Name: in situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples
Uploaded: 2018-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
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이 작품은 수상에 의해 투자 되었다 아니. OCE-버로우즈 Wellcome 펀드 박사 농축 프로그램에서 국립 과학 재단 해양 과학 박사 친목 및 수상 no.1012629 통해 1323652.

1입니다. 파라핀 제거
주의: 증기 두건에서 다음 단계를 수행 합니다.
<ol><li>100% 크 실 렌 유리 Coplin 단지 10 분의 후드 아래에 있는 얇은 sectioned 파라핀 끼워 넣어진 슬라이드 dewax 크 실 렌 녹는 플라스틱으로 플라스틱 Coplin jar를 사용 하지 마십시오. 사용 하기 전에 압력솥에 Coplin 항아리를 소독.</li>
	<li>다음 4 개의 메 마른 유리 Coplin 항아리를 준비: 100% 에탄올, 80% 에탄올, 70% 에탄올과 60% 에탄올. RNase 무료 물과 에탄올을 희석.<ol>
<li>100% 에탄올과 메 마른 유리 Coplin jar를 슬라이드를 전송 하 고 10 분 동안 그들을 담가. 10 분 후 빈 유리 Coplin jar 고 새로운 100% 에탄올을 바꿉니다. 다시 10 분에 대 한 슬라이드를 담근 다.</li>
		<li>1 분 동안 80% 에탄올과 메 마른 유리 Coplin jar를 슬라이드를 전송 합니다.</li>
		<li>1 분에 70% 에탄올과 메 마른 유리 Coplin jar를 슬라이드를 전송 합니다.</li>
		<li>1 분 60% 에탄올과 메 마른 유리 Coplin jar를 슬라이드를 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. RNA 프로브 교 잡의 준비에 대 한 슬라이드 전처리
<ol><li>달리 지정 하지 않는 한, 실내 온도에 다음 세척을 수행 합니다. 느린 속도로 궤도 통에 실 온 세척을 수행 합니다. 최대 5 개의 슬라이드 공간 살 균 슬라이드 우편물을 사용 하 여 슬라이드의 세척에 대 한.</li>
	<li>슬라이드를 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1의 18 mL와 멸 균 슬라이드 우편물 전송. 실 온에서 5 분 동안 세척.</li>
	<li>1 x PBS에서 부 어와 즉시 조직의 프로브 침투 수 있도록 가수분해 K와 함께 슬라이드에는 조직 치료. 슬라이드 우편물을 가수분해 K 솔루션의 약 18 mL을 추가 (작업 솔루션 농도 표 1 참조). 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 동요 하지 마십시오.<ol>
<li>슬라이드는 잠복기 동안 prehybridization 버퍼 (Prehybe 버퍼)를 준비 합니다. Prehybe 버퍼 10 분 동안 끓는 물 욕조에 배치 다음 5 분 동안 얼음 목욕에 냉각. Prehybe 버퍼의 제조 법, 표 1을 참조 하십시오.</li>
		<li>가수분해 K 솔루션 털어 여 성분 K 반응의 소화를 중지 하 고 즉시 슬라이드 우편물을 0.2% 글리신-PBS 솔루션의 18 mL를 추가. 슬라이드 우편물 실 온에서 5 분 동안 앉아 보자.</li>
		<li>0.2% 글리신-PBS 솔루션에 밖으로 부 어과 각 슬라이드 우편물을 2 배 염 분 나트륨 시트르산 (SSC) 솔루션의 18 mL을 추가. 슬라이드 2에서 씻어 100-150 rpm에서 떨고와 실 온에서 10 분 동안 x SSC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. RNA 프로브 교 잡에 대 한 준비에 슬라이드 prehybridization
<ol><li>슬라이드 2로 세척 되는 동안 x SSC, 새로운 살 균 슬라이드 우편물을 얻기와 슬라이드 우편물에 Prehybe 버퍼의 약 18 mL를 넣어. 교 잡 온도에서 교 잡 오븐으로 슬라이드 우편물을 놓습니다. 참고: 교 잡 온도 50-60 ° c.에서 일반적으로 범위에만 사용 되는 프로브에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>2 x SSC 세척 완료 되 면, SSC, 및 장소 2에 밖으로 부 어 1 시간에 대 한 교 잡 오븐에서 Prehybe 버퍼에 슬라이드 메일러 내의 슬라이드.</li>
</ol>4입니다. 교 잡의 RNA 프로브
<ol><li>슬라이드는 교 잡 오븐에서 Prehybe 버퍼와 잠복기는, 하는 동안 교 잡 프로브 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>교 잡 버퍼 (µ 프로브 0.5 L 교 잡 버퍼의 24.5 µ L)에서 각 프로브를 희석. 참고: 교 잡 버퍼에 대 한 제조 법은 표 1에서 발견 된다. 트레일러-놀 즈 외 에 조사 준비 및 농도의 예를 찾을 수 있습니다. 11.</li>
		<li>12 분, 86-90 ° C 열 블록에 희석된 프로브를 배치 후 얼음에 1 분 동안 쿨.</li>
	</ol>
</li>
	<li>슬라이드 우편물 교 잡 오븐에서 제거 하 고 멸 균 핀셋을 사용 하 여 슬라이드 우편물에서 슬라이드를 개별적으로 제거. 종이 타월에 평평 슬라이드를 신중 하 게 조직 샘플 주위 Prehybe 버퍼 초과 닦아. 샘플, 터치 하지 않도록 주의 하 고 조직 샘플의 건조를 방지 하기 위해 신속 하 게 작업.</li>
	<li>PAP 펜 조직을 둘러싸십시오. 25 µ L를 피펫으로 희석된 프로브 솔루션의 적용 하 고 플라스틱 coverslip로 샘플을 커버.<ol>
<li>SSC + 챔버 바닥에 있는 50 %formamide 솔루션 x 4 슬라이드 습기 챔버에 샘플을 놓습니다.</li>
		<li>모든 슬라이드에 프로브를 추가한 일단 교 잡 교 잡 온도 50-60 ° c에서 24 시간 이상 오븐에 슬라이드 습기 챔버를 배치 보육 시간 탐사선의 농도 따라 다를 수 있습니다 하지만 24 시간 최소 이어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>희석 프로브 야간 보육, 후 교 잡 오븐에서 슬라이드 습기 챔버를 제거 합니다.<ol>
<li>각 조직 치환 하지 않도록 주의 되 고 슬라이드에서 coverslips를 제거 합니다. 1000 µ L 피 펫에 2 x SSC 솔루션의 1000 µ L을 추가 하 고 부드럽게 슬라이드를 씻어.</li>
		<li>실 온에서 5 분 동안 2 x SSC 솔루션의 18 mL와 멸 균 슬라이드 우편물에 슬라이드를 놓습니다. 솔루션을 부 어 하 고 신선한 2의 18 mL x SSC. 부드러운 진동으로 실 온에서 5 분 동안 다시는 부 화를 반복 합니다.</li>
		<li>2 x SSC 솔루션을 붓는 다. 실 온에서 1 x SSC 솔루션 및 5 분 동안 세척의 18 mL를 추가 합니다. 1 x SSC 솔루션을 부 어 하 고 신선한 1의 18 mL x SSC. 부드러운 진동으로 실 온에서 5 분 동안은 부 화를 반복 합니다.</li>
		<li>1 개 부 어 x SSC. 동요 하지 않고 42 ° C에서 0.5 x SSC와 10 분 동안 세척 18 mL를 추가 합니다. SSC 및 바꾸기 x 0.5에 밖으로 부 어 신선한 0.5 18 mL와 함께 그것은 x SSC. 동요 하지 않고 42 ° C에서 10 분 동안 다시 세척.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. RNA 프로브의 시각화
참고: 프로브를 시각화, BM 보라색 사용 됩니다 개발 과정. 그러나,이 단계 전에 여러 세척은 얼룩에 대 한 샘플을 준비 해야 합니다.
<ol><li>1 분에 대 한 MgCl2 MgCl2, 없이 AP 버퍼에 밖으로 부 어 1 x Boehringer 임 차단 버퍼 maleic 산 버퍼 희석의 18 mL를 추가 하지 않고 알칼리 성 인산 가수분해 효소 버퍼 (AP-버퍼)의 18 mL와 함께 슬라이드를 씻어. 부드러운 진동으로 슬라이드 우편물에서 실내 온도에 적어도 1 시간에 품 어. 참고: Boehringer 임 차단 버퍼와 maleic 산 버퍼 사용 들어찬 되었고 발굴 세척 및 블록 버퍼 설정에서 구입한 (사용 가능한 상업적으로).<ol>
<li>또는, 4 ° C에서 하룻밤 인큐베이션을 수행할 수 있습니다. 더 이상 차단 기간 아닌 특정 바인딩의 모양을 줄일 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 mL 희석된 발굴 안티-digoxigenin-AP 놀라 우 파편의 준비 (안티 발굴 항 체 = 안티 발굴 항 체 + 20 mL 1 Boehringer 임 차단 버퍼 x 2 µ L). 이 1 플라스틱 슬라이드 우편물에 사용 하기 위해 충분 하다. 이 솔루션의 경우 하나 이상의 슬라이드 메일러 사용 되는 준비 되어야 한다.</li>
	<li>새로운 살 균 슬라이드 우편물을 방지 발굴 항 체를 추가 하 고 슬라이드 슬라이드 우편물 안티 발굴 항 체 솔루션에 전송. 부드러운 떨고와 3 시간 실 온에서 품 어.</li>
	<li>부 화, 후 부 항 발굴 항 체 어 고 부드러운 떨고와 5 분 동안 MgCl2 없이 AP 버퍼의 18 mL와 슬라이드 우편물에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>MgCl2, 없이 AP 버퍼에 밖으로 부 어과 AP 버퍼의 18 mL을 추가. 부드러운 진동으로 5 분 동안 세척. 5 분 부 화 후 AP 버퍼에서 부 어, 신선한 AP-버퍼, 18 mL와 함께 그것을 대체 하 고 부드러운 떨고와 5 분 동안 세척.</li>
	<li>어둠 속에서, AP-버퍼에 밖으로 부 어 하 고 슬라이드 우편물에 보라색 BM의 18 mL를 추가 합니다. 어둠 속에서 실 온에서 슬라이드를 품 어, 개발 되 고 조사에 따라 시각화를 위한 모든 ½ h. 반응 시간이 달라 집니다 보라색 컬러 개발에 대 한 검사. 참고: BM 보라색 시각화, 대신 개발 솔루션 만들 수 있습니다 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)를 사용 하 여 니트로 블루 tetrazolium (NBT). 자세한 내용은 표 1 을 참조 하십시오.</li>
	<li>어둠 속에서 실 온에서 5 분에 대 한 트리 스-EDTA (테) 버퍼의 18 mL와 함께 새로운 살 균 슬라이드 우편물에 슬라이드를 전송 하 여 컬러 개발을 중지 합니다.</li>
	<li>TE 버퍼에서 부 어와 슬라이드 우편물을 어둠 속에서 1 분 동안 세척 RNase 무료 물 18 mL을 추가.</li>
	<li>슬라이드, 물에서 제거 하 고 조직의 가장자리 주위에 그들을 건조. 매체를 장착 하는 글리세롤을 추가 하 고 장소는 coverslips. 사진 촬영 준비가 될 때까지 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hughes, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Climate+Change,+Human+Impacts,+and+the+Resilience+of+Coral+Reefs.">Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs.</a> Science. 301 (5635), 933 (2003).</li><li>Chen, P. -. Y., Chen, C. -. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdivision+of+arthropod+cap-n-collar+expression+domains+is+restricted+to+Mandibulata.">Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata.</a> EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).</li><li>Piatigorsky, J., Kozmik, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubozoan+jellyfish:+an+Evo/Devo+model+for+eyes+and+other+sensory+systems.">Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 의료 및 진화 발달 연구8,9,10,,1217이전 작품에서 수정 되었습니다. 이 프로토콜 발굴 표시 된 RNA 안티 감각 프로브는 보존 되 고 파라핀에 포함 된 성인 산호에 제자리에 하이브리드의 뉘앙스에 집중 한다. 이 메서드는 파라핀 포함 된...

산호는 중요 한 생태계 빌더 바다와 인간의 건강1,,23에서 생물 다양성에 대 한 중요 한. 그들은 기후 변화 및 다른 anthropogenic 스트레스 위협을 받고 있다 그리고 많은 산호 종 비판적으로 멸종 위기에 놓인 것으로 간주 됩니다. 따라서, 세포 및 분자 도구 진단 스트레스 산호를 위한 중요 한 필요가 있다. 또한, 거기 약간 이해 된다 성인 산호 조직, 그리고이 유전자의 기능에 따라서 작은 이해 내 유전자가 표현 하는 곳에 대 한. 이 문제를 해결 하려면 우리는 현장에서 교 잡 (틱), 일반적으로 사용 되는 프로토콜 인간의 의학 및 진화 개발 생물학, 성인 산호의 파라핀 끼워 넣어진 조직 추출에서 사용 하기 위해 적응 시켰다. 이 기술은 열 스트레스에 노출 등 스트레스 이벤트 받은 성인 산호에 사용 될 때 가장 강력 하다. 그러나,이 기술은 다양 한 조직 및 산호의 삶의 단계에 사용할 수 있습니다 그리고만 열 스트레스 산호4,,67에 국한 되지 않습니다. 또한,이 기술은 사용할 수 cDNA 순서 정보는 조직 또는 모든 metazoan의 셀에 사용할 수 있습니다.
이 방법의 목적은 보존 및 파라핀에 포함 되었으며 슬라이드에 구분 성인 산호 조직 내의 RNA 프로브를 시각화 하는 것입니다. 이 방법은 성인 산호 조직 내에서 핵 산의 시각화에 대 한 허용 하는 강력한 진단 도구입니다. 처음에이 방법은 의료 진단에 대 한 개발 하 고 이후 발생 생물학 및 진화 개발 생물학8,,910분야에서 인기 있는 도구가 되고있다. 분의 비-모델 시스템, 게놈에서 특히 중요 한 방법 이기도 하 고 transcriptomic 시퀀스 데이터 사용할 수 있지만 공간 유전자 표현 패턴을 알 수 있습니다. 진단 작업 비 모델 시스템에 대 한이 기술은 강력 하다는 세포와 조직 관심사의 유전자를 표현 하 고 더 많은 타겟된 치료 접근8,,910, 이어질 수 있습니다 나타낼 수 있습니다 때문에 11,12. 마지막으로,이 기술은 질적 및 양적 유전자 표현 데이터11와 결합 하는 때 더 강력한입니다.
이 문서에서 설명 하는 방법은 이미 digoxigenin (발굴) 설계 연구원에 게 관심이 될 것입니다-표시 된 RNA 프로브 (감각 및 antisense 프로브)는 이제 제자리에서 교 잡의 샘플을 프로브를 실행할 준비가 되었습니다. 이 메서드를 수행 하기 위해 파라핀 산호 직물의 2 개의 직렬 섹션 테스트 중인 각 프로브에 대 한 필요 합니다. 한 섹션 감지 프로브 및 센스 프로브에 대 한 다른 사용 됩니다. 감각 프로브를 나타내는 일반적인 바인딩 컨트롤 될 것입니다. 만약 얼룩이 지는 감각 프로브에서 관찰, 센스 프로브 관심의 RNA를 특정 하지 않습니다. 프로브는 모든 유전자 표현에 대 한 디자인할 수 있습니다. 이 프로토콜에 몇 가지 예는 사용 이전 산호에 열 스트레스 동안 표현할 것을 발견 했다: FBJ murine 다리 바이러스 oncogene 체 B (포-B), 활성 단백질 (AP1), 종양 괴 사 인자 수용 체 41 (TNFR 41)11. 그들의 처리는 많은 안전10때문에 방사성 프로브를 사용 하 여 분 발굴 표시 된 RNA 프로브를 사용 하 여 것이 좋습니다. 또한,이 기술은 매우 민감한 이며 다양 한 조직 및 열 스트레스 성인 산호13,14,,1516넘어 배아에서 수행할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Denhardt&#039;s solution</td><td>Affymetrix</td><td>70468 50 ML</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Alkaline phosphatase buffer</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>Slide mailers</td><td>Fisher</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Alkaline phosphatase buffer</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Fisher</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Slide white apex superior adhesive</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800080</td><td></td></tr><tr><td>PBS solution, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen Liquid Blocker</td><td>Promega</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple, 100 mL</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>DIG Wash and Block Buffer Set</td><td>Roche</td><td>11585762001</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution, 500 mL size</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer 20X concentration</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Anhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes, AR (ACS), For Histological Use</td><td>VWR</td><td>MK866806</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>EM-EX0276-4S</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>VWR</td><td>PAV6232</td><td></td></tr><tr><td>hybridization oven</td><td>VWR</td><td>97005-252, 97005-254</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples

산호는 바다의 전반적인 건강 뿐만 아니라 인간의 건강에 대 한 중요 한 중요 한 바다 무척 추 동물. 그러나, 상승 바다 온도 해양 산성화 등 인간의 영향으로 인해 산호는 점점 더 위협을 받고. 이러한 과제를 해결 하기 위해 세포 및 분자 생물학 산호의 건강 진단에 대 한 중요 한 것을 입증 했다. 인간의 의학에서 일반적으로 사용 되는 기법 중 일부를 수정 연구자의 능력을 치료 하 고 산호 저장에 크게 향상 시킬 수 있습니다. 이 해결 하기 위해 현장에서 교 잡 인간의 의학 및 진화 개발 생물학에서 주로 사용 하는 프로토콜 스트레스 성인 산호에 사용 하기 위해 적응 되었습니다.
이 방법의 목적은 파라핀에 포함 되 고 유리 슬라이드에 구분 된 성인 산호 조직에서 RNA 프로브의 공간 표현을 시각화 하는 것입니다. 이 메서드는 파라핀 및 샘플의 재 수 화 작용의 제거, 샘플, 사전 교 잡 부 화, RNA 프로브의 교 잡 그리고 RNA 프로브의 시각화의 침투성을 보장 하기 위해 샘플의 전처리에 중점을 둡니다. 이 때 강력한 방법 비 모형 유기 체를 사용 하 여 특정 유전자가 표현 및 프로토콜은 다른 비 모형 유기 체에 쉽게 적용할 수 있습니다. 그러나, 방법은 식 강도 시각화 단계 및 프로브 농도 동안 사용 시간에 따라 달라질 수 있기 때문에 그것은 주로 질적 제한 됩니다. 또한,이 프로토콜 최대 5 일 (와 많은 경우에, 더 이상) 사용 되는 프로브에 따라 걸릴 수 있습니다 인내심 필요 하다. 마지막으로, 일반적인 배경 얼룩은 일반적, 그러나이 한계를 극복할 수 있습니다.

이 프로토콜을 완료 한 후 관심의 RNA 프로브를 표현 하는 조직과 세포의 식별 달성 될 것 이다. 이 프로토콜에 대 한 대표적인 결과 AP 1, FosB, 및 TNFR41입니다. 이러한 결과 이전 트레일러 놀 즈 외 에 출판 11, 열 스트레스에 노출 된 성인 산호에 프로브는 RNA의 표시 공간 표현 합니다. 다른 얼룩 유형의 두 가지 예는 그림 1에 표?...

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In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

이 프로토콜의 목표 성인 산호 샘플 파라핀에 포함 되 고 유리 슬라이드에 구분에 교 잡 현장에서 수행 하는 것입니다. 이것은 파라핀 끼워 넣어진 조직에서 RNA 방지 감지 프로브의 공간 표현을 시각화 하는 데 사용 하는 질적 방법입니다.

제자리에서 파라핀 포함 성인 산호 샘플에 대 한 교 잡 기술

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

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Research

JoVE Journal

Environment

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

7.0K 조회수.  University of Miami, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Sciences. 이 프로토콜의 목표 성인 산호 샘플 파라핀에 포함 되 고 유리 슬라이드에 구분에 교 잡 현장에서 수행 하는 것입니다. 이것은 파라핀 끼워 넣어진 조직에서 RNA 방지 감지 프로브의 공간 표현을 시각화 하는 데 사용 하는 질적 방법입니다.

비디오: In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues comprising the Caribbean reef building corals Montastraeaannularis and M. faveolata. These approaches include fluorescence microscopy (FM), serial block face imaging (SBFI), and two-photon confocal laser scanning microscopy (TPLSM). SBFI provides deep tissue imaging after physical sectioning; it details the tissue surface texture and 3D visualization to tissue depths of more than 2 mm. Complementary FM and TPLSM yield ultra-high resolution images of tissue cellular structure. Results have: (1) identified previously unreported lobate tissue morphologies on the outer wall of individual coral polyps&#160;and (2) created the first surface maps of the 3D distribution and tissue density of chromatophores and algae-like dinoflagellate zooxanthellae endosymbionts. Spectral absorption peaks of 500 nm and 675 nm, respectively, suggest that M. annularis and M. faveolata contain similar types of chlorophyll and chromatophores. However, M. annularis and M. faveolata exhibit significant differences in the tissue density and 3D distribution of these key cellular components. This study focusing on imaging methods indicates that SBFI is extremely useful for analysis of large mm-scale samples of decalcified coral tissues. Complimentary FM and TPLSM reveal subtle submillimeter&#160;scale changes in cellular distribution and density in nondecalcified coral tissue samples. The TPLSM technique affords: (1) minimally invasive sample preparation,&#160;(2) superior optical sectioning ability,&#160;and (3) minimal light absorption and scattering, while still permitting deep tissue imaging.

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine polyp morphology and tissue structure in the Caribbean corals Montastraeaannularis and M. faveolata. Fluorescence, serial block face,&#160;and two-photon confocal laser scanning microscopy have identified lobate structure, polyp walls, and estimated chromatophore and zooxanthellae densities and distributions.

복합 광학 현미경 방법 카리브 암초 건물 산호의 폴립 조직 형태와 구조를 밝히기

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

연구

환경과학

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Lipophilic 염료를 결합, 현장에서 하이브리드화, Immunohistochemistry, 그리고 조직학

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

신경과학

암 조직 샘플의 종양 유발 요인에 대한 FISH 분석 개선

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While sequencing-based methodologies enable an unbiased identification of ecDNA, cytogenetic-based techniques, such as fluorescence in situ hybridization (FISH), remain time and cost-effective for identifying ecDNA in clinical specimens. The application of FISH in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue samples offers a unique avenue for detecting amplified genes, particularly when viable specimens are not available for karyotype examination. However, there is a lack of consensus procedures for this technique. This protocol provides comprehensive, fully optimized, step-by-step instructions for conducting FISH to detect gene amplification, including ecDNA, in FFPE tissue samples which present unique challenges that this protocol aims to overcome and standardize. By following this protocol, researchers can reproducibly acquire high-quality imaging data to assess gene amplification.

저자 스포트라이트: 암 표본에서 정확한 유전자 증폭 평가를 위한 도구로서의 FISH

This protocol provides a reproducible method to visualize gene amplification in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens.

Fluorescence In Situ hybridization에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매 시료에서 유전자 증폭의 강력한 검출

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While ...

암 연구학

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and free-swimming medusae. As exemplified in established models such as Hydra and Nematostella, stem cells and/or proliferative cells contribute to the development and regeneration of cnidarian polyps. However, the underlying cellular mechanisms in most jellyfish, particularly at the medusa stage, are largely unclear, and, thus, developing a robust method for identifying specific cell types is critical. This paper describes a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. Cladonema medusae possess branched tentacles that continuously grow and maintain regenerative capacity throughout their adult stage, providing a unique platform with which to study the cellular mechanisms orchestrated by proliferating and/or stem-like cells. Whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) using a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, while pulse labeling with 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU), an S phase marker, enables the identification of proliferating cells. Combining both FISH and EdU labeling, we can detect actively proliferating stem-like cells on fixed animals, and this technique can be broadly applied to other animals, including non-model jellyfish species.

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Here, we describe a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the jellyfish Cladonema. Whole-mount fluorescent in situ hybridization with a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, and 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine labeling enables the identification of proliferating cells. Together, actively proliferating stem-like cells can be detected.&#160;

형광 현장 혼성화 및 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 표지 수중동물 해파리 클라도네마 파시피쿰에서 줄기 유사 세포

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

발생학

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

생물학

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서&gt; 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

현장 Cryosectioned Zebrafish 배아에서 면역조직화학과 결합된 혼성화

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

제자리에서 파라핀 포함 성인 산호 샘플에 대 한 교 잡 기술

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복합 광학 현미경 방법 카리브 암초 건물 산호의 폴립 조직 형태와 구조를 밝히기

Lipophilic 염료를 결합, 현장에서 하이브리드화, Immunohistochemistry, 그리고 조직학

Fluorescence In Situ hybridization에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매 시료에서 유전자 증폭의 강력한 검출

Fluorescence In Situ hybridization에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매 시료에서 유전자 증폭의 강력한 검출

Fluorescence In Situ hybridization에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매 시료에서 유전자 증폭의 강력한 검출

형광 현장 혼성화 및 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 표지 수중동물 해파리 클라도네마 파시피쿰에서 줄기 유사 세포

식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

RNA

높은 해상도 전체 마운트

현장 Cryosectioned Zebrafish 배아에서 면역조직화학과 결합된 혼성화