Diese Arbeit wurde von Award finanziert keine. OCE-1323652 durch die National Science Foundation Ocean Science Postdoctoral Fellowship und Award-no.1012629 von Burroughs Wellcome Fonds Postdoctoral Enrichment Program.

1. Entfernung des Paraffins
Achtung: Führen Sie die folgenden Schritte unter einem Abzug.
<ol><li>Wachsentfernung dünn geschnittene Paraffin-eingebetteten Folien mit 100 % Xylol unter der Haube in Coplin Gläser für 10 Minuten. Verwenden Sie keine Coplin Plastikdosen, wie Xylol Kunststoff schmilzt. Sterilisieren Sie die Coplin Gläser im Autoklav vor Gebrauch.</li>
	<li>Bereiten Sie vier sterile Coplin Gläsern mit den folgenden: 100 % Ethanol, 80 % Ethanol, Ethanol 70 % und 60 % Ethanol. Das Ethanol mit RNase-freies Wasser zu verdünnen.<ol>
<li>Die Folien zu den sterilen Coplin Behälter mit 100 % Ethanol zu übertragen und für 10 Minuten einweichen. Leeren Sie nach 10 min Coplin Glas zu, und ersetzen Sie durch neue 100 % Ethanol. Die Folien wieder für 10 Minuten einweichen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Folien auf die sterile Glas Coplin mit 80 % igem Ethanol für 1 min.</li>
		<li>Übertragen Sie die Folien auf die sterile Coplin Glas mit 70 % igem Ethanol für 1 min.</li>
		<li>Übertragen Sie die Folien auf die sterile Glas Coplin mit 60 % Ethanol für 1 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbehandlung von Folien für die Vorbereitung der RNA-Sonde Hybridisierung
<ol><li>Führen Sie die folgenden Waschungen bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben. Führen Sie Raumtemperatur Waschungen auf einem Orbitalschüttler mit langsamer Geschwindigkeit. Verwenden Sie sterile Folie Versandtaschen mit Platz für bis zu fünf Folien für das Waschen der Folien.</li>
	<li>Die Folien auf einem sterilen Folie Mailer mit 18 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) übertragen. Wäsche für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Gießen Sie 1 X PBS, und sofort behandeln Sie das Gewebe auf den Folien mit Proteinase K Sonde Durchdringung des Gewebes ermöglichen. Die Folie Mailer ca. 18 mL Proteinase K-Lösung hinzufügen (siehe Tabelle 1 für die Lösungskonzentration Arbeit). Inkubation bei 37 ° C für 15 Minuten. Nicht schütteln.<ol>
<li>Während die Folien Inkubation sind, bereiten Sie prehybridization Puffer (Prehybe Puffer). Legen Sie den Prehybe-Puffer in einem kochenden Wasserbad für 10 min, dann auf einem Eisbad für 5 min abkühlen lassen. Nach einem Rezept von Prehybe Puffer siehe Tabelle 1.</li>
		<li>Stoppen Sie Verdauung der Proteinase K Reaktion durch Ausgießen der Proteinase K-Lösung zu, und sofort 18 mL 0,2 % Glycin-PBS-Lösung für Folie Mailer. Lassen Sie die Folie-Mailer für 5 min bei Raumtemperatur sitzen.</li>
		<li>Gießen Sie die 0,2 % Glycin-PBS-Lösung und jede Folie Mailer fügen Sie 18 mL 2 X Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC) Lösung hinzu. Waschen Sie die Folien in den 2 X SSC für 10 min bei Raumtemperatur, mit 100-150 u/min schütteln.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Prehybridization von Folien in Vorbereitung für die RNA-Sonde Hybridisierung
<ol><li>Während die Folien mit 2 gewaschen werden X SSC, erhalten einen neue sterile Folie Mailer und ca. 18 mL Prehybe Puffer in Folie Mailer. Legen Sie die Folie Mailer in Hybridisierung Backofen bei Hybridisierung Temperatur. Hinweis: Die Hybridisierung Temperatur hängt von der Sonde verwendet wird, aber in der Regel reicht von 50-60 ° C.</li>
	<li>Nach Abschluss der 2 X SSC Wäsche 2 x SSC und Ort Ausgießen der Folien in der Dia-Mailer in der Prehybe-Puffer in der Hybridisierung Ofen für 1 h.</li>
</ol>(4) Hybridisierung der RNA-Sonde
<ol><li>Während die Folien mit dem Prehybe-Puffer in der Hybridisierung Ofen Inkubation sind, bereiten Sie Hybridisierung-Sonde Lösung.<ol>
<li>Jede Sonde in Hybridisierung Puffer (0,5 µL der Sonde mit 24,5 µL Hybridisierung Puffer) verdünnen. Hinweis: Das Rezept für Hybridisierung Puffer findet sich in Tabelle 1. Ein Beispiel der Sonde Vorbereitung und Konzentrationen finden im Traylor-Knowles Et al. 11.</li>
		<li>Legen Sie die verdünnte Probe auf einem Heizblock 86-90 ° C für 12 min, dann für 1 min auf Eis abkühlen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie den Folie Mailer aus dem Ofen Hybridisierung und entfernen Sie Folien einzeln von der Folie-Mailer mit einer sterilen Pinzette. Legen Sie die Folien flach auf ein Papiertuch und wischen Sie vorsichtig überschüssiges Prehybe Puffer um Gewebeproben. Achten Sie darauf, nicht zu die Proben zu berühren und arbeiten schnell, um zu verhindern, Trocknung von Gewebeproben.</li>
	<li>Umschließen Sie das Gewebe mit einem PAP-Stift. Gelten Sie 25 µL der verdünnten Probe Lösung mit einer Pipette und bedecken Sie die Probe mit einem Kunststoff deckgläschen.<ol>
<li>Legen Sie die Proben in der Folie Feuchtigkeit Kammer mit 4 x SSC + 50 % Formamid-Lösung in den Boden der Kammer.</li>
		<li>Sobald Sonden auf alle Folien hinzugefügt wurden, legen Sie die Folie Feuchtigkeit Kammer in der Hybridisierung Ofen für mindestens 24 Stunden bei einer Hybridisierung-Temperatur von 50-60 ° C. Die Inkubationszeit sollte variiert abhängig von der Konzentration der Sonde jedoch mindestens 24 Stunden lang.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nehmen Sie nach der Übernachtung Inkubation mit der verwässerte Sonden die Folie Feuchtigkeit Kammer aus der Hybridisierung Ofen.<ol>
<li>Entfernen Sie Deckgläsern aus einzelnen Dias, ohne dabei das Gewebe verdrängen. In einer 1000 µL Pipette 1000 µL 2 X SSC-Lösung hinzufügen und die Folie vorsichtig abwaschen.</li>
		<li>Legen Sie die Folie in einem sterilen Folie Mailer mit 18 mL 2 X SSC-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Gießen Sie die Lösung und ersetzen Sie es mit 18 mL frische 2 X SSC. Wiederholen Sie die Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur mit sanft schütteln.</li>
		<li>Gießen Sie die 2 X SSC-Lösung. 18 mL 1 X SSC Lösung und Wäsche für 5 min bei Raumtemperatur hinzugeben. Gießen Sie 1 X SSC Lösung und ersetzen Sie es mit 18 mL frische 1 X SSC. Wiederholen Sie die Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur mit sanft schütteln.</li>
		<li>Gießen Sie die 1 X SSC. 18 mL 0,5 x SSC und Wäsche für 10 min bei 42 ° C ohne schütteln hinzugeben. Gießen Sie die 0,5 x SSC und ersetzen es mit 18 mL frische 0,5 X SSC. Ohne schütteln wieder für 10 min bei 42 ° C waschen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) Visualisierung der RNA-Sonde
Hinweis: Für die Visualisierung der Sonde, BM lila während des Entwicklungsprozesses verwendet werden. Allerdings müssen mehrere Wäschen vor diesem Schritt Vorbereitung der Proben für das Beflecken.
<ol><li>Waschen Sie die Folien mit 18 mL Puffer alkalische Phosphatase (AP-Puffer), ohne MgCl2 für 1 min. Ausgießen der AP-Puffer ohne MgCl2, und 18 mL 1 X Boehringer Mannheim blockierende Puffer mit Maleic Säure-Puffer verdünnt. Mindestens 1 h bei Raumtemperatur in einer Dia-Mailer mit sanft schütteln inkubieren. Hinweis: Der Boehringer Mannheim blockierende Puffer Maleic Acid Puffer verwendet vorgefertigte und in dem Graben waschen und Block Puffer Set gekauft (erhältlich im Handel).<ol>
<li>Alternativ kann die Inkubation über Nacht bei 4 ° C durchgeführt werden. Mehr Sperrfrist verringert das Auftreten von unspezifischen Bindung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die 20 mL verdünnten DIG Anti-Digoxigenin-AP-Fab-Fragmente (Anti-DIG-Antikörper = 2 µL Anti-DIG-Antikörper + 20 mL 1 x Boehringer Mannheim blockierende Puffer). Das ist genug für den Einsatz in 1 Kunststoff-Folie-Mailer. Mehr von dieser Lösung müssen bereit sein, wenn mehr als eine Folie Mailer verwendet werden soll.</li>
	<li>Eine neue sterile Folie Mailer der Anti-DIG-Antikörper hinzu, und übertragen Sie die Folien auf die Folie-Mailer mit der Anti-DIG Antikörperlösung. Inkubation bei Raumtemperatur für 3 h mit sanft schütteln.</li>
	<li>Nach der Inkubation Ausgießen des Anti-DIG-Antikörpers und waschen Sie die Folien in der Dia-Mailer mit 18 mL AP-Puffer ohne MgCl2 für 5 min mit sanft schütteln.</li>
	<li>Der AP-Puffer ohne MgCl2, Gießen Sie aus und 18 mL AP-Puffer. Wäsche für 5 min mit sanft schütteln. Gießen Sie nach 5 min Inkubation den AP-Puffer, ersetzen Sie es mit 18 mL frisch AP-Puffer und waschen für 5 min mit sanft schütteln.</li>
	<li>Gießen Sie in der Dunkelheit die AP-Puffer und 18 mL BM lila an der Folie-Mailer. Die Folien bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, Überprüfung auf lila Farbe Entwicklung jedes ½ h. Reaktionszeiten für die Visualisierung variieren basierend auf der Sonde, die entwickelt wird. Hinweis: Anstelle von BM lila Visualisierung Entwicklungslösung erfolgen mit 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) und Nitro blau tetrazoliumsalz (NBT). Siehe Tabelle 1 für Anweisungen.</li>
	<li>Vorbeischauen Sie Farbentwicklung, die Dias auf eine neue sterile Folie Mailer mit 18 mL Tris-EDTA (TE)-Puffer für 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln zu übertragen.</li>
	<li>Gießen Sie die TE-Puffer und 18 mL RNase-freies Wasser auf die Folie Mailer und Wäsche für 1 min, im Dunkeln.</li>
	<li>Entfernen Sie die Folien aus dem Wasser, und trocknen Sie sie an den Rändern des Gewebes. Fügen Sie Glycerin Montage Medium hinzu und platzieren Sie die Deckgläsern. Speichern Sie die Folien bei 4 ° C bis Bilder aufgenommen werden können.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hughes, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Climate+Change,+Human+Impacts,+and+the+Resilience+of+Coral+Reefs.">Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs.</a> Science. 301 (5635), 933 (2003).</li><li>Chen, P. -. Y., Chen, C. -. C., Chu, L., McCarl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+economic+damage+of+climate+change+on+global+coral+reefs.">Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs.</a> Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).</li><li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+Reefs+Under+Rapid+Climate+Change+and+Ocean+Acidification.">Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification.</a> Science. 318 (5857), 1742 (2007).</li><li>Grasso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+identifies+candidate+genes+for+key+roles+in+coral+development.">Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development.</a> BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).</li><li>Miller, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+innate+immune+repertoire+in+Cnidaria+-+ancestral+complexity+and+stochastic+gene+loss.">The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss.</a> Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).</li><li>Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox+genes+in+the+coral+Acropora+millepora:+divergent+expression+patterns+reflect+differences+in+developmental+mechanisms+within+the+Anthozoa.">Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa.</a> BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).</li><li>Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+and+expression+of+four+coral+G+protein-coupled+receptors+distinct+from+all+classifiable+members+of+the+rhodopsin+family.">Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family.</a> Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).</li><li>Darby, I. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization. , (1987).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals.">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).</li><li>Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+spatiotemporal+expression+of+RNAs+and+proteins+in+the+starlet+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Nature Protocols. 8, 900 (2013).</li><li>Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+Sox+genes+through+embryonic+development+in+the+ctenophore+Mnemiopsis+leidyi+is+spatially+restricted+to+zones+of+cell+proliferation.">Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation.</a> EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).</li><li>Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+and+developmental+expression+of+Dmrt+genes+in+the+starlet+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> EvoDevo. 6 (1), (2015).</li><li>Barry, S. N., Crow, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HoxA11+and+HoxA13+in+the+evolution+of+novel+fin+morphologies+in+a+representative+batoid+(Leucoraja+erinacea).">The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea).</a> EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).</li><li>Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdivision+of+arthropod+cap-n-collar+expression+domains+is+restricted+to+Mandibulata.">Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata.</a> EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).</li><li>Piatigorsky, J., Kozmik, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubozoan+jellyfish:+an+Evo/Devo+model+for+eyes+and+other+sensory+systems.">Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Protokoll beschriebene Methode wurde von der früheren Arbeit in medizinischen und evolutionäre Entwicklungsforschung8,9,10,12,17geändert. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Nuancen der eine in Situ Hybridisierung mit einer Grabung beschriftet RNA Gegenstrang Sonde auf Erwachsenen Korallen, die konserviert und in Paraffin eingebett...

Korallen sind kritische Ökosystem Bauherren und wichtig für die biologische Vielfalt in den Ozean und menschliche Gesundheit1,2,3. Sie sind bedroht durch Klimawandel und anderen anthropogenen Stressfaktoren, und viele Korallenarten gelten als vom Aussterben bedroht. Somit ist ein erheblicher Bedarf für Zelluläre und molekulare Werkzeuge zur diagnose von Korallen unter Stress. Außerdem ist es wenig über wo Gene innerhalb von Erwachsenen korallengewebes und daher wenig Verständnis für die Funktionen dieser Gene exprimiert werden verstanden. Um dieses Problem zu beheben, haben wir in Situ Hybridisierung (ISH), häufig verwendete Protokoll in der Humanmedizin und evolutionären Entwicklungsbiologie, für den Einsatz auf Paraffin-eingebetteten Gewebeproben von Erwachsenen Korallen angepasst. Diese Technik ist mächtigsten auf Erwachsenen Korallen verwendet, die ein belastendes Ereignis wie Hitzestress unterzogen wurden. Doch diese Technik kann auf eine Vielzahl von Geweben und Lebensphasen in Korallen verwendet werden und beschränkt sich nicht nur Wärme betonte Korallen4,6,7. Darüber hinaus kann diese Technik auf Gewebe oder Zellen von jeder riffbildende verwendet werden, solange gibt es cDNA-Sequenzinformationen.
Der Zweck dieser Methode ist, RNA-Sonden in Erwachsenen korallengewebe zu visualisieren, die bewahrt und in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten. Diese Methode ist ein leistungsfähiges Diagnosetool, das für die Visualisierung von Nukleinsäuren in Erwachsenen korallengewebe ermöglicht. Ursprünglich wurde diese Methode für die medizinische Diagnostik entwickelt, und es ist seitdem ein beliebtes Hilfsmittel in Bereichen wie Entwicklungsbiologie und evolutionären Entwicklungsbiologie8,9,10. ISH ist auch eine kritische Methode, vor allem in nicht-Modellsysteme, wenn genomische und transkriptomischen Sequenzdaten sind verfügbar, aber räumliche gen Expressionsmuster sind unbekannt. Für die diagnostische Arbeit in nicht-Modellsystemen ist diese Technik mächtig, weil sie angeben kann, welche Zellen und Geweben ein Gen des Interesses Express und zu mehr zielgerichtete Therapieansätze8,9,10führen, 11,12. Zu guter Letzt ist diese Technik qualitativer und leistungsfähiger, wenn gepaart mit quantitativen Gen Ausdruck Daten11.
In diesem Papier skizzierte Ansatz werden von Interesse für Forscher, die bereits eine Digoxigenin (DIG) entworfen haben-mit der Bezeichnung RNA-Sonde (Sinn und Antisense-Sonden) und sind nun bereit, in Situ Hybridisierung der Sonden zu einer Probe durchführen. Um diese Methode durchzuführen, benötigt zwei Schnittserien eines Gewebes, Paraffin Korallen für jede Sonde getestet. Ein Teil wird für die Sinne-Sonde und die andere für die antisense-Sonde verwendet werden. Die Sinn-Sonde wird ein Steuerelement an unspezifischen Bindung sein. Wenn Färbung in der Sinn-Sonde beobachtet wird, ist die antisense-Sonde nicht spezifisch für die RNA von Interesse. Sonden können für jedes Gen ausgedrückt ausgelegt werden. In diesem Protokoll werden mehrere Beispiele verwendet, die bisher gefunden wurden, während Hitzestress in Korallen ausgedrückt werden: FBJ murinen Osteosarkom viral Oncogene Homolog B (Fos-B), Activator Protein (AP1) und Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor 41 (TNFR 41)11. ISH mit DIG-Label RNA-Sonden wird vorgezogen mit radioaktiven Sonden, weil deren Handhabung viel sicherer10ist. Darüber hinaus ist diese Technik ist sehr empfindlich und kann auf eine Vielzahl von Geweben und Embryonen über Wärme-gestressten Erwachsenen Korallen13,14,15,16durchgeführt werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Denhardt&#39;s solution</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>70468 50 ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioworld Alkaline phosphatase buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-198-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide mailers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-17B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioworld Alkaline phosphatase buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-198-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide white apex superior adhesive</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3800080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS solution, pH 7.4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Pap Pen Liquid Blocker</td>
			<td>Promega</td>
			<td>22309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM Purple, 100 mL</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Wash and Block Buffer Set</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585762001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT/BCIP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11681451001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution, 500 mL size</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC Buffer 20X concentration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6639-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320102-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47670-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, AR (ACS), For Histological Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK866806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-EX0276-4S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PAV6232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridization oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97005-252, 97005-254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples

Korallen sind wichtige Ozean Wirbellosen, die entscheidend für die allgemeine Gesundheit der Meere sowie die menschliche Gesundheit sind. Korallen sind jedoch durch menschliche Einflüsse wie steigenden Meerestemperaturen und Versauerung bedroht. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, erwiesen Fortschritte in der Zell- und Molekularbiologie sich für die Gesundheit der Korallen Diagnose von entscheidender Bedeutung. Ändern einige der häufig in der Humanmedizin verwendet Techniken könnte erheblich verbessern Forscher Fähigkeit Korallen zu behandeln. Um dieses Problem anzugehen, wurde ein Protokoll zur in Situ Hybridisierung verwendet, vor allem in der Humanmedizin und evolutionären Entwicklungsbiologie angepasst für den Einsatz in Erwachsenen Korallen unter Stress.
Der Zweck dieser Methode ist den räumliche Ausdruck einer RNA-Sonde in Erwachsenen korallengewebe zu visualisieren, die in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten wurde. Diese Methode konzentriert sich auf die Entfernung des Paraffins und Rehydrierung der Probe, Vorbehandlung der Probe zur Durchlässigkeit der Probe, Pre-Hybridisierung Inkubation, Hybridisierung der RNA-Sonde und Visualisierung der RNA-Sonde zu gewährleisten. Dies ist eine leistungsfähige Methode, wenn nicht Modellorganismen mit um zu entdecken, wo bestimmte Gene exprimiert, und das Protokoll kann für andere Modellorganismen leicht angepasst werden. Die Methode ist jedoch beschränkt, dass es sich in erster Linie qualitative, da Ausdruck Intensität, abhängig von der Höhe der Zeit während der Visualisierung Schritt und die Konzentration der Sonde verwendet variieren kann. Darüber hinaus ist Geduld erforderlich, da dieses Protokoll bis zu 5 Tagen (und in vielen Fällen länger) abhängig von der verwendeten Sonde nehmen kann. Zu guter Letzt unspezifische Hintergrundfärbung ist üblich, aber diese Einschränkung überwunden werden kann.

Nach Abschluss dieses Protokolls, erfolgt die Identifikation von Zellen und Geweben, die die RNA-Sonde von Interesse zum Ausdruck bringen. Die repräsentativen Ergebnisse für dieses Protokoll sind für AP-1, FosB und TNFR41. Diese Ergebnisse, zuvor von Traylor-Knowles Et Al. veröffentlicht 11, Sonden zeigen räumliche Ausdruck der RNA auf Erwachsenen Korallen, die Hitze-Stress ausgesetzt waren. Zwei Beispiele verschiedener Färbung sind in <strong class=...

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In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Das Ziel dieses Protokolls ist in Situ Hybridisierung auf Erwachsenen Korallen Proben durchführen, die in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten wurden. Dies ist eine qualitative Methode zur Visualisierung des räumlichen Ausdrucks einer RNA Gegenstrang Sonde in Paraffin-eingebetteten Gewebe verwendet.

In Situ Hybridisierung Techniken für Paraffin-eingebetteten Erwachsenen Korallen Proben

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

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Research

JoVE Journal

Environment

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

7.0K Aufrufe.  University of Miami, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Sciences. Das Ziel dieses Protokolls ist in Situ Hybridisierung auf Erwachsenen Korallen Proben durchführen, die in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten wurden. Dies ist eine qualitative Methode zur Visualisierung des räumlichen Ausdrucks einer RNA Gegenstrang Sonde in Paraffin-eingebetteten Gewebe verwendet.

Serie: In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American lobsters. Recent work in exploited crustacean populations (crabs and lobsters) suggests that there are circumstances where mature females are unable to achieve their full reproductive potential due to sperm limitation. To examine this possibility in different regions of the American lobster fishery, a reliable and noninvasive method was developed for sampling large numbers of female lobsters at sea. This method involves inserting a blunt-tipped needle into the female&#39;s seminal receptacle to determine the presence or absence of a sperm plug and to withdraw a sample that can be examined for the presence of sperm. A series of control studies were conducted at the dock and in the laboratory to test the reliability of this technique. These efforts entailed sampling 294 female lobsters to confirm that the presence of a sperm plug was a reliable indicator of sperm within the receptacle and thus, mating. This paper details the methodology and the results obtained from a subset of the total females sampled. Of the 230 female lobsters sampled from George&#39;s Bank and Cape Ann, MA (size range = 71-145 mm in carapace length), 90.3% were positive for sperm. Potential explanations for the absence of sperm in some females include: immaturity (lack of physiological maturity), breakdown of the sperm plug after being used to fertilize a clutch of eggs, and lack of mating activity. The surveys indicate that this technique for examining the mating success of female lobsters is a reliable proxy that can be used in the field to document reproductive activity in natural populations.

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Fishery-induced changes to exploited crustacean fisheries, such as the American lobster fishery, could potentially influence their reproductive dynamics, leading to a reduction in mating success. This study&#39;s goal was to develop a noninvasive method for ascertaining the mating success of female lobsters that may be physiologically or functionally mature.

Eine nichtinvasive Methode zur<em&gt; In situ</em&gt; Bestimmung des Gegen Erfolg im Frauen amerikanischen Hummer (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

Forschung

Umwelt

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Experimentelles Protokoll zum Nachweis<em&gt; Cyanobakterien</em&gt; In flüssigen und festen Proben mit einem Antikörper Microarray-Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial communities, a relatively precise but effort-intensive technique to assay microbial community composition is phospholipid fatty acid (PLFA) analysis. PLFA was developed to analyze phospholipid biomarkers, which can be used as indicators of microbial biomass and the composition of broad functional groups of fungi and bacteria. It has commonly been used to compare soils under alternative plant communities, ecology, and management regimes. The PLFA method has been shown to be sensitive to detecting shifts in microbial community composition.
An alternative method, fatty acid methyl ester extraction and analysis (MIDI-FA) was developed for rapid extraction of total lipids, without separation of the phospholipid fraction, from pure cultures as a microbial identification technique. This method is rapid but is less suited for soil samples because it lacks an initial step separating soil particles and begins instead with a saponification reaction that likely produces artifacts from the background organic matter in the soil. 
This article describes a method that increases throughput while balancing effort and accuracy for extraction of lipids from the cell membranes of microorganisms for use in characterizing both total lipids and the relative abundance of indicator lipids to determine soil microbial community structure in studies with many samples. The method combines the accuracy achieved through PLFA profiling by extracting and concentrating soil lipids as a first step, and a reduction in effort by saponifying the organic material extracted and processing with the MIDI-FA method as a second step.

The article describes a method that increases throughput while balancing effort and accuracy for extraction of lipids from the cell membranes of microorganisms for use in characterizing both total lipids and the relative abundance of indicator lipids to determine soil microbial community structure in studies with many samples.

Eine Lipid-Extraktions- und Analysemethode zur Charakterisierung von Boden-Mikroben in Experimenten mit vielen Proben

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and organiclastic sulfate reduction (OSR) in marine sediments. However, unravelling the complex pyritization sequence is a challenge because of the coexistence of different sequentially formed pyrite phases. This manuscript describes a sample preparation procedure that enables the use of secondary ion mass spectroscopy (SIMS) to obtain in situ &#948;34S values of various pyrite generations. This allows researchers to constrain how SO4-AOM affects pyritization in methane-bearing sediments. SIMS analysis revealed an extreme range in &#948;34S values, spanning from -41.6 to +114.8&#8240;, which is much wider than the range of &#948;34S values obtained by the traditional bulk sulfur isotope analysis of the same samples. Pyrite in the shallow sediment mainly consists of 34S-depleted framboids, suggesting early diagenetic formation by OSR. Deeper in the sediment, more pyrite occurs as overgrowths and euhedral crystals, which display much higher SIMS &#948;34S values than the framboids. Such 34S-enriched pyrite is related to enhanced SO4-AOM at the sulfate-methane transition zone, postdating OSR. High-resolution in situ SIMS sulfur isotope analyses allow for the reconstruction of the pyritization processes, which cannot be resolved by bulk sulfur isotope analysis.

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Analyses of the sulfur isotopic composition (&#948;34S) of pyrite from methane-bearing sediments have typically focused on bulk samples. Here, we applied secondary ion mass spectroscopy to analyze the &#948;34S values of various pyrite generations to understand the diagenetic history of pyritization.

Vorbereitung der Authigenic Pyrit aus Methan-Bearing Sedimenten In Situ Schwefel Isotopenanalyse mit SIMS

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and ...

Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye anatomy of insects. These include traditional histological techniques optimized for work on ant eyes and adapted to work in concert with other techniques such as transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). These techniques, although vastly useful, can be difficult for the novice microscopist, so great emphasis has been placed in this article on troubleshooting and optimization for different specimens. We provide information on imaging techniques for the entire specimen (photo-microscopy and SEM) and discuss their advantages and disadvantages. We highlight the technique used in determining lens diameters for the entire eye and discuss new techniques for improvement. Lastly, we discuss techniques involved in preparing samples for LM and TEM, sectioning, staining, and imaging these samples. We discuss the hurdles that one might come across when preparing samples and how best to navigate around them.

This article outlines a suite of techniques in light and electron microscopy to study the internal and external eye anatomy of insects. These include several traditional techniques optimized for work on ant eyes, detailed troubleshooting, and suggestions for optimization for different specimens and regions of interest.

Techniken für die Untersuchung von der Anatomie des Sehsystems Ant

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several limitations that have resulted in the exclusion of many species. Advances in the field over the last two decades have led occupational health researchers to turn to molecular-based approaches for identifying fungal hazards. These methods have resulted in the detection of many species within indoor and occupational environments that have not been detected using traditional methods. This protocol details an approach for determining fungal diversity within air samples through genomic DNA extraction, amplification, sequencing, and taxonomic identification of fungal internal transcribed spacer (ITS) regions. ITS sequencing results in the detection of many fungal species that are either not detected or difficult to identify to species level using culture or microscopy. While these methods do not provide quantitative measures of fungal burden, they offer a new approach to hazard identification and can be used to determine overall species richness and diversity within an occupational environment.

Determining the fungal diversity within an environment is a method utilized in occupational health studies to identify health hazards. This protocol describes DNA extraction from occupational air samples for amplification and sequencing of fungal ITS regions. This approach detects many fungal species that can be overlooked by traditional assessment methods.

Erfassung und Gewinnung von betrieblichen Luftproben für Analyse der Pilz DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol for performing in situ juvenile exposure tests within oligotrophic river catchments over one-month and three-month periods. Two methods (in both modifications) are presented to evaluate the juvenile growth and survival rate. The methods and modifications differ in value for the locality bioindication and each has its benefits as well as limitations. The sandy cage method works with a large set of individuals, but only some of the individuals are measured and the results are evaluated in bulk. In the mesh cage method, the individuals are kept and measured separately, but a low individual number is evaluated. The open water exposure modification is relatively easy to apply; it shows the juvenile growth potential of sites and can also be effective for water toxicity testing. The within-bed exposure modification needs a high workload but is closer to the conditions of a natural juvenile environment and it is better for reporting the real suitability of localities. On the other hand, more replications are needed in this modification due to its high-hyporheic environment variability.

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

In situ bioindications enable determination of the suitability of an environment for endangered mussel species. We describe two methods based on the juvenile exposure of freshwater pearl mussels in cages to oligotrophic river habitats. Both methods are implemented in variants for open water and hyporheic water environments.

Bioindikation Prüfung von Stream Umwelt Eignung für junge Süßwasser Perle Miesmuscheln mit In Situ Belichtungsmethoden

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

Single-Durchsatz ergänzende hochauflösende Analysetechniken für die Charakterisierung von komplexen natürlichen organischen Substanz Mischungen

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Laser-Induced Fluorescence Emission (L.I.F.E.) as Novel Non-Invasive Tool for In-Situ Measurements of Biomarkers in Cryospheric Habitats

Global warming affects microbial communities in a variety of ecosystems, especially cryospheric habitats. However, little is known about microbial-mediated carbon fluxes in extreme environments. Hence, the methodology of sample acquisition described in the very few studies available implies two major problems: A) high resolution data require a large number of samples, which is difficult to obtain in remote areas; B) unavoidable sample manipulation such as cutting, sawing, and melting of ice cores that leads to a misunderstanding of in situ conditions. In this study, a prototype device that requires neither sample preparation nor sample destruction is presented. The device can be used for in situ measurements with a high spectral and spatial resolution in terrestrial and ice ecosystems and is based on the Laser-Induced Fluorescence Emission (L.I.F.E.) technique. Photoautotrophic supraglacial communities can be identified by the detection of L.I.F.E. signatures in photopigments. The L.I.F.E. instrument calibration for the porphyrin derivates chlorophylla (chla) (405 nm laser excitation) and B-phycoerythrin (B-PE) (532 nm laser excitation) is demonstrated. For the validation of this methodology, L.I.F.E. data were ratified by a conventional method for chla quantification that involved pigment extraction and subsequent absorption spectroscopy. The prototype applicability in the field was proven in extreme polar environments. Further testing on terrestrial habitats took place during Mars analog simulations in the Moroccan dessert and on an Austrian rock glacier. The L.I.F.E. instrument enables high resolution scans of large areas with acceptable operation logistics and contributes to a better understanding of the ecological potential of supraglacial communities in the context of global change.

Laser-Induced Fluorescence Emission L.I.F.E. as Novel Non-Invasive Tool for In-Situ Measurements of Biomarkers in Cryospheric Habitats

Carbon fluxes in the cryosphere are hardly assessed yet but are crucial regarding climate change. Here we show a novel prototype device that captures the phototrophic potential in supraglacial environments based on laser-induced fluorescence emission (L.I.F.E.) technology offering high spectral and spatial resolution data under in situ conditions.

Laserinduzierte Fluoreszenzemission (L.I.F.E.) als neuartiges nichtinvasives Werkzeug zur In-Situ-Messung von Biomarkern in kryosphärischen Lebensräumen

Global warming affects microbial communities in a variety of ecosystems, especially cryospheric habitats. However, little is known about ...

In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems

Microbial behaviors, such as motility and chemotaxis (the ability of a cell to alter its movement in response to a chemical gradient), are widespread across the bacterial and archaeal domains. Chemotaxis can result in substantial resource acquisition advantages in heterogeneous environments. It also plays a crucial role in symbiotic interactions, disease, and global processes, such as biogeochemical cycling. However, current techniques restrict chemotaxis research to the laboratory and are not easily applicable in the field. Presented here is a step-by-step protocol for the deployment of the in situ chemotaxis assay (ISCA), a device that enables robust interrogation of microbial chemotaxis directly in the natural environment. The ISCA is a microfluidic device consisting of a 20 well array, in which chemicals of interest can be loaded. Once deployed in aqueous environments, chemicals diffuse out of the wells, creating concentration gradients that microbes sense and respond to by swimming into the wells via chemotaxis. The well contents can then be sampled and used to (1) quantify strength of the chemotactic responses to specific compounds through flow cytometry, (2) isolate and culture responsive microorganisms, and (3) characterize the identity and genomic potential of the responding populations through molecular techniques. The ISCA is a flexible platform that can be deployed in any system with an aqueous phase, including marine, freshwater, and soil environments.

Presented here is the protocol for an in situ chemotaxis assay, a recently developed microfluidic device that enables studies of microbial behavior directly in the environment.

In Situ Chemotaxis Assay zur Untersuchung des mikrobiellen Verhaltens in aquatischen Ökosystemen

Microbial behaviors, such as motility and chemotaxis (the ability of a cell to alter its movement in response to a chemical gradient), are widespread ...