Dieses menschliche neuromuskuläre Knoten-Induktionssystem kann verwendet werden, um die Bildung von prä- und postsynaptischen Komponenten zu induzieren, einschließlich motorischer Neuronen, Skelettmuskel, und Schwann-Zellen. Eine ausgereifte, komplexe NMJ-Struktur kann nicht nur in einer einzigen Kulturschale aus einer einzigen Ausgangszellenpopulation erhalten werden, sondern das resultierende NMJ besitzt auch die Fähigkeit, sich zusammenzuziehen. Diese Methode hat Potenzial für die Untersuchung neuromuskulärer Erkrankungen, wie spinale Muskelatrophie, und für therapeutische Seuchen.
Das differenzierte NMJ ist ein sehr dickes, komplexes Gewebe, und es ist schwierig zu visualisieren. Indem wir das Verfahren demonstrieren, können wir den Leser anweisen, wie wir bestimmte Strukturen identifizieren können. Waschen Sie die Zellen mit drei MilliliterPBS, bevor Sie einer Petrischale einen Milliliter Zellablösung hinzufügen.
Nach 10 Minuten bei 37 Grad Celsius drei Milliliter embryonales Stammzellmedium zu jedem Brunnen hinzufügen und die Pipette dreimal sanft pipette, um die Zellen von den Abdeckungen zu trennen. Als nächstes bündeln Sie die freistehenden Stammzell-haltigen Überräuer zur Zentrifugation in ein 50-Milliliter-Konikonulus und setzen das Stammzellpellet in drei Millilitern frischen embryonalen Stammzellmediums der Primaten wieder auf, ergänzt mit 10 Mikromolaren Y-27632 ROCK-Hemmern zum Zählen. Dann verdünnen Sie die Zellen auf zwei mal 10 bis zu die fünf Zellen pro Milliliter Medium, ergänzt mit ROCK-Hemmer-Konzentration, und geben Sie zwei Milliliter Zellen in jedem Deckel in jedem Brunnen der extrazellulären Matrix-beschichteten Sechs-Well-Platte zurück.
Ersetzen Sie nach 24 Stunden den Überstand in jedem Brunnen durch zwei Milliliter frisches embryonales Stammzellmedium des Primaten, ergänzt durch ein Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin, und geben Sie die Platte für 24 Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurück. Am Ende der Inkubation die Überräube durch zwei Milliliter Differenzierungsmedium, ergänzt durch Doxycyclin pro Brunnen, ersetzen und die Platte für 10 Tage in den Zellkultur-Inkubator zurückgeben. Am Ende der Inkubation die Überräube durch zwei Milliliter myogenes Differenzierungsmedium, ergänzt durch Doxycyclin pro Brunnen, ersetzen und die Platte für weitere 10 Tage an den Zellkultur-Inkubator zurückgeben.
Am Ende der Inkubation, ersetzen Sie die Übersprecher mit zwei Milliliter neuromuskulären Knoten Medium pro Brunnen und geben Sie die Platte an die Zellkultur Inkubator für 30 Tage. Visualisieren Sie am Ende der Inkubation die differenzierten neuromuskulären Verbindungen durch invertierte Mikroskopie. Um die Myotube Kontraktionen auszulösen, fügen Sie 25 Millimolar Calciumchlorid zu jedem Brunnen von differenzierten neuromuskulären Knotenzellen.
Und innerhalb von ein bis zwei Minuten nach der Behandlung, legen Sie die Platte auf die Bühne eines invertierten Mikroskops. Zeichnen Sie mit der Live-Zellmikroskopie einen Film über die Myotube-Kontraktion für 20 Sekunden auf. Am Ende der Aufnahme fügen Sie dem Kulturmedium 300 Nanogramm pro Milliliter Curare hinzu und nehmen Sie den Film für weitere 20 Sekunden auf, bevor Sie die Filmdatei in einem geeigneten Bewegungsvektoranalyse-Softwareprogramm zur Analyse öffnen.
Immunfluoreszierende Färbung der Neurofilament synaptischen Gefäße und Acetylcholin-Rezeptoren können durchgeführt werden, um die Neuronen zu identifizieren. Motorneuronen könnten durch TUJ 1 und Islet 1 Färbung identifiziert werden, während postsynaptische Myotuber durch Färbung für Myosin schwere Kette identifiziert werden können. Schwann-Zellen können mit S-100-Antikörpern beschriftet werden.
In diesen Rasterelektronenmikroskopiebildern kann die Morphologie ausgereifter neuromuskulärer Knoten mit klarer Visualisierung der erweiterten Axonklemmen, Axone und Muskelfasern beobachtet werden. Transmissionselektronenmikroskopie kann verwendet werden, um die ausgereifte Ultrastruktur der neuromuskulären Komponenten zu visualisieren, einschließlich der präsynaptischen Axonklemme mit synaptischen Vesikeln und der postsynaptischen Region, die durch den synaptischen Spalten getrennt ist. Junctionale Falten markieren die Kreuzung zwischen Neuron und Muskelfasern.
Hier werden ausgereifte Axonklemmen gezeigt, die synaptische Vesikel enthalten. Zusammengenommen deuten diese morphologischen Merkmale darauf hin, dass die neuromuskulären Komponenten gut induziert und gereift waren. Die funktionelle Beurteilung der Zellen zeigt, dass prominente neuromuskuläre Junction-Bewegungssignale durch Calciumchlorid induziert werden können und dass diese Kontraktionen durch Curare unterbrochen werden können, die bestätigen, dass die motorischen Neuronensignale durch die neuromuskuläre Verbindung übertragen werden, um Muskelkontraktion auszulösen.
Die Zellsädichte beeinflusst die Effizienz der NMJ-Bildung. Es kann entsprechend den experimentellen Zwecken geändert werden, um sich an das Protokoll anzupassen. Diese neuromuskuläre Knotenkultur enthält mehrere Zelltypen, und diese Komponenten können verwendet werden, um die Wechselwirkungen zwischen diesen Zellen während der neuromuskulären Knotenentwicklung oder als Reaktion auf bestimmte Krankheitspathologien zu studieren.
