We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.

Anmerkung: Die drei Teile des Protokolls beschreiben die wässrige Belichtung des DZNep Medikament Larven Mücken, einem blutbasierten Belichtung DZNep an erwachsene Weibchen ihre Wirkung der Fruchtbarkeit zu untersuchen und SAH-Hydrolase-Hemmung durch DZNep gemessen unter Verwendung eines einfachen kolorimetrischen Technik. Eine schematische Darstellung dieser Untersuchungen ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Unreife Mosquito Entwicklung und Hinterbliebenen Assays HINWEIS: Dieser Abschnitt erklärt die Verwendung eines wasserlöslichen Wirkstoff, der Mückenlarven Entwicklung und das Überleben beeinflusst. <ol><li> Hatch A. gambiae Eier bei 28 ° C in destilliertem Wasser (dH 2 O) und Rück sie 2. Larvenstadium. </li><li> Nehmen Sie ein Sechs-Well-DNase, RNase freie Zellkulturplatte und gießen Sie 10 ml dH 2 O in jede Vertiefung. </li><li> Wählen Mückenlarven an 2. Larvenstadium und fügen 15 Larven pro Vertiefung. Vor der Zugabe der 2. Larvenstadium bis zum Teller, S.ut sie auf einem Papiertuch für 2-3 Sekunden, um überschüssiges Wasser zu entfernen. </li><li> Label-Brunnen mit farbcodierten Bänder Experiment zufällig. Beschriften Sie zwei Vertiefungen pro Testkonzentration auf jeder Platte (Abbildung 2). </li><li> Eine 1 mM DZNep chlorid (MW = 298,73) Stammlösung durch Auflösen von 0,3 mg DZNep in 1 ml dH 2 O. Brühe Lösung DZNep.HCl kennzeichnungs Vertiefungen, um eine Endkonzentration von 0,5 &amp; mgr; M und 5,0 &amp; mgr; M. HINWEIS: Die Stammlösung kann bei 4 gespeichert werden ° C für kurzfristige (1 Tag bis zu einem Monat) oder -20 ° C für die langfristige (länger als einen Monat). HINWEIS: Die Zugabe der Stammlösung zum vorgenannten Konzentrationen nicht das Volumen des Wassers in den Vertiefungen erheblich ändern. Jedoch im Falle von viel höheren Konzentrationen ist es ratsam, die Verbindung im Larvenmedium lösen, um eine unnötige Verdünnung der Verbindung zu vermeiden. </li><li> In gleicher Höhe Flocke Fischfutter in jede Vertiefung. Die Plattes und inkubieren Sie bei 28 ° C in einem Inkubator. </li><li> Notieren Sie sich die Sterblichkeit für die DZNep-behandelten und unbehandelten Larven Mücken nach einer 24-Stunden-Expositionszeit. Entfernen und entsorgen Sie keine toten Larven. Wiederholen Sie diesen Aufnahme jeden Tag, bis alle Larven sterben oder verpuppen und sich als Erwachsene. Nehmen die Größe Larven jeden zweiten Tag, das heißt Tag 0, 2, 4, 6, 8, bis sie Verpuppung. </li><li> Analysieren Sie die Entwicklung der Larven und Mortalitätsdaten mit einem geeigneten statistischen Analyse-Software. HINWEIS: Ein Balkendiagramm können die Mortalitätsdaten in Microsoft Excel darzustellen. Multivariate Varianzanalyse (MANOVA) durchgeführt mit einer Software wie JMP oder SPSS wird zeigen, wenn verschiedene Dosen des Medikaments in signifikant das Überleben von Moskitolarven führen. </li></ol> 2. Fecundity Assay durch Verabreichung Drug durch künstliche Zufuhr an weiblichen Mücken HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Zugabe des Medikaments, um Blut einnd Verfütterung an erwachsenen weiblichen Moskitos mit einem künstlichen Feedersystem. <ol><li> Einrichtung für Erwachsene Moskitokäfige mit gleicher Anzahl von männlichen und weiblichen Mücken für Kontroll- und Testkäfig. Geben Sie 10% Zuckerlösung in Watte, sowohl den Käfigen, bis die Weibchen getränkt sind bereit für die Zuführung (3-5 Tage ist optimal für Anopheles gambiae). </li><li> 2 Stunden vor der blutsaugenden, entfernen Sie die Baumwollkugeln, um sicherzustellen, Weibchen sind hungrig. </li><li> Montieren Sie zwei künstliche Blut Anleger, die eines umgekehrten breiten unteren Glastrichter (Durchmesser = 50 mm, Länge = 70 mm) und einem umgebenden Kunststoff mit Industriekleber versiegelt bestehen. Befestigen Plastikröhrchen (Durchmesser = 7 mm), um zwei Zuführungen &#39;Auslässe (Durchmesser = 10 mm) über Anschlüsse für Zu- und Abfluss von Wasser. Beschriften Sie die zwei Zuführungen als &quot;Control&quot; und &quot;5 uM DZNep.&quot; </li><li> Mit einem handelsüblichen Heizelement, das Programm für die Fütterung eingestellt. In &quot;Menü&quot;, wählen Sie &quot;Einstellungen&quot;und wählen Sie &quot;Sollwerte&quot;; vorinstallierte Programme wird angezeigt. Wählen Sie &quot;SP1&quot; und stellen Sie die Temperatur für 37 ° C. HINWEIS: Der Heizkörper wird sichergestellt, daß das Blut verabreicht wird, bei einer konstanten Temperatur gehalten wird. Zusätzliche Programmeinstellungen können für verschiedene Moskito oder Insektenarten verwendet werden. </li><li> Füllen Sie einen Eimer mit Wasser und tauchen Sie das Heizelement in das Wasser. </li><li> Schneiden Sie ein Quadrat Stück Parafilm (50 mm x 50 mm), und ziehen Sie es, um eine dünne membranöse Film zu machen. Bedecken Sie den Boden der künstlichen Anleger, die mit dem Parafilm. Schneiden Sie ein Stück Parafilm (50 mm x 10 mm), ziehen Sie es und die Ränder der Anleger. </li><li> Bauen Sie das System, den Anschluss der Zuleitungen und Heizelement durch die Rohre. Einmal abgeschlossen, schalten Sie das System und wählen Sie &quot;SP1&quot;. Drücken Sie auf &quot;Enter&quot;, um das System zu starten. HINWEIS: Das Wasser wird auf 37 zu bekommen beheizt ° C und bei dieser Temperatur gehalten. </li><li> Überwachen the Temperatur des Wassers mit einem Thermometer in den Wassereimer. HINWEIS: Die Anschlüsse und Rohre zur Aufrechterhaltung eines konstanten Zirkulation des Wassers durch das System, so dass die Temperatur des Blutes bei 37 bleibt ° C. </li><li> Füllen Sie eine flache Bodenschale mit 10% Bleichmittel-Lösung, die verwendet werden, um irgendwelche Blutverschmutzungen dekontaminiert werden. </li><li> 2 ml defibrilliert Schafblut zu einem Reaktionsgefäß. Kennzeichnen Sie diese als &quot;Control&quot;. Wiederholen Sie den Vorgang für die Versuchsröhre als &quot;5 uM DZNep&quot; .Add 6 ul der DZNep Stammlösung (siehe Punkt 1.5) in die Versuchsröhre mit &quot;5 uM DZNep&quot; gekennzeichnet mischen Sie vorsichtig das Blut und Drogen durch Umdrehen es mehrmals. Das Röhrchen 10 min bei RT. </li><li> Mit einer Pipette 2 ml Kontroll- und Test Blut an die Spitze der entsprechend bezeichneten Anleger. Entsorgen Sie die Pipette in der Bleichlösung. Bedecken Sie den Käfig mit einem dunklen Tasche und atmen Luft am Käfig regelmäßig, um f fördernemales für die Fütterung. </li><li> Lassen Sie die Mücken ernähren ca. 30 min. Nach Zuführung abgeschlossen ist, schalten Sie das Heizelement, nehmen die Anleger aus und schneidet den Parafilm. Weichen Sie die Zuführung in Bleichlösung etwa 5 Minuten und spülen Sie gut in VE-Wasser. </li><li> Entfernen Sie die Feeder und legte Watte mit Zuckerwasser auf den Käfigen für 48 Stunden. Ein Eierspeise Wasser und Filterpapier, das in den Käfigen über Nacht auf die Eiablage zu erleichtern. Beschriften Sie jedes Eierspeise mit der jeweiligen Test- oder Kontroll Konzentration. </li><li> Entfernen Sie die Eierspeise nächsten Tag und untersuchen Sie die Anzahl und Struktur der Eier unter einem Stereomikroskop. Besorgen Sie Bilder mit der Q-colors5 Software. Die Anzahl der Eier. Analysieren Unterschied in der Anzahl von Eiern von Test- und Kontrollkäfigen erhalten. HINWEIS: Ein ungepaarter t-Test kann verwendet werden, um festzustellen, ob die Zahl der Eier signifikant unterschiedlich (p ≤0.05) gestellt sind. </li></ol> 3. Biochemische Assay von Mosquito Enzyme Inhibitionvon Drug HINWEIS: In diesem Abschnitt wird ein Enzym-Aktivitätstest unter Verwendung von DTNB als Indikator, um den Effekt auf DZNep SAH Hydrolase Hemmung in erwachsene männliche und weibliche Mücken bestimmen. <ol><li> Vorbereiten einer 0,1 M Na 2 HPO 4 (dibasisches Natriumphosphat) Lösung durch Zugabe von 14,19 g Na 2 HPO 4 zu 1 l dH 2 O. Als nächstes bereiten eine 0,1 M NaH 2 PO 4 (Natriumdihydrogenphosphat) Lösung durch Zugabe von 13,79 g NaH 2 PO 4 zu 1 l dH 2 O. </li><li> Daraufhin wird die 0,1 M Na 2 HPO 4 -Lösung mit 0,1 M NaH 2 PO 4 -Lösung auf pH 8,5. Hinweis: das wird die Arbeitsstammlösung von 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) sein. </li><li> Vorbereiten einer Homogenisierung Lösung von 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) durch Zugabe von 0,3% Triton X-100. HINWEIS: Die Homogenisierung Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Prepare ein 1,6 mM SAH (MW = 384,4) durch Auflösen von 6,15 mg von SAH in 10 ml 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Vorbereiten einer 1,6 mM DTNB (MW = 396,4) durch Auflösen von 6,3 mg DTNB in 10 ml 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Halten Sie die frische DTNB-Lösung auf Eis bis zum Gebrauch. </li><li> Bereiten Sie eine 1 mM DZNep.HCl (MW = 298,73) durch Lösen von 0,3 mg DZNep in 1 ml dH 2 O Weiter verdünnt man das 1 mM DZNep Lösung in einer Reihe von Konzentrationen von 1,000 &amp; mgr; M bis 0,002 &amp; mgr; M in dH 2 O. </li><li> Um die SAH-Hydrolase-Hemmung durch DZNep messen, bereiten eine Rohenzymextrakt Mücken: homogenisieren 10 Nicht-Blut-fed erwachsenen Mücken in 1 ml eiskaltem 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), das 0,3% Triton X- 100, mit einem Glas Gewebehomogenisator. Übertragen Sie das Homogenat zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugieren des Homogenats für 5 Minuten bei 10.000 × g bei 4 ° C. Den Überstand in ein sauberes1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden der Überstand als Enzymquelle für die SAH biochemischen Assays. </li><li> Für die Blindbehandlung (dh keine DZNep kein Enzym) werden 50 &amp; mgr; l 1,6 mM SAH, 50 ul 1,6 mM DTNB, und 100 &amp; mgr; l 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) auf die einzelnen Vertiefungen einer 96-well, Flachboden-Mikrotiterplatte. </li><li> Für die Kontrolle (dh, kein DZNep) werden 50 &amp; mgr; l 1,6 mM SAH, 50 ul 1,6 mM DTNB, 50 &amp; mgr; l 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) und 50 ul Enzym (SAH Hydrolase aus Rohextrakt) erhaltenen Individuums Brunnen. </li><li> Für DZNep Behandlungen, fügen Sie 50 ul 1,6 mM SAH, 50 ul 1,6 mM DTNB, 50 ul Enzym und 50 ul ausgewählt DZNep Konzentration auf einzelne Vertiefungen. Bereiten Sie 4 Wiederholungen pro Behandlung und Kontrolle. </li><li> Lesen der optischen Dichte (OD) der SAH Enzymproben bei 405 nm für 5 Minuten bei 20 s Intervallen unter Verwendung eines 96-Well-Mikrotiterplatten-Lesegerät. </li><li> Die OD des Leer OD von Steuer einnd Behandlung OD von jedem erhalten gut. Berechnen der verbleibenden SAH-Hydrolase-Aktivität unter Verwendung der folgenden Gleichung Prozent:% Restaktivität = (OD Behandlung / Kontrolle OD) × 100. </li></ol>

<ol>
	<li>Gatton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+mosquito+behavioural+adaptations+to+malaria+control+in+Africa.">The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa.</a> Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).</li><li>Sternberg, E. D., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+adaptation+to+temperature+and+the+implications+for+vector-borne+diseases.">Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases.</a> Trends in Parasitology. , (2014).</li><li>Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2La+chromosomal+inversion+enhances+thermal+tolerance+of+Anopheles+gambiae+larvae.">2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae.</a> Malaria Journal. 8, 147 (2009).</li><li>Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+differentiation+and+adaptation+to+human+environments+in+the+Anopheles+gambiae+complex.">Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).</li><li>Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Cancer+Therapeutics.">Update on Cancer Therapeutics.</a> Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).</li><li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation:+a+dynamic+mark+in+health,+disease+and+inheritance.">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+oogenesis+and+germ+stem+cell+maintenance+by+the+Drosophila+histone+methyltransferase+Eggless/dSetDB1.">Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1.</a> Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).</li><li>Conrad, T., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosage+compensation+in+Drosophila+melanogaster:+epigenetic+fine-tuning+of+chromosome-wide+transcription.">Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).</li><li>Miranda, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DZNep+is+a+global+histone+methylation+inhibitor+that+reactivates+developmental+genes+not+silenced+by+DNA+methylation.">DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMA-1,+a+Mutant+p53+Reactivator,+Restores+the+Sensitivity+of+TP53+Mutant-type+Thyroid+Cancer+Cells+to+the+Histone+Methylation+Inhibitor+3-Deazaneplanocin+A+(DZNep).">PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep).</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).</li><li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Deazaneplanocin+A+(DZNep),+an+inhibitor+of+S-adenosyl-methionine-dependent+methyltransferase,+promotes+erythroid+differentiation.">3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polycomb+group+protein+EZH2+is+a+novel+therapeutic+target+in+tongue+cancer.">The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer.</a> Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).</li><li>Nakagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+therapy+with+the+histone+methyltransferase+EZH2+inhibitor+3-deazaneplanocin+A+inhibits+the+growth+of+cholangiocarcinoma+cells.">Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells.</a> Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).</li><li>Crea, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+inhibits+tumorigenicity+and+tumor+progression+in+prostate+cancer.">Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer.</a> Molecular Cancer. 10, 40 (2011).</li><li>Vella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZH2+down-regulation+exacerbates+lipid+accumulation+and+inflammation+in+in+vitro+and+in+vivo+NAFLD.">EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb-repressive+complex+2-mediated+gene+repression+selectively+induces+apoptosis+in+cancer+cells.">Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells.</a> Genes &amp; Development. 21, 1050-1063 (2007).</li><li>Chiang, P. K., Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+biochemical+transmethylations+by+3-deazaadenosine+in+vivo.">Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo.</a> Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).</li><li>Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+(PRC2)+protein+ESC+regulates+insect+developmental+timing+by+mediating+H3K27me3+and+activating+prothoracicotropic+hormone+gene+expression.">Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Es gibt mehrere Schritte für die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls. Für die Larventest sollte darauf geachtet werden, um korrekt zu kennzeichnen und zu replizieren jede Testkonzentration werden. Randomisierung von Proben und das Hinzufügen der benannten Menge des Arzneimittels an die jeweiligen Testbrunnen ist ein wichtiger Teil dieser Versuchsanordnung. Vor der Zugabe der 2. Larvenstadium von Moskitolarven in eine 96-Well-Mikroplatte, kann jede Larve auf einem Papiertuch für 2-3 sec gesetzt, um ü...

Malaria ist für die höchste Anzahl von Insekten verursachten Todesfälle in der Welt verantwortlich. Schätzungsweise 219 Millionen Fälle treten jährlich weltweit, was zu etwa 660.000 Todesfällen, vor allem in Afrika ein. Trotz aller gemeinsamen Bemühungen, Malaria Programme mehrere Herausforderungen. Während insektizide behandelten Moskitonetzen und Innenrest Spritzen bilden wichtige Komponenten des Programms, Resistenz gegen Insektizide in der lokalen Bevölkerung behindern diese Bemühungen 2. Die rasche Zunahme der Insektizide resistent Mückenpopulationen weitgehend auf die Fähigkeit der Malariamücken, schnell auf Veränderungen in ihrer Umgebung anpassen und nutzen unterschiedliche Nischen 3,4,5 zugeschrieben. Um die bestehenden Mechanismen der Insektizid-Resistenz zu überwinden, ist die Erforschung von neuartigen Insektizid Ziele und nächste Generation Verbindungen gewährleistet. Eine einfache, Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Bestimmung der Wirksamkeit von experimentellen Insektizide auf die verschiedenen Entwicklungsstadien der Malaria-mosquitoes erheblich verbessern würde diese Bemühungen. Pharmakologische Untersuchungen der Wirkung von Medikamenten auf Zelllinien und Tiermodellen haben die Verwendung von epigenetischen Medikamenten als ein nützliches Werkzeug zur Modulation der Genetik und Physiologie von Zellen und Organismen hergestellt. DNA-Methylierung und Histon-Modifikation gibt zwei epigenetische Mechanismen, die die Genexpression in vielzelligen Organismen beeinflussen, ohne die zugrunde liegenden DNA-Sequenz 6. Post-translationale Modifikationen wie Methylierung spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Zellintegrität und Genexpression und kann einige grundlegende Prozesse 7,8,9 beeinflussen. Forschung in einigen Insektenarten haben die Bedeutung der Epigenetik in Verfahren, die Oogenese hervorgehoben und Erhaltung von Stammzellen 10 sowie Dosiskompensation 11. Jedoch werden solche Aspekte der Krankheitsvektoren noch erforscht werden. Verwendung einer Verbindung, dieses System in Mücken modulieren, können Sie uns mit in liefernSehenswürdigkeiten in der neuen Insektizid Zielpfade. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) ist eine bekannte Histonmethylierung Inhibitor, der Auswirkungen auf die verschiedenen Arten von Krebs wurden untersucht 12,13,14,15,16. DZNep ist ein stabiles wasserlösliches Arzneimittel, das epigenetische indirekt hemmt Histon Lysin N-methyltransferase (EZH2), eine Komponente der Polycomb repressive Komplex 2 (PRC2) in Säugerzellen. PRC2 spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Wachstums von Stammzellen in multizellulären Organismen und Histon-Methylierung ist ein Schlüsselaspekt der PRC2 vermittelte Gen-Silencing. Bei immungeschwächten Mäusen Zellen mit DZNep vorbehandelt wurde gezeigt, dass weniger tumorerzeugende 17 zu sein. Dieses Medikament wird immer für die Untersuchung anderer Krankheiten, wie zum Beispiel nicht-alkoholische Fettleber, in der EZH2 beteiligt ist 18 verwendet. DZNep ist ein etablierter S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) Hydrolaseinhibitors 19, 20. Die Hemmung der SAH-Hydrolase-Ergebnisse in eineAkkumulation von SAH und wiederum führt zur Hemmung der Methyltransferase-Aktivität durch die Begrenzung des verfügbaren methyl Donorgruppen. SAH ein Aminosäurederivat durch Organismen wie Insekten, in ihren Stoffwechselwege verwendet. Eine neue Studie hat gezeigt, dass DZNep in niedrigen Dosen können Diapause beeinflussen und verzögern die Entwicklung von Insekten 21 gezeigt. Hier wird ein robustes Verfahren, um die Auswirkungen einer wasserlöslichen Verbindung von verschiedenen Lebensstadien von Moskitos zu untersuchen wird entwickelt. Die drei Teile des Protokolls enthalten Anweisungen für die Prüfung der Auswirkungen einer wasserlöslichen Verbindung auf unreifen Moskitos, Erwachsenen Blut-Fütterung Frauen, und die Enzymaktivität der erwachsenen männlichen und weiblichen Mücken. Zuerst wird DZNep in Wasser gelöst, um unreifen Moskitos Entwicklung und das Überleben zu studieren. Dies wird in zwei Konzentrationen durchgeführt, um alle Unterschiede, die sich aus 10-fachen Anstieg der Wirkstoffexposition zu vergleichen. Um die Wirkung des Medikaments auf erwachsene weibliche Mücken, DZNep erkundenauf defibrilliert Schafblut hinzugefügt und das Blut künstlich zu Frauen geleitet. Anschließend wird das Ergebnis des Medikaments auf Fruchtbarkeit sucht. Schließlich wird ein Test der enzymatischen Aktivität unter Verwendung von 5,5&#39;-Dithiobis (2-nitrobenzoesäure) (DTNB) als Indikator, um den Effekt auf DZNep SAH Hydrolase Hemmung in erwachsene männliche und weibliche Mücken bestimmen. Während dieses Protokoll mit einem Malaria-Mücke, Anopheles gambiae entwickelt, kann es leicht zur Untersuchung der Wirkungen von Verbindungen der Zinsen auf Stechmückenarten oder andere Insekten angepasst werden. Die in diesem Protokoll aufgeführten Techniken können nicht effizient auf ein Arzneimittel mit begrenzter oder keiner Löslichkeit in Wasser oder wäßrigen Medien angewendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Name of the Reagent/Equipment&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalgue Number</td>
			<td style="width:125px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plate</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7682-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Sorvall Fresco</td>
			<td>76003758</td>
			<td>A different centrifuge can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colored tape rolls</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S68134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTNB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DZNep.HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMLO305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Egg dish cups</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter papers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-795E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass feeders</td>
			<td>Virginia Tech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass tissue homogenizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating element</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">NC0520091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Percival scientific</td>
			<td>I36VLC8</td>
			<td>A different incubator can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, &#160;2 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>22-283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, 1.5 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4910 000.069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-3154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-8643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter&#160;</td>
			<td>Mettler Toledo 7easy</td>
			<td>S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td>M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SAH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9384</td>
			<td>store at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicological assays for testing effects of an epigenetic drug on development, fecundity and survivorship of malaria mosquitoes

Insektizidresistenz stellt ein großes Problem für die Malariakontrollprogrammen. Mücken Anpassung an eine Vielzahl von Veränderungen in der Umwelt schnell, so dass die Malaria unter Kontrolle eine allgegenwärtige Problem in tropischen Ländern. Die Entstehung von resistenten Populationen Insektizid garantiert die Erforschung von neuartigen Arzneimittelziel Wege und Verbindungen für Vektor-Moskito-Kontrolle. Epigenetische Medikamente werden auch in der Krebsforschung etabliert, aber nicht viel über deren Auswirkungen auf Insekten bekannt. Diese Studie liefert ein einfaches Protokoll für die Prüfung der toxikologischen Wirkungen von 3-Deazaneplanocin A (DZNep), eine experimentelle zugelassene epigenetische Arzneimittel zur Krebstherapie, in der Malaria-Vektor, Anopheles gambiae. Eine konzentrationsabhängigen Anstieg der Sterblichkeit und Abnahme der Größe wurde in unreifen Moskitos zu DZNep ausgesetzt beobachtet, während die Verbindung reduziert die Fruchtbarkeit der erwachsenen Mücken in Bezug auf Behandlungen zu kontrollieren. Darüber hinaus gab es eine drogenabhängige Abnahme der S -Adenosylhomocystein (SAH) Hydrolaseaktivität in Mücken nach Exposition gegenüber DZNep Bezug auf Behandlungen zu kontrollieren. Diese Protokolle stellen die Forscher mit einer einfachen, Schritt-für-Schritt-Verfahren, um mehrere toxikologische Endpunkte für ein experimentelles Medikament zu beurteilen und wiederum zeigen eine einzigartige mehrgliedrige Ansatz für Ausflüge in die toxikologischen Wirkungen von wasserlöslichen epigenetische Arzneimittel oder Verbindungen Interesse gegen vector Mücken und andere Insekten.

Figur 1 ist eine schematische Darstellung der Assays; es die verschiedenen Schritte des in diesem Artikel genannten Verfahren beschreibt. Da das Protokoll auf die verschiedenen Lebensstadien Mücken basiert, gibt es keine besondere Reihenfolge für die Experimente detailliert hier folgen. Der Benutzer kann wählen, einen oder mehrere Assays gleichzeitig durchzuführen, je nach Proben Verfügbarkeit. Abbildung 2 zeigt die für den unreifen Moskitos Ent...

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Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

Toxikologische Tests zur Prüfung Auswirkungen eines Epigenetische Drug für Entwicklung, Fruchtbarkeit und Hinterbliebenen von Malariamücken

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Aufrufe.  Virginia Tech. A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition. 

Serie: Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

Injektion eines. stephensi Embryonen zu generieren Malaria-resistenter Moskitos

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Forschung

Biologie

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protokoll für Dengue-Infektionen in Mücken (Aedes aegypti) und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito.    This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed.  The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protokoll für Plasmodium falciparum-Infektionen in Mücken und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced, as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission. Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

Verhinderung der Ausbreitung von Malaria und Dengue-Fieber mit Hilfe gentechnisch veränderter Moskitos

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

Ein besseres Mosquito: Identifizierung der Gene aktivieren Malaria und Dengue-Fieber Widerstand in A. gambiae und A. aegypti Moskitos

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

Visualisierung der mitochondrialen Atmungskette Funktion mit Cytochrom C Oxidase / Succinat-Dehydrogenase (COX / SDH) Double-Kennzeichnung Histochemie

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Ein Multi-Nachweistest für Malaria tragenden Mücken

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Protokolle für die Prüfung der Toxizität von neuartigen Insektizide Chemikalien, Mücken

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...