Die Live-Zellmikroskopie ermöglicht es Forschern, die Kerndynamik von Spalthefe bei Mitose und Meiose in Echtzeit zu untersuchen. Die Stärke dieser Methode liegt in der Untersuchung nuklearer Prozesse in lebenden Zellen unter normalen physiologischen Bedingungen, wodurch toxische Fixierungen und Flecken überflüssig werden. Diese Technik befasst sich mit Fragen im Zusammenhang mit Protein-Timing, Stabilität und Mobilität, die möglicherweise nicht für genetische oder biomechanische Manipulationen geeignet sind.
Es ist wichtig, vor der Bildgebung genau auf die Gesundheit und Fitness von Spalthefezellen zu achten. Untersuchen Sie immer Morphologie und Wachstumsmerkmale, um die Konsistenz der Ergebnisse über Experimente hinweg zu gewährleisten. Dieses Protokoll zeigt die relativ einfache Möglichkeit, Mikroskopdias vorzubereiten, die bei korrekter Beherrschung die Konsistenz und Reproduzierbarkeit einer längeren Live-Zell-Bildgebung verbessern können.
Um zellstoffabhängig von der kryogenen Aufwachplatte zu beginnen, streichen Sie sie auf JA-Platten und bebrüten sie bei 25 Grad Celsius oder 32 Grad Celsius, je nach Hefegenotyp, um Spalthefestämme aus der kryogenen Konservierung aufzuwecken. Verwenden Sie dann eine sterile Schleife, um Zellen aus einzelnen Kolonien in den erwachten Spalthefestämmen zu pflücken und sie in Reagenzgläser mit drei Millilitern YES flüssigem Medium zu impfen. Die Rohre bei 150 bis 220 U/min in einen Shaker geben, um über Nacht bei 25 oder 32 Grad Celsius zu wachsen, bis zur Späten Logphase mit einem gewünschten optischen Dichtewert von 0,7 bis 1,0.
Übertragen Sie 10 Mikroliter der Kultur auf ein Mikroskopschlitten. Setzen Sie einen Deckelschlupf auf und legen Sie ihn unter ein Mikroskop, um nach der richtigen Zellmorphologie und dem Ernährungszustand zu suchen. Um ein Mikroskop-Dia für Mitose oder Meiose-Analyse zunächst zwei Gramm Agarose in den 500-Milliliter-Kolben mit 100 Millilitern entweder minimalen Medium plus Ergänzungen für Mitose oder flüssiges sporförmiges Medium für Meiose hinzufügen.
Erwärmen Sie die Agarose-Lösung in einer Mikrowelle mit 60% Leistung in 10-Sekunden-Schritten oder legen Sie das Becherglas in einem 55 Grad Celsius Wasserbad für 10 Minuten. Wirbeln Sie die Lösung, um ein effizientes Schmelzen zu gewährleisten. Richten Sie zwei Mikroskopschlitten auf einem Pipettenspitzenhalter ein, wobei der obere Schlitten auf zwei Stapeln Laborband an beiden Enden ruht, um eine Querform zu bilden.
Passen Sie den Abstand zwischen den beiden Dias auf mehr als zwei Millimeter an, um in den folgenden Schritten ein dickes Pad für eine längere Bildgebung zu bilden. Nach dem Abkühlen der geschmolzenen Agarose für eine Minute bei Raumtemperatur, entfernen Sie den oberen Schieber und verwenden Sie eine breite Bohrung Pipettenspitze, um 50 bis 100 Mikroliter auf dem unteren Schlitten zu verteilen, um einen Punkt zu machen. Bevor die Agarose abkühlt, legen Sie die obere Rutsche oben auf, um ein Streupad von etwa einem und 1/2 bis zwei Zentimetern Durchmesser zu erzeugen.
Eine optimale Live-Zell-Bildgebung ist für nachfolgende Datenverarbeitungsschritte von entscheidender Bedeutung. Achten Sie darauf, Luftkugeln in der geschmolzenen Agarose zu beseitigen und ein dünnes Pad für Bildgebungszeiträume von mehr als vier Stunden zu erstellen. Zur Untersuchung mitotischer Ereignisse wachsen Zellen aus Starterkulturen entweder in flüssigem EMM oder PMG plus Ergänzungen über Nacht.
Übertragen Sie einen Milliliter der Kultur in eine Küvette und messen Sie das Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 595 Nanometern. Das Zellwachstum gilt als Mid-Log-Phase, wenn die optische Dichte 0,4 erreicht. Zentrifugieren Sie dann einen Milliliter der Zellsuspension bei 1, 375 mal g für eine Minute.
Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in minimalem Medium plus Ergänzungen zu einem endgültigen Volumen von 100 Mikroliter. Um meiotische Ereignisse zu bilden, wachsen Zellen aus Starterkulturen in minimalen Medien plus Ergänzungen über Nacht. Das Zellwachstum gilt als Spätpunktphase, wenn die optische Dichte bei 595 Nanometern zwischen 0,7 und eins liegt.
Als nächstes erhalten aus den späten Log-Kulturen 500 Mikroliter jeder Mate-Typ-Stamm, H negativ und H positiv, und kombinieren, um eine Ein-Milliliter-Zellsuspension zu machen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1, 375 mal g für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter flüssigen Maltose-Extrakt.
Wiederholen Sie die Maltose Extrakt waschen drei weitere Male, um eine effiziente Nährstoffentfernung zu gewährleisten. Nach dem letzten Maltose-Extrakt waschen Sie die Zellen in einem Milliliter Maltose-Extrakt wieder aussetzen und übertragen Sie die Mischung in einen 50-Milliliter-Kolben mit neun Milliliter Maltose-Extrakt. 12 bis 16 Stunden bei 22 bis 25 Grad Celsius bei einer minimalen Drehzahl zwischen 50 und 100 Umdrehungen pro Minute inkubieren.
Das Auftreten vieler runder Spalthefeklumpen, die aus einer reichlichen Selbstflokulation resultieren, deutet auf eine effiziente Paarung hin. Als nächstes nehmen Sie eine Ein-Milliliter-Probe der Paarungskultur und Zentrifuge bei 1, 375 mal g für eine Minute. Entfernen Sie 750 Mikroliter des Überstandes und suspendieren Sie die Zellen im verbleibenden Überstand.
Wirbel kräftig für fünf Sekunden, um die Klumpen zu stören. 20 Mikroliter einer mitotischen oder meiotischen Zellsuspension auf einem 2%Agarose-Pad verteilen. Entfernen Sie überschüssiges Medium, indem Sie das Dia umkehren und zwei bis drei Sekunden lang auf das fusselfreie Papiertuch legen.
Drehen Sie die Folie und legen Sie vorsichtig einen Glasdeckel auf der Oberseite des Pads, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen zu erzeugen. Um eine Zellmonoschicht zu erstellen, drehen Sie den Coverslip im Uhrzeigersinn mit dem Zeigefinger für eine volle Drehung für Mitosezellen oder zwei volle Umdrehungen für Meiosezellen. Stellen Sie sicher, dass sich die Zellmaterie über das Agarose-Pad verteilt, was eine bessere Trennung einzelner Zellen oder Asci ermöglicht.
Mit Hilfe eines kleinen Holzstabes geben geschmolzene Kohlenwasserstoff Dichtmittel entlang der Ränder des Deckelrutsches, um jedes Agarose-Pad zu versiegeln. Sobald das Agarose-Pad versiegelt ist, legen Sie es auf die Mikroskop-Bühne. Schalten Sie die Temperaturkammer ein und stellen Sie sie auf die gewünschte Temperatur ein.
Legen Sie eine Platte mit einem nassen Papiertuch in die Kammer, um die Feuchtigkeit des Mikroskopsystems zu kontrollieren. Lassen Sie es für 10 bis 15 Minuten unter den entsprechenden bildgebenden Bedingungen ausdemieren. Dadurch können sich alle verbleibenden Luftblasen auflösen und alle Agaroseverschiebungen in letzter Minute auftreten.
Verwenden Sie das 40X-Ziel, um geeignete Bildfelder zu finden. Wechseln Sie zum 60X-Ziel, um mit der Datenerfassung zu beginnen. Wählen Sie in der Software, die die Mikroskopfunktion steuert, die Mikroskopfiltersätze aus, die am besten zu den unter Beobachtung stehenden Fluorophoren passen.
Passen Sie die Anregungswellenlängen an die verwendeten Fluorophore an, verwenden Sie die niedrigste Anregungsleistung, die ein konsistentes Signal erzeugt, und verwenden Sie Belichtungszeiten von vier bis acht Stunden, um akzeptable, aber quantifizierbare und reproduzierbare Bildgebungsdaten zu generieren. Sammeln Sie mindestens sechs Erfassungszeitpunkte pro Stunde. Wählen Sie in der Bildsammlungssoftware mindestens einen Fluoreszenzkanal aus, von dem datenerfasst werden soll, und verwenden Sie einen Z-Bestand aus 13 Abschnitten mit 0,5 Mikrometer Abstand.
Laden Sie in der Fidschi-Software ein dekonvolvedes Bild hoch, indem Sie die Funktion Bio-Formats Importer unter dem Plug-In-Menü auswählen. Wählen Sie im Popup-Fenster Importoptionen Hyperstack, Standardfarbmodus aus, aktivieren Sie Autoscale und drücken Sie die Schaltfläche OK. Stellen Sie sicher, dass das angezeigte Fenster die richtige Anzahl von Fluoreszenzkanälen und Zeitrahmen enthält, indem Sie seitlich auf den entsprechenden Balken unten scrollen.
Speichern als Tiff-Datei, die keine Daten komprimiert. Verwenden Sie dann im Menü Analysieren die Option Messungen festlegen, um verschiedene Parameter auszuwählen. Beispiel: Bereich, Min max Grauwert, Integrierte Dichte, mittlerer Grauwert, Median, Stapelposition, Umfang und Anzeigebeschriftung.
Wählen Sie Farbe und klicken Sie auf das Kanalwerkzeug. Überprüfen Sie im Popup-Fenster Kanäle den Farbkanal, für den Intensität oder Fläche gemessen wird. Wählen Sie Bild, dann Tippen und klicken Sie auf 32-Bit.
Wählen Sie die Funktionen Anpassen und Schwellenwert im Menü Bild aus. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Dunkles Hintergrund, wählen Sie die Standardmethode aus, und wählen Sie Rot aus, um die Interessensignale zu überlagern. Verwenden Sie das Zauberstab-Tool, um jede Struktur von Interesse hervorzuheben, und drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten ROI zum Popup-ROI-Managerfenster hinzuzufügen.
Öffnen Sie anschließend den ZIP-ROI-Ordner, um den ROI-Manager zu laden, und klicken Sie auf jede ROI-Idliste im linken Seitenbereich. Wählen Sie Messen im Menü Analysieren aus, und wiederholen Sie diesen Befehl für jeden ROI-Bezeichner, um die Objekte zu quantifizieren, die für alle Slices des Image-Stacks von Interesse sind. Speichern Sie die Ergebnisse als CSV-Datei für die statistische Analyse.
In dieser Studie, wenn Zellen aufgrund von Nährstoffbeschränkung oder Überwucherung verhungern, werden sie überschüssige Vakuolen und verminderte Zellgröße zeigen. Logarithmische Zellen zeigen aktive DNA-Replikation und Zellteilung sowie pannukleare Tos4-GFP-Expression und Sad1-DsRed-Foci-Trennung. Wenn sie sich nicht paaren, wie es der Fall ist, wenn Zellen nicht ausreichend an Stickstoff verhungern, wird sie daran gehindert, in die Meiose einzutreten.
Es wird ein Paar Spaltzellen gezeigt, die sich einer Karyogamie unterziehen. Die robuste Flockung der Paarungszellsuspension erhöht die Zell-zu-Zell-Interaktion und weist somit auf eine erfolgreiche Paarung und effiziente meiotische Induktion hin. Zygotische Asci nehmen mehrere Formen an, einschließlich der Zick-Zack- und Bananenzellformen.
Bei der Mitose, wenn Zellen von der Metaphase zur Telophase übergehen, beinhaltet die erste Veränderung eine Kontraktion der kerntechnischen Größe in der Metaphase, während die zweite die Zellspaltung während der Anaphase zeigt. Neben der gemeinsamen Trennung sergregiöser Zellen weisen meiotische Zellen bei der homologen Rekombination eine kernnukleare Oszillation auf und eine weitere Reduktion der Nukleoside am Ende der Anaphase II.It liegt in der Verantwortung der Forscher, sicherzustellen, dass Experimentierparameter experimenteübergreifend reproduziert werden können und dass die gesammelten Daten für die nachgelagerte Analyse geeignet sind. Die Live-Zell-Bildgebung hat es den Forschern ermöglicht, die Mechanik der nuklearen Teilung bei Mitose und Meiose genau zu untersuchen.
Da fluoreszierende Tags und Mikroskopfähigkeiten die Anzahl und Art der Prozesse verbessern, die wir beobachten können, wird es zunehmen.
