Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Neurobiologie zu beantworten, wie motorische Neuronenpolarität, Axon-Führung, Axonhandel, und neurodegenerative Mechanismen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist es, eine hoch angereicherte motorische Neuronenkultur zu erhalten, während wir unser Knockdown-Protein nach minutenhoher Zuneigung ausdrücken. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie einen Embryo in eine Schale von Seziermedien mit Silizium kodiert.
Halten Sie den Embryo unter dem Mikroskop mit der Zange mit dem Bauch gegen das Silizium. Mit dem zweiten Zangenpaar eine der Spitzen in den zentralen Kanal des Rostradrückenmarks einlegen. Schließen Sie dann die Zange, um das Rückengewebe leicht zu reißen.
Wiederholen Sie diese Operation in Richtung der Seite, bis das gesamte Rückenmark geöffnet ist. Als nächstes positionieren Sie den Embryo so, dass das offene Rückenmark gegen das Silizium ist. Anschließend lösen Sie den rostradien Teil des Rückenmarks vom Körper.
Kneifen Sie den Rostradteil des Rückenmarks und ziehen Sie den Embryo am Kopf, um das Rückenmark zu extrahieren. Ziehen Sie alle verbleibenden Hirngebungen und DRGs, die noch am Rückenmark befestigt sind, vorsichtig weg. Flachen Sie das Rückenmark auf dem Silizium und mit einem Skalpell, entfernen Sie die dorsale Hälfte der Schnur durch Schneiden entlang der Mitte jeder Seite.
Schneiden Sie den mittleren Teil in zehn Stücke, und übertragen Sie sie in ein neues Rohr. Um die Zellsuspension der Rückenmarkszellen vorzubereiten, sammeln Sie die Rückenmarksstücke an der Unterseite des Rohres. HBSS durch einen Milliliter Schinken F-10 Medium ersetzen und zehn Mikroliter Trypsin hinzufügen.
Inkubieren Sie die Röhre für zehn Minuten bei 37 Grad Celsius. Um die enzymatische Verdauung zu stoppen, übertragen Sie die Fragmente in ein neues 15-Milliliter-Rohr, das 800 Mikroliter komplettes L-15-Medium, 100 Mikroliter 4%BSA und 100 Mikroliter DNAs und Titrat enthält. Lassen Sie die Fragmente für zwei Minuten absetzen, bevor Sie den Überstand in einem frischen 15-Milliliter-Rohr sammeln.
Fügen Sie vorsichtig zwei Milliliter 4%BSA an der Unterseite des Überstandsrohrs hinzu. Centro verschmelzen es bei 470 x Schwerkraft für 5 Minuten. Nach 5 Minuten den Überstand entfernen und die Zellpalette mit 2 Millilitern komplettem L-15-Medium wieder aufhängen.
Zur Motoneuronanreicherung die Zellsuspension in zwei 15-Milliliter-Röhren aufteilen. Fügen Sie dann zwei Milliliter L-15 PH Medium zu jeder Röhre hinzu. Wenn sie mit sechs Embryonen beginnen, verwenden Sie das Äquivalent von drei Embryonen pro Tube und drei Milliliter Medium.
Fügen Sie langsam 2 Milliliter Dichtegradienzlösung an der Unterseite jedes Rohres hinzu, um eine scharfe Schnittstelle zu erhalten. Als nächstes zentrzentrieren Sie es bei 830 x Schwerkraft für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach diesem Schritt sollten sich kleine Zellen am unteren Rand des Rohres befinden, während große Zellen - wie das Motoneuron - an der Dichtegradientenlösung/medium Schnittstelle sein sollten.
Asperae 1 bis 2 Milliliter der Zellen an der Schnittstelle und übertragen Sie sie in eine frische 15 Milliliter Tube. Stellen Sie die Lautstärke auf zehn Milliliter mit L-15 PH Medium ein. Anschließend zwei Milliliter des 4%BSA-Kissens an den Boden der beiden Röhren geben.
Und zentrzentrieren Sie bei 470 x Schwerkraft für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 5 Minuten den Überstand entfernen und die Palette wieder aufhängen und 3 Milliliter komplettes L-15-Medium aufhängen. Wiederholen Sie das Zentrifugat bei 470 x Schwerkraft für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie dann den Überstand und hängen Sie die Zellpalette und zwei Milliliter des gesamten Kulturmediums wieder auf. Um motorische Neuronen zu kultiieren, verdünnen Sie sie auf 5 000-10 000 Zellen in 500 Mikroliter Kulturmedium pro Brunnen in einer 24-Well-Platte. Entfernen Sie dann die Laminae-Lösung mit der P-1 000 Pipettenspitze.
Übertragen Sie die motorischen Neuronen sofort verdünnt in Kulturmedium. zu den Kodierungsplatten, um ein Trocknen zu vermeiden. Um DNA vorzubereiten, setzen Sie 1 Mikrogramm DNA in 50 Mikroliter neuropatorischen Kulturmedium wieder aus.
Und Wirbel für 5 Sekunden. Um die B-Röhre vorzubereiten, setzen Sie 1,5 Mikroliter Perlen in 50 Mikroliter nneuronalen Kulturmedium wieder auf. 50 Mikroliter Perlenlösung zu 50 Mikroliter DNA-Lösung hinzufügen und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Ziehen Sie während dieser Inkubation 100 Mikroliter Kulturmedium aus dem Brunnen ab, der transfiziert wird. Anschließend 100 Mikroliter der DNA-Perle auf jeden Brunnen übertragen. Und inkubieren Sie die 24 Brunnenplatte, 20-30 Minuten auf der Magnetplatte bei 37 Grad Celsius.
Hier ist die modem-neuronmorphologische Ologie, die durch das Stehen der endogenen nicht-phosphorylierten Neurofilament schwere Kette nach vier Tagen Kultur offenbart. In diesen Bildern zeigen Sie die modem-neuronmorphologische Ologie nach vier Tagen in vitro und transfiziert für EGFP Transgen durch Magnetofektion am zweiten Tag. Motto-Neuronen wurden mit dem Marker SMI-32 oder dem Pan-Neuro-Marker TUJ-1 gegengefärbt und die Pfeile zeigen das Soma der Neuronen an.
Dies sind ihre konfokalen Bilder von magneto-ektierten motorischen Neuronen, die wilde Typ- oder mutierte EGFP NEFH-Konstrukte ausdrücken und für ihren autophagischen Marker LC-3B gebeizt werden. Pfeile zeigen die mutierten EGFP NEFH Proteinaggregate, die auch LC-3B positiv sind Nach diesem Verfahren kann Montoholda curcha per Videomikroskopie analysiert werden, um den Axonhandel zu visualisieren und einige Hinweise hinzuzufügen. Nach seiner ersten Entwicklung, um grundlegende Fragen in der neuronalen Biologie anzugehen, erwies sich diese Technik auch als ein leistungsfähiges Werkzeug, um physiopathologische Mechanismen zu erforschen, die das Spektrum von Motoneuron-Störungen, wie toxische Schocksyndrom-Krankheit, Samuel trophische Lateralsklerose oder spinale Muskelatrophie, implizieren.
