Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im neurowissenschaftlichen Forschungsbereich zu beantworten, wie Signaltransduktionssubstrattransport und eine Abfallentsorgung in den extrazellulären Räumen des Gehirns auftreten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Probenahme und Quantifizierung großer extrazellulärer Moleküle in der Interstitial Fluid oder ISF von wachen, frei beweglichen Tieren ermöglicht. Nach der Bestätigung einer fehlenden Reaktion auf Zehenstich, entfernen Sie das Haar aus dem Schädel einer anästhesierten Maus und verwenden Sie die Ohrstangen und eine Nasenklammer, um das fixe Tier sicher auf einen Adapter zu bringen.
Tragen Sie salbe auf die Augen des Tieres auf und legen Sie den Adapter auf das stereotaxic-Gerät. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Hautschnitt sagittal über den Schädel zu machen und befestigen Sie einen Bohrer auf dem Manipulator des stereotaxic Rahmens. Senken Sie den Bohrer, bis er sanft Lambda berührt, und setzen Sie die DV-Koordinate des Bohrers auf Null zurück.
Verschieben Sie dann den Drill auf Bregma, um die AP- und ML-Koordinaten auf Null zurücksetzen zu können. Verschieben Sie den Bohrer von Bregma auf die vertikale Koordinate. Senken Sie den Bohrer auf den Schädel und stellen Sie die DV-Koordinate wieder auf Null.
Nach der Wiederholung des Verfahrens für eine dritte Koordinate, bohren Sie ein Gratloch sorgfältig an der Zielkoordinate, gefolgt von einem zweiten Loch auf der kontralateralen Seite des parietalen Knochens. Legen Sie eine Knochenschraube in das zweite Loch ein und legen Sie das Verriegelungsstück aus einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohrdeckel auf den Schädel, so dass sich die Gratlöcher innerhalb des Kreises befinden. Als nächstes legen Sie eine Führungskanüle auf den kürzeren Arm des stereotaxic Adapters und befestigen Sie die Kanüle mit einer Kappenmutter.
Stellen Sie den längeren Arm des stereotaxic-Adapters auf die Elektrodenklemme und befestigen Sie den Arm am Manipulator des stereotaxic-Geräts. Drehen Sie die DV-Stereotaxic-Baugruppe am Manipulatorarm um 12 Grad und bewegen Sie die Führungskanüle in das Gratloch. Dann senken Sie langsam die Führungskanüle 1,2 Millimeter in das Gehirn.
Fügen Sie Zahnzement in die Krone, bis der Metallteil der Führungskanüle, die Knochenschraube und alle freiliegenden Schädel bedeckt und gesichert sind und den Zement trocknen lassen. Nach 12 bis 20 Minuten den Stereotaxienadapter aus der Elektrodenklemme entfernen, die Kappenmutter entfernen und den Stereotaxienadapter durch eine Dummy-Sonde ersetzen. Dann befestigen Sie die Kappenmutter, lassen Sie die Maus aus dem stereotaxic Apparat, und hausieren Sie die Maus allein in einem einzelnen Käfig.
Vor dem Einrichten der Mikrodialyse eine Einweg-Einweg-Ein-Milliliter-Spritze mit destilliertem Wasser füllen und eine Viton-Röhre verwenden, um die Spritze an den Ausgang einer Mikrodialysesonde anzuschließen. Bedecken Sie die Entlüftungslöcher manuell und drücken Sie den Spritzenkolben vorsichtig, um die Sonde mit Wasser zu gießen. Bestätigen Sie, dass Wasser im Sondeneinlass auftaucht und dass auf der Oberfläche der Mikrodialysemembran Leckagen vorhanden sind.
Um die Sonde zu aktivieren, tauchen Sie die Sondenmembranen zwei Sekunden lang in 70-100%Ethanol ein, gefolgt von einer zweiten destillierten Wasserinfusion. Befestigen Sie eine Anschlussnadel an einer Einlass- und einer Auslassleitung und beladen Sie eine Einwegspritze mit drei Millilitern mit frisch zubereitetem Perfusionspuffer. Schließen Sie eine Spritze mit einer stumpfen Nadel an das Einlassende des Schlauches an und füllen Sie mit einer Spritzenpumpe den gesamten Schlauch mit Einemfusionspuffer.
Wenn das Rohr voll ist, ersetzen Sie die Verbindungsnadel zwischen den Ein- und Auslassleitungen durch die aktivierte Mikrodialysesonde und die Kappenmutter und montieren Sie ein Rollenrohr in den Auslassschlauch an einer Rollenpumpe. Starten Sie die Spritzenpumpe mit 10 Mikroliter pro Minute und die Walzenpumpe mit 9,5-9,8 Mikroliter pro Minute. Legen Sie nun den Kragen um den Hals der anästhesierten Führungskanüle implantierten Tier und entfernen Sie die Kappe Nuss und Dummy Sonde.
Legen Sie die Mikrodialysesonde langsam durch die Führungskanüle und befestigen Sie die Kappenmutter. Legen Sie dann die Maus in einen Käfig, der mit einem freibeweglichen System verbunden ist, und halten Sie die Maus mit dem Kragen an. Nach mindestens einer Stunde die Rollenpumpe und die Spritzenpumpe sequenziell anhalten, die Pumpen mit der Spritzenpumpe auf 20 % schneller als die Walzenpumpe einstellen und das freie Ende des Auslassschlauchs auf einen Kühlbruchkollektor legen, um das Gehirn ISF zu sammeln.
Wenn das entsprechende Versuchsvolumen erreicht wurde, entfernen Sie die Sonde und behandeln Sie die Mauswiederherstellung, wie gerade gezeigt. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen wird bei der Verabreichung von 50 Mikromolaren Picrotoxin mittels umgekehrter Mikrodialyse, wie sie bei wachen C57B6J-Mäusen nachgewiesen wurden, ein Anstieg der interstitiellen endogenen Tau-Spiegel im Vergleich zu Den werten Tieren beobachtet, die mit einer Fahrzeugkontrolle behandelt wurden. Zusätzlich zu den Arzneimittelverabreichungen kann die Mikrodialyse mit anderen In-vivo-Methoden wie EEG-Aufzeichnung oder Optogenetik kombiniert werden, um zusätzliche Fragen darüber zu beantworten, wie neuronale Aktivität die Substratkonzentration in ISF beeinflusst.
