Ich möchte die vielen Studenten, die in meinem Labor gearbeitet haben und dazu beigetragen, die Entwicklung dieser Protokolle danken. NAT wird unterstützt von der Skidmore-Union Network, ein Projekt mit einem NSF Voraus bezahlt Gewährung eingeräumt werden.

I. RNA Whole mount in situ Hybridisierung in Marine Elasmobranchs Ein. Embryo Fixation und Vorbereitung <ol><li> Skate Embryonen können nach Ballard 7 ausgetragen. Optimale Stufen zur Detektion der Genexpression hängt vom Gewebe von Interesse. Um die Genexpression in der skate Verdauungstrakt verfolgen, Stufen 27-30 sind optimal 7. </li><li> Dissect Embryonen in PBS, die Trennung der Embryonen aus dem Dottersack. </li><li> Fix in 30 ml frisch zubereiteten 4% Paraformaldehyd (PFA) in einem 50 ml konischen Röhrchen bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. Fix für 24 Stunden. </li><li> Waschen Embryonen in PBT, zweimal für 15 min, Rotieren bei Raumtemperatur. Alle Lösung Rezepte für RNA whole mount in situ &#39;s enthalten (Tabelle 1). </li><li> Dehydratisieren Embryonen durch Waschen in einem Methanol Serie von 25%, 50% und 75% Methanol: PBT Schaukelstuhl bei Raumtemperatur. Die Dauer der Wäschen abhängig vom Stadium der Embryonen. Für Pre-neurulation inszeniert Embryonen, 5 min von jeder Wäsche in der Methanol-Serie aus. Bei Embryonen älter als Stufe 30 können Wäschen bis zu 30 min. Um festzustellen, ob Embryonen ausreichend durchdrungen und akklimatisiert jeder Wäsche, halten Sie die Tube aufrecht in der Hand. Wenn die Embryonen auf den Boden des Röhrchens sinken, dann sind Sie bereit für den nächsten Waschgang. Wenn die Embryonen auf der Oberseite der Lösung schwimmen, ändern Sie die Lösung und wiederholen, dass insbesondere Dehydratisierungsschritt. </li><li> Zweimal waschen in 100% Methanol für 10 min sanft schaukelnden. </li><li> Sobald dehydratisiert zu 100% Methanol, sollte Embryonen bei -20 ° C für mindestens 24 Std. werden, bevor mit dem Protokoll gespeichert. Embryonen wurden erfolgreich bei -20 ° C gelagert und für RNA ganze Halterungen für bis zu 1 Jahr. </li></ol> 2. Synthese von RNA-Sonde <ol><li> Generieren Sie ein lineares Fragment des Gens, dessen Ausdruck, den Sie erfassen möchten. Dies kann entweder durch PCR-Amplifikation durchgeführt werden oder Linearisieren eines Plasmids mit dem Genvon Interesse. Durch PCR zu amplifizieren, wählen Primer, deren Bindungsstellen flankieren das Gen einzufügen und zu halten RNA-Polymerase-Bindungsstellen in der amplifizierten Region. Für häufig verwendete Plasmide wie PBS oder pGEM, M15 Vorwärts und Rückwärtsprimer sind ideal. Alternativ linearisieren ein Plasmid durch Verdau 15 ul QIAGEN Miniprep-DNA mit einem Enzym, das am 5&#39;-Ende des Gens spaltet. Gel extrahieren und zu reinigen mit dem entsprechenden QIAquick Kit. </li><li> Reverse Transkription der RNA-Sonde unter Verwendung von 8 ul lineares Plasmid oder 100 ng PCR-Produkt als eine Matrize unter Verwendung der geeigneten RNA-Polymerase (siehe Tabelle 2 für die Transkription Reaktion). </li><li> Inkubieren reverse Transkriptionsreaktion für 2 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Zur Reaktion bestätigen, führen 1 ul der Transkriptionsreaktion auf einem 1% Agarose / TAE-Gel. Führen Gel bei 100 mVolt bis der Farbstoff hat gerade in das Gel laufen. Ein einziger prominenter Band sollte sichtbar sein. Die linearen DNA-Fragment kann Vorlage schwach sichtbar auf einer höheren molekularenlar Gewicht. </li><li> Fügen Sie 1 ul RNAse-freier DNAse I der Transkription und bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Zur Fällung wird mit 100 ul TE pH 8, 10 ul 4 M LiCl, 300 ul 100% EtOH und inkubieren bei -20 ° C für mindestens 60 min oder über Nacht. </li><li> Spin für 10 min in einem 4 ° C Mikrozentrifuge bei 14.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Waschen Pellet mit 70% EtOH und an der Luft trocknen. </li><li> Resuspendieren RNA-Sonde in 20 ul dH 2 O. Fügen Sie 80 ul Hybridisierungspuffer (Hybridisierungspuffer auf 70 ° C vorgewärmt werden). Die Sonde kann in 80% Hybridisierungspuffer für mehrere Monate bei -20 ° C oder mehr werden bei -80 ° C. </li></ol> 3. Embryo Vorbehandlung und Hybridisierung <ol><li> Entfernen Embryonen in 100% Methanol von -20 ° C gelagert Für jüngere Embryonen mit Schritt (3,2) fort. Für spätere inszeniert Embryonen (Stufe 29/30 &lt;) können Sie eine Epidermis-Schicht, die &quot;aufgehoben&quot; wurde aus dem Körper des Embryos zu sehen. Unter dem Mikroskop sorgfältig dissect Sie die Epidermis zur Sonde Eindringen zu maximieren. </li><li> Ort Embryonen in sauberen Glasszintillationsröhrchen. Rehydratisieren die Embryonen in umgekehrter Reihe Methanol oben beschrieben: (75%, 50%, 25% Methanol: PBT) durch Schaukeln sanft jede Lösung für 5-30 min jeweils bei Raumtemperatur. Vollständige Rehydratisierung mit zwei Wäschen PBT für jeweils 10 Minuten, sanft schaukeln. </li><li> Um jegliche Pigment, Bleichmittel Embryonen mit 6% igem Wasserstoffperoxid in PBT für 1 Stunde bei Raumtemperatur, schaukelnd zu entfernen. </li><li> Entfernen Wasserstoffperoxid durch dreimaliges Waschen in PBT, (Schütteln bei Raumtemperatur, 10 min jeweils). </li><li> Gönnen Embryonen mit Proteinase K, um das Eindringen der Sonde während der Hybridisierung zu ermöglichen. Die Menge der Proteinase K und die Dauer der Behandlung richtet sich nach der gewünschten Gewebe zu untersuchen, und das Alter des Embryos. Weitere oberflächlichen Gewebe und jüngere Embryonen erfordern kürzere und weniger Proteinase K, während tieferen Gewebe aufwärts Embryonen eine höhere Konzentration und längere Behandlungszeiten verlangen time voll permeabilisieren Embryo für Sondenhybridisierung. Um beispielsweise im Darm detektieren Endoderm der Stufe 29 Rollschuh Embryonen Shh, 30 ug / ml Proteinase K / PBT für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. </li><li> Schnell spülen Embryonen in PBT abzuwaschen Proteinase K. </li><li> Proteinase K, postfix Embryonen mit 4% PFA, 0,2% Glutaraldehyd in PBT für 20 min, sanft schaukelnden deaktivieren. </li><li> Waschen Sie zweimal für 10 min mit PBT. </li><li><ol class="lalpha"><li> Für die Vor-Hybridisierung, 2-3 ml vorgewärmte Hybridisierungslösung mit den Embryonen, gerade genug, um sie zu decken. Schaukeln sanft in einem beheizten Wasserbad bei 70 ° C für 1 Stunde. </li><li> Um Hybridisierungslösung vorheizen RNA-Sonde bis 70 vorzubereiten ° C für 10 min und kühl auf Eis. Verdünnen von 15 bis 20 ul RNA-Sonde zu 2 ml frischem vorgewärmten Hybridisierungslösung, um eine Endkonzentration von 0,5-1,0 ug / ml zu erhalten. Entfernen Sie vor Hybe und fügen verdünnten RNA Sonde an Embryonen. Embryonen nur durch Lösung abgedeckt werden, einedd mehr Hybridisierungslösung, wenn nötig. Dicht sichere Deckel Szintillationsfläschchen. Hybridisieren durch Schaukeln sanft in einem beheizten Wasserbad bei 70 ° C über Nacht. </li></ol></li></ol> 4. Beitrag Hybridisierung Wash und Antikörper-Hybridisierung <ol><li> Entfernen Hybridisierungslösung mit Sonde von Embryonen und in ein frisches Szintillationsfläschchen oder Eppendorf-Röhrchen. Die Sonde kann bei -20 ° C gelagert werden und erneut in die Zukunft. Für Posthybridisierung Wäschen erfolgt Embryonen in einem Netwell in einer 6-Well-Gewebekulturplatte sitzt. </li><li> Waschen Sie 3-mal für jeweils 30 min in vorgewärmten Lösung # 1, Schütteln bei 70 ° C. </li><li> Waschen Sie 3-mal für jeweils 30 min in vorgewärmten Lösung # 2, Schütteln bei 70 ° C. </li><li> Waschen Sie 3-mal für jeweils 5 min in TBST, Schütteln bei Raumtemperatur. </li><li> Vorblock mit 10% Hitze-inaktiviertes Schafserum in TBST für 1 Stunde, Schütteln bei Raumtemperatur. </li><li> Übertragen Embryonen aus Netwell zu einem frischen Glasszintillationsröhrchen. Fügen Sie Anti-DIGFab-Fragmente (1:5000) in 1% Hitze-inaktiviertes Schafserum / TBST der Embryonen. Schaukeln über Nacht bei 4 ° C. </li></ol> 5. Beitrag Antikörper Hybridisierung Wäscht <ol><li> Entfernen Antikörper und zu verwerfen. Ort Embryonen zurück in Netwell für Wäschen. </li><li> Waschen Sie 3-mal für jeweils 5 min in TBST, Schaukeln bei Raumtemperatur </li><li> Waschen Sie mindestens 6 mal für 1 Stunde jeden, Schütteln bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen über Nacht in TBST, schaukelte bei 4 ° C. Da die Post Antikörper wäscht sich auf Hintergrundfärbung geschnitten helfen, die Maximierung der Anzahl und Dauer der Wäschen ist vorzuziehen. Embryonen werden routinemäßig in TBST bei 4 ° C gewaschen, über das Wochenende. </li></ol> 6. Detektion von Probe <ol><li> Make-up frische NTMT Lösung und filtern zu sterilisieren. </li><li> Entsorgen TBST Waschlösung und Ort Embryonen in einem sauberen Glasszintillationsröhrchen. Waschen Embryonen 3 mal in frischem NTMT für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur, Schaukeln. </li><li> Entfernen NTMT waschen und fügen Reaktionsmixvon 1 x NBT / BCIP in 1 x NTMT. Da diese Reaktanten lichtempfindlich sind, decken Szintillationsfläschchen in Folie und Rock bei Raumtemperatur. </li><li> Überwachen Farbreaktion alle 15 min, bis die gewünschte Genexpression ist deutlich sichtbar. Starke Sonden können so wenig wie 10 min zu entwickeln. Schwache Sonden kann 1-2 Stunden. Lassen Sie sich nicht Reaktion zu lange oder Hintergrundfärbung beginnt zu erscheinen (die ganze Embryo beginnt ein dumpfes violett oder braun verfärben) gehen. </li><li> Waschen Sie 2 Mal für jeweils 10 Minuten in PBT bei Raumtemperatur rocking. </li><li> Postfix Embryonen in 4% Paraformaldehyd, 0,1% Glutaraldehyd für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Embryonen können store auf unbestimmte Zeit in Fixativ werden bei 4 ° C. </li><li> Visualisieren Embryonen mit einem Seziertisch Stereomikroskop. Um einen hellblauen Hintergrund für Bilder, Ort Embryonen in einer Schüssel mit vorvergütet 1% Agarose / PBS produzieren. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse für I. RNA Whole Mount in situ Hybridisierung in marine Elasmobranchien RNA whole mount in situ &#39;s Darstellung Ausdruck der Sonic Hedgehog (Shh) und HOXA13 in skate Embryonen sind in Abbildung 1 dargestellt. Expression von Shh bei höheren Wirbeltieren in der Chorda und Darm Endoderm gefunden und dieser Ausdruck Muster in der Skate (Abbildung 1a) 8,9 konserviert. Marine-Elasmobranchien haben eine einzigartige Methode der Osmoregulation, die rektale Verschraubung verwendet, um sezernieren Salze. HOXA13 Ausdruck ist hoch in den Entwicklungsländern rektale Verschraubung (Abbildung 1b) 10. HOXA13 Genprodukt Rolle im Strukturieren der rektalen Drüse unbekannt bleibt. II. Paraffin Einbetten und Schneiden Elasmobranch Tissue Ein. Ernte und Herstellung von Tissue <ol><li> Dissect gewünschten Gewebe und fixieren in 10% Formalin für 24-48 h Schütteln bei Raumtemperatur. 4% Paraformaldehyd (PFA) kann auch als Fixiermittel verwendet werden(Siehe Diskussion). </li><li> Auswaschen Fixiermittelpartikel durch Waschen in PBS, 3 mal für jeweils 30 min. Je nach Größe des Gewebes, kann Waschzeiten bis 10 min verringert oder erhöht werden, um 1 Stunde. </li><li> Dehydratisieren Embryonen durch Waschen in einem Ethanol Serie von 25%, 50% und 75% Ethanol: PBS Schaukelstuhl bei Raumtemperatur. Auch hier wird die Zeit für jeden Waschvorgang von der Größe des Gewebes ab. Für 0,5 cm 3 Gewebe, inkubieren jedem Waschen für 15 min. Erhöhen Zeit für größere Stücke. Wenn die Langzeitlagerung von Gewebe erwünscht ist, waschen zusätzlich zwei mal mit 75% Ethanol und Laden in -20 ° C für bis zu einem Jahr. Andernfalls mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Durch Waschen 3 mal in 100% Ethanol für je 15 min, Schaukeln entwässern. </li></ol> 2. Paraffin Einbetten und Schneiden <ol><li> Klären Gewebe durch Waschen 2 mal in Xylol für jeweils 5 min in Glasszintillationsröhrchen mit Schraubverschluss Deckel. Xylol machen wird das Gewebe spröde, so dass nicht mehr als insgesamt 10 Minuten für warhes. Das Gewebe sollte aussehen transluzenten, wenn Sie es halten, um ein Licht. Wenn das Gewebe noch sehr undurchsichtig nach den zwei Wäschen, machen eine zusätzliche Wäsche in Xylol für 5 min und fahren Sie dann mit dem Protokoll. Fassen Xylol in einem Abzug mit Handschuhen. </li><li> Entfernen Xylol und füllen Sie das Szintillationsfläschchen 2/3 voll mit geschmolzenem Paraffin. Inkubieren in einem 60 ° C Ofen für 30 min. Beim Aufsetzen Paraffin in das Fläschchen, werden Sie feststellen, das Paraffin an den Seiten des Fläschchens zu festigen. Stellen Sie die Durchstechflasche in den Ofen und lassen Sie das Paraffin für ein paar Minuten wieder aufzulösen. Nehmen Sie die Durchstechflasche aus dem Ofen und geben Sie die Lösung eine schnelle Wirbel zu mischen und im Ofen für den Rest der Inkubation ersetzen. </li><li> Wiederholen Paraffin Inkubationen noch zweimal für 30 min. </li><li> Inkubieren in Paraffin zweimal für jeweils eine Stunde. Ändern Paraffin ein letztes Mal und über Nacht im 60 ° C heißen Ofen. </li><li> Am folgenden Tag, legen das Gewebe in einem beheizten Paraffinbad Kammer und unter Vakuum für 2-3 h. Dies wird die Infiltration von Paraffin in das Gewebe erleichtern und entfernen Sie alle Luftblasen. Für einige Arten von dünnen Gewebe, kann ein Vakuum Schritt nicht erforderlich, aber es ist nötig für ganze Embryonen oder Verdauungstraktes und anderer Organe mit luminalen Kompartimenten. </li><li> Nach der Infiltration von Gewebe, die Gewebeschnitte in einer Metallform mit geschmolzenem Paraffin und kühlen auf einer Eisplatte Vakuum erleichtert. Lassen Sie auf Eis oder bei 4 ° C über Nacht, bevor Sie versuchen, um das Gewebe aus der Form zu entfernen. Paraffin-Blöcke von Gewebe kann unbegrenzt bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Ort Paraffinblock auf einem Mikrotom und geschnitten 8 &amp;mgr; m-Schnitte. Die Schnitte werden auf einem Wasserbad erhitzt, um 48 ° C schwebte und montiert auf Glas Superfrost * Plus Dias. </li><li> Dry Objektträger über Nacht in einem 37 ° C Ofen. </li><li> Laden Abschnitten bei 4 ° C bis zum Gebrauch. </li></ol> III. Alcianblau / Nuclear Fast Red von Elasmobranch Tissue Stain Ein. Alcianblau für Mucine Stain <ol><li> Die Objektträger mit den Abschnitten nach oben auf einer Folie wärmer. Melt für 45 min. </li><li> Objektträger in einem Objektträgerhalter. Alle daraus resultierenden Lösungen werden in Wannen in einer Abzugshaube enthalten. Objektträger werden durch Übertragung von einer Wanne mit einer Lösung zur anderen gewaschen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung Ebenen in den Wannen der Folien bedeckt; das Gewebe auf den Folien sind vollständig untergetaucht. Lösen Paraffin durch Waschen Dias 2 mal in Xylol für jeweils 5 min. </li><li> Objektträger zweimal Waschen mit 100% Ethanol für 1 Minute jeweils. </li><li> Rehydratisieren Folien in einem Ethanol-Reihe (75%, 50%, 25% Ethanol) Waschen in jeder Lösung für 1 min. Waschen in dH 2 O für 1 min. </li><li> Färben in Alcianblau-Lösung, pH 2,5 für 15 min. </li><li> Entwickeln Flecken durch Waschen unter fließendem Leitungswasser für 3 min. Tauchen Sie einmal in dH 2 O. </li><li> Gegenfärbung in Nuclear Fast Red Counterstain Lösung für 10 min. </li><li> Waschen in fließendem Leitungswasser für 3 min und tauchen in dH 2 O einmal. </li><li> Dehyhydrat in einem Ethanol-Serie (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) für 20 eintaucht jeder oder jeweils 1 min. Waschen Sie 2 mal in Xylol für jeweils 5 min. Eindecken mit DPX Eindeckmedium und Deckgläschen. Lassen Eindeckmedium trocknen und aushärten für 48 Stunden in der Abzugshaube vor Manipulation Dias. </li></ol>

<ol>
	<li>Forester, R., Goldstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+osmoregulatory+role+of+amino+acids+and+urea+in+marine+elasmobranchs.">Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs.</a> Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).</li><li>Shuttleworth, T., Shuttleworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physiology of elasmobranch fishes. , 171-194 (1988).</li><li>Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+with+water+stress:+evolution+of+osmolyte+systems.">Living with water stress: evolution of osmolyte systems.</a> Science. 217, 1214-1222 (1982).</li><li>Ballatori, N., Villalobos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+molecular+and+cellular+basis+of+toxicity+using+comparative+models.">Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models.</a> Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).</li><li>Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole+mount+and+tissue+sections.">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).</li><li>Jass, J. R., Walsh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mucin+expression+in+the+gastrointestinal+tract:+a+review.">Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review.</a> J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).</li><li>Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+for+development+of+Scyliorhinus+canicula,+the+lesser+spotted+dogfish+(Chondrichthyes;+Scyliorhinidae).">A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae).</a> J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).</li><li>Echelard, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog,+a+member+of+a+family+of+putative+signaling+molecules,+is+implicated+in+the+regulation+of+CNS+polarity.">Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity.</a> Cell. 75, 1417-1430 (1993).</li><li>Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75, 1401-1416 (1993).</li><li>Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+acid+mucin+goblet+cell+distribution+and+Hox13+expression+patterns+in+the+developing+vertebrate+digestive+tract.">Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract.</a> J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+7.">Ch. 7.</a> Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, 7.82 (2001).</li><li>Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamprey+type+II+collagen+and+Sox9+reveal+an+ancient+origin+of+the+vertebrate+collagenous+skeleton.">Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li><li>Theodosiou, N. A., Simeone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+rudimentary+colon+in+the+elasmobranch,+Leucoraja+erinacea.">Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea.</a> Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).</li><li>Filipe, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins+in+the+human+gastrointestinal+epithelium:+a+review.">Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review.</a> Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).</li><li>Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin+degradation+in+the+human+colon:+production+of+sialidase,+sialate+O-acetylesterase,+N-acetylneuraminate+lyase,+arylesterase,+and+glycosulfatase+activities+by+strains+of+fecal+bacteria.">Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria.</a> Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).</li><li>Reid, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+and+histological+progression+to+malignancy+in+Barrett's+esophagus:+prospective+endoscopic+surveillance+of+a+cohort.">Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort.</a> Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).</li><li>Mowry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+of+pancreatic+beta-cell+granules.+Evolution+and+present+status.">Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).</li><li>Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+signaling+during+the+regionalization+of+the+chick+gut.">Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut.</a> Development. 125, 2791-2801 (1998).</li></ol>

Ich habe nichts zu offenbaren.

Die Protokolle vorgestellt werden sind klassische Methoden zur Überwachung der Genexpression und Identifizierung differenzierte Zelltypen und wurden für den Einsatz in marinen Elasmobranchien angepasst. Weitere Modifikationen dieser Protokolle erforderlich sein, um an verschiedene Arten Knorpelfischarten anzupassen. Die häufigste Besorgnis hinsichtlich RNA whole mount in situ &quot;s die Gefahr der Kontamination RNase und dadurch die Degradation der RNA-Sonde und endogenen Nachri...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x transcription buffer</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11-465-384-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DIG-RNA labeling mix</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11-277-073-910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse inhibitor</td>
 <td>Roche</td>
 <td>03-335-399-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA polymerase - SP6</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-810-274-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAseI, RNAse-free </td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-776-785-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Yeast RNA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15401-029</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>220201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>heparin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4784</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td>
 <td>Research Organics</td>
 <td>2106D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria Perforated Spoon</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>10370-17</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Netwell inserts</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>64713-00</td>
 <td>Netwells for use in 6-well tissue culture dishes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well tissue culture plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td>
 <td>Weaton Science Products</td>
 <td>986540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>formamide</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP227500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Proteinase K</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>59895 (AM2542)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NBT</td>
 <td></td>
 <td>11585029001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCIP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11585002001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0635-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sheep serum</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101301-478</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>glutaraldehyde</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-109-541-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-DIG Fab Fragments</td>
 <td>Roche</td>
 <td>1137-6623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>26323-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclear Fast Red</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>26078-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPX Mountant</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>13510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin (Paraplast X-tra)</td>
 <td>McCormick Scientific</td>
 <td>39503002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Formalin, NBF</td>
 <td>VWR</td>
 <td>95042-908</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td>
 <td>Weaton Science Products</td>
 <td>986540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steal base molds</td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>4161-4165</td>
 <td>Multiple sizes available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cassettes </td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>4170</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide warmer</td>
 <td>Fisher-Scientific</td>
 <td>12-594Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue Embedder</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>EG1160</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microtome, rotary</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>RM2235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek Slide Staining Set</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62540-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek 24-Slide Holder</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62543-06</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost*Plus slides</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>12-550-17</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

rna in situ hybridization in whole mount embryos and cell histology adapted for marine elasmobranchs

Marine-Elasmobranchien sind Tiermodelle für die biomedizinische und genomische Studien bewertet, wie sie die primitivsten Wirbeltiere adaptive Immunität und haben einzigartige Mechanismen zur Osmoregulation 1-3 sind. Da die primitivsten lebenden jawed-Wirbeltiere mit gepaart Anhängsel sind Elasmobranchien ein evolutionär wichtiges Modell, vor allem für Studien in der Evolution und Entwicklung. Marine-Elasmobranchien sind auch verwendet worden, um aquatische Toxikologie und Streßphysiologie im Verhältnis zum Klimawandel 4 studieren. So wird die Entwicklung und Anpassung von Methoden benötigt, um zu erleichtern und erweitern den Einsatz dieser primitiven Wirbeltieren zu mehreren biologischen Disziplinen. Hier präsentiere ich die erfolgreiche Anpassung der RNA whole mount in situ Hybridisierung und histologische Techniken, um die Genexpression und Histologie in Elasmobranchien studieren. Monitoring der Genexpression ist ein Markenzeichen Tool von Entwicklungsstörungen biologists, und häufig verwendet, um zu untersuchen Entwicklungsprozesse 5. RNA whole mount in situ Hybridisierung ermöglicht die Visualisierung und Lokalisierung von spezifischen Gen-Transkripte in Geweben des sich entwickelnden Embryo. Das Expressionsmuster eines Genes kann die Nachricht Einblick in Entwicklungsprozessen und Zellschicksals Entscheidungen ein Gen kann zu steuern. Durch den Vergleich der Expression eines Gens in verschiedenen Entwicklungsstadien, können Einblick in die Rolle eines Gens Veränderungen während der Entwicklung gewonnen werden. Während whole mount in situ &quot;s stellt ein Mittel zum Lokalisieren von Gewebe Genexpression erlauben histologische Techniken zur Identifizierung der differenzierten Zelltypen und Geweben. Histologischen Färbungen haben unterschiedliche Funktionen. Allgemeine Flecken verwendet werden, um die Zellmorphologie zu markieren, z. B. Hämatoxylin und Eosin für allgemeine Färbung der Kerne und Cytoplasma sind. Andere Flecken markieren bestimmte ZelleTypen. Zum Beispiel die Alcianblau in dieser Veroffentlichung Fleck ist eine weit verbreitete kationische Fleck auf mucosaccharides identifizieren. Färbung des Verdauungstraktes mit Alcianblau identifizieren kann die Verteilung der Becherzellen, die mucosaccharides produzieren. Variationen in mucosaccharide Bestandteile auf kurze Peptide unterscheiden Becherzellen nach der Funktion im Verdauungstrakt 6. Durch die Verwendung von RNA whole mount in situ &#39;s und histochemische Methoden gleichzeitig kann das Schicksal der Zelle Entscheidungen Gen-Expression verknüpft werden. Obwohl RNA in situ &#39;s und Histochemie weit von den Forschern verwendet werden, haben ihre Anpassung und Nutzung in marine Elasmobranchien begrenzt und abwechslungsreiche Erfolg. Hier präsentiere ich Protokolle für Elasmobranchien entwickelt und regelmäßig in meinem Labor. Obwohl weitere Modifikation der RNA in situ &#39;s Hybridisierungsverfahren erforderlich sein, um an verschiedene Arten angepasst werden, die beschriebenen Protokolle hier S.rovide ein guter Ausgangspunkt für die Forscher, die die Nutzung der Meeresressourcen Elasmobranchien ihre wissenschaftliche Untersuchungen anzupassen.

Beispiele Alcianblaufärbung in verschiedenen Regionen des L. erinacea Verdauungstraktes sind in Abbildung 2 dargestellt. Mucin enthaltenden Säure globlet Zellen sind deutlich sichtbar durch den Alcianblau färben gesamten Verdauungstrakt. Die Verteilung der Säure Mucinen unterscheidet sich in den verschiedenen Regionen des Verdauungstraktes und reflektiert damit Unterschiede in der Funktion. Sauren Mucine sind spärlich in der Spirale Darm und Kloake hergestellt, während eine hohe Konzentra...

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RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Durch die Kombination von Methoden zur RNA whole mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung und Histologie, die Genexpression mit Zellschicksals Entscheidungen in den sich entwickelnden Embryo verknüpft werden. Diese Methoden haben, um marine Elasmobranchien angepasst und erleichtern die Verwendung dieser Tiere als Modellorganismen für die biomedizinische, Toxikologie und vergleichende Studien.

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

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Research

JoVE Journal

Biology

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

12.6K Aufrufe.  Union College. Durch die Kombination von Methoden zur RNA whole mount In situ Hybridisierung und Histologie, die Genexpression mit Zellschicksals Entscheidungen in den sich entwickelnden Embryo verknüpft werden. Diese Methoden haben, um marine Elasmobranchien angepasst und erleichtern die Verwendung dieser Tiere als Modellorganismen für die biomedizinische, Toxikologie und vergleichende Studien.

Serie: RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Verfahren zur Whole Mount Antikörper-Färbung in Küken

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Mit Whole Berg In situ Hybridisierung zu Molecular Biology und Organismal Link-

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Hohe Auflösung Ganze Berge<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung innerhalb Zebrafischembryonen Gene Expression und Funktion zu untersuchen

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...