällt.

Serie: Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Forschung

Biologie

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Onion Zellen unter Verwendung des Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) zur Analyse von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Chromatographische Reinigung von hoch aktiven Hefe Ribosomen

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Eine flüssige Phase Affinity Capture Assay Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Protein-Protein Interaktion Studie: Das Poliovirus-Nanobody Beispiel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Transgenen Nager Assay zur Quantifizierung von männlichen Keimzellmutantenhäufigkeit

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...