Name: isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids
Uploaded: 2018-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids at JoVE.com

Wir danken für die Unterstützung bei FCP Reinigung Rana Adeel Ahmad. Prof. Claudia Büchel ist für hilfreiche Diskussionen anerkannt und das Manuskript zu lesen. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft, LD (DI1956-1/1) und der Humboldt-Stiftung für ein Feodor-Lynen-Forschungsstipendium für LD unterstützt.

Hinweis: Photosynthetischen komplexe wie FCPs sind sehr anfällig für Licht und Wärme. Arbeiten Sie immer auf dem Eis und unter einem sehr schwachem Licht.
1. Isolierung der FCP aus Zellen
<ol><li>
Thylakoidmembran Isolation von C. Meneghiniana Zellen
	<ol>
<li>Wachsen Sie C. Meneghiniana in fünf 500 mL-Flaschen, die jeweils mit 300 mL von ASP-Medium23,25 und 50 Millionen Zellen gefüllt. Stecken Sie die Flaschen mit einem Baumwoll-stopfen und lassen Sie die Zellen wachsen in der exponentiellen Wachstumsphase für etwa eine Woche auf einem Boston-Shaker mit 120 u/min mit einem 16 h Licht und dunkle Phase 8 h 40 µmol photons/(m²s) weißes Licht und eine Temperatur zwischen 15-18 ° C. Überprüfen Sie die Anzahl von Zellen zwischen 1,5 Millionen Zellen/mL mit einer Zelle Zähler Kammer.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 4.000 X g in eine vorgekühlte Rotor mit 500 mL Zentrifuge Fläschchen (4 ° C) für 15 min in einer High-Speed-Zentrifuge. Wieder aussetzen der Zelle Pellets in 12 mL Homogenisierung Puffer (HB, Tabelle 1) durch pipettieren.<ol>
<li>Übertragen Sie die Aussetzung auf einen einzigen 50 mL-Kunststoff-Rohr. Speichern Sie die Proben bei-80 ° C oder fahren Sie mit Schritt 1.1.3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kühlen Sie Rührwerksmühle und Ausrüstung vor. Füllen Sie die 50 mL-Becherglas von der Rührwerksmühle auf 75 % mit einer Glas-Perle-Mischung und fügen Sie die Zellsuspension. Verwenden Sie für Zellaufschluss, 7 x 45 s Pulse auf Hochtouren mit 30 s Kühlung zwischen jedem Impuls. Nehmen Sie 20 µL des gestörten Zellen für Qualitätsprüfungen in Schritt 1.1.6.</li>
		<li>Filtern der gestörten Zellen über einen Filter Glastrichter und Waschen durch die HB über die Glasperlen Gießen, bis sie klar erscheinen. Pool der Wäsche Bruch mit dem Filtrat. Halten Sie das Endvolumen niedriger als 150 mL.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe für 15 min bei 140 X g mit drei 50 mL-Kunststoff-Rohre zu den zellenrückstand Pellets. Sorgfältig übertragen Sie den überstand auf 20 mL Polycarbonat Ultrazentrifugation Fläschchen und entsorgen Sie das Pellet.<ol>
<li>Füllen Sie die Fläschchen mit HB, equilibrate das Gewicht und in einem geeigneten Rotor für 1 h bei 300.000 x g und 4 ° C in die Thylakoidmembran Membranen pellet Zentrifugieren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nutzen Sie die Zentrifugation Zeit den Anteil der gestörten Zellen durch Mikroskopie bei 400 X Vergrößerung mit 20 µL Probe in 1.1.3 zu überprüfen. Berechnen Sie das Verhältnis zwischen Chloroplasten frei und Chloroplasten mit Frustules (Siliziumdioxid-Schalen). Hinweis: Diatomee Zellwände bestehen aus Kieselsäure, die als sehr interferenzgitters Stoff im Mikroskop sichtbar ist. Chloroplasten auftritt als grüne Punkte sollten aus den Zellen freigegeben worden sein, wenn der Zellaufschluss gearbeitet.</li>
		<li>Wieder aussetzen der Membran-Pellet mit als wenig waschen Puffer wie möglich (0,5-1 mL) mit einem kleinen Maler Pinsel. Füllen Sie die Polycarbonat Ultrazentrifugation Fläschchen mit Waschpuffer (Tabelle 1), equilibrate des Gewichtes und der Zentrifuge für 20 min bei 200.000 x g und 4 ° C.<ol>
<li>Wieder aussetzen Sie, die gewaschenen Membranen mit Pinsel des Malers. Waschen-Puffer nur bei Bedarf hinzugefügt werden, die Thylakoidmembran Konzentration so hoch wie möglich zu halten. Bündeln Sie alle Thylakoids in ein Probengefäß (15 mL).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereits verdünnen Sie die Proben mit 10 µL der Probe mit 90 µL 100 % Aceton. Zentrifugieren sie 12.000 x g für 5 min zu Pellets ausgefälltes Eiweiß. Nehmen Sie 10 µL der Vorverdünnung und mischen Sie es mit 990 µL 90 % Aceton.<ol>
<li>Messung der Extinktion (ABS) von Chlorophyll A und c auf 664 nm und 630 nm in 90 % Aceton. Subtrahieren Sie die ABS-750nm aus beiden Werten. Den insgesamt Chlorophyll-Gehalt anhand der folgenden Formel:24 1)<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58017/58017eq1.jpg"> 2)<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58017/58017eq2.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aliquoten Thylakoids in Portionen von 0,5 mg insgesamt Chlorophyll in einem 1,5 mL Reaktionsgefäße Einfrieren in flüssigem Stickstoff und bei-80 ° C bis zur weiteren Verwendung aufbewahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trennung und Konzentration der FCP-komplexe
	<ol>
<li>Bereiten Sie einer Saccharoselösung gradient vor und füllen Sie die Ultrazentrifuge Rohre bis oben minus das Ladevolumen (300 – 500 µL). Frieren Sie die Röhrchen bei-20 ° C so lange ein, bis sie vollständig gefroren sind. Lassen Sie die Röhrchen bei + 4 ° C, 3-4 h für einen 17 mL-Tube führt Auftauen.<ol>
<li>Wiederholen Sie den Frost-Tau-Zyklus zweimal, um die Steigung für eine bessere Auflösung zu verfeinern.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwenden Sie die Proben in 1.1.9 entspricht 0,5 mg Chlorophyll und justieren mit Puffer B1 (Tabelle 1) zu einem Endvolumen von 2 mL. Fügen Sie n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (b-DDM hinzu) Solubilisierung eine Endkonzentration von 20 mM.<ol>
<li>Invertieren der Röhre 3 Mal und legen Sie es auf dem Eis für 20 min mit sanft schütteln um Schaum zu vermeiden. Zentrifuge für 5 min bei 12.000 X g in einer vorgekühlten Tischplatte Zentrifuge bei + 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Laden Sie den überstand auf der Steigung. Geladen Sie mehr als 125 µg Gesamt Chlorophyll pro Farbverlauf nicht, wenn 17 mL Fläschchen verwendet werden. Zentrifuge für 22 h bei 100.000 x g und + 4 ° C.<ol>
<li>Erholen Sie die gewünschte braun FCP Brüche von der Steigung mit einer Spritze (Abbildung 2A). Nehmen Sie eine 5 µL aliquoten und verdünnen Sie es mit 995 µL B1a.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Messen Sie das Absorptionsspektrum (ABS) zwischen 370-750 nm im UV-VIS-Spektralphotometer. Verwenden Sie Halbmikrowaagen optisches Glas Küvetten.<ol>
<li>Öffnen Sie die Spektren-Manager-Software, zum Spektrum-Modus gehen und aufzeichnen eine Basislinie von 370 bis 750 nm gefolgt von Probemessungen. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: scan-Geschwindigkeit, 200 nm/min; Daten Tonhöhe, 0,5 nm; Antwort, mittlere.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Messen Sie das Volumen der wiederhergestellten Probe mit einer Mikropipette. Waschen Sie die FCP-komplexe durch Hinzufügen von zweimal die wiederhergestellten Volumen mit B1-Puffer (Tabelle 1). Konzentrieren Sie sich in einem Membran-Konzentrator mit einem 30 kDa cutoff bei 1.000 X g und + 4 ° C zu einer ABS-672nm von mindestens 20. Hinweis: Die b-DDM-Konzentration könnte aufgrund der Micelle Anreicherung in den Probenraum steigen. Dies könnte zu weiteren Solubilisierung der FCP komplexe führen! Vermeiden Sie übermäßige Solubilisierung durch Zugabe von Waschmittel freien Puffer B1, wenn weitere Schritte waschen sind erforderlich, um verbleibende Saccharose zu entfernen.</li>
		<li>Nehmen Sie eine 20 µL aliquoten für die Steuerelemente. Schock der Proben in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° c aufbewahren</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig2.jpg"> Abbildung 2: Reinigung von FCP, spektroskopische Kontrollen und Reinheit überprüfen. (A) typische Aussehen eines Saccharose-Dichte-Gradienten nach Übernachtung Zentrifugation. Alle braune Bänder enthalten den FCP-Pool bestehend aus FCPa und FCPb. Pigm. - ungebundenen Pigmenten, PS - phototrophen (B) Absorption Spektren von FCP vor (blaue Linie) und nach (Orange gestrichelte Linie) Konzentration 30 kDa cutoff zentrifugale Filter Geräte mit . Carotinoide sind besonders anfällig für Verlust von FCP, die geringere Absorption im Bereich zwischen 500-550 nm zur Folge hätte. Graphen sind normiert auf das Chlorophyll Qy max. ~ 670 nm. (C) Chlorophyll A Emissionsspektren mit Anregung der Chl c (465 nm) für die Prüfung der funktionellen Erregung Energieübertragung. Wenn die Energie von Chl c an Chl Übertragung eine behindert wird, eine zusätzliche Fluoreszenz-Band auf ~ 640 nm (Chl c) auftreten würde. Grafiken sind auf maximale Emission normalisiert. (D) Anregung Spektren aufgenommen bei 675 nm (Chl eine maximale Fluoreszenz) zum Testen der Energieübertragung in Chl eine aus alle Pigmente absorbieren zwischen 370 nm und 600 nm. Wenn die Energie in Chl übertragen eine ist weniger effizient, die Fluoreszenz-Rendite vor allem zwischen 465 und 550 nm verringern würde. Die Diagramme sind normiert auf maximal rund 440 nm. Die Spektren in (B), (C) und (D) sind fast identisch, wenn die Konzentration gut funktioniert. (E) suchen Sie nach Reinheit der isolierten FCP mit einem Tris-Tricine Gel28. FCPa und FCPb haben Untereinheiten zwischen 18-19 kDa. Alle sichtbaren Silber gefärbten Proteine größer als 20 kDa sind Verunreinigungen. Thyl. -Thylakoids <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="3"><li>
Spektroskopische und Gel-basierte Steuerungen
	<ol>
<li>Notieren Sie die Absorption zwischen 370-750 nm 5 µL des FCP in 995 µL B1a nach Schritt 1.2.5. Vergleichen Sie es mit dem in Schritt 1.2.4 erhaltenen Spektrum. Verwenden Sie die gleichen Instrumente und Einstellungen wie in Schritt 1.2.4 beschrieben.<ol>
<li>Exportieren Sie Daten als *.CSV und importieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation. Beide Spektren zum Maximum des Chl zu normalisieren einer in der Q-y -Band von rund 672 nm wie in Abbildung 2 bdargestellt.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Berechnen Sie den Verdünnungsfaktor der Proben aus Schritt 1.2.4 und 1.3.1 durch Teilung der gemessenen ABS-672nm durch die gewünschte ABS-672nm von 0,03. Die Proben entsprechend verdünnen mit B1a und übertragen Sie sie auf Spezialglas Fluoreszenz Küvetten.</li>
		<li>Rekord Chl ein Fluoreszenz-Emissionsspektrum mit einer Spectrofluorometer, intakt Lichtenergie zu offenbaren transfer vom Chl c zum Chl (Abbildung 2).<ol>
<li>Die Spektrometer-Software verwenden und gehen in den Messmodus Spektrum mit den folgenden Einstellungen: Modus, Emission; Schlitz Breite Anregung und Emission, 3 nm; Empfindlichkeit, mittlere; Scan-Geschwindigkeit, 100 nm/min; Daten Tonhöhe, 0,5 nm; Erregung Wellenlänge, 465 nm; Emission, 600-800 nm. Durchführen Sie Autozero und Maßnahme.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Notieren Sie Anregung Spektren mit der gleichen Probe und Ausrüstung intakt Energieübertragung aus alle Pigmente in Chl offenbaren ein (Abb. 2D). Einstellungen zu ändern: Modus, Erregung; Emissionswellenlänge, 675 nm; Erregung, 370-600 nm. Die Spektren aufnehmen.<ol>
<li>Korrigieren Sie mit einem Rhodamin-Spektrum in der gleichen Größenordnung für die spektralen Eigenschaften der Lampe – Cf. Anweisungen in der Bedienungsanleitung.</li>
		</ol>
</li>
		<li>BKP Mix Proben entspricht 1 µg Chl eine mit 10 µL SDS-laden-Puffer. 10 min bei 25 ° c inkubieren Zentrifuge für 5 min bei 12000 X g in einer Table-Top-Zentrifuge.<ol>
<li>Laden Sie den überstand auf eine Tris-Tricine Gel28. 2 h bei 150 V zu trennen Sie und nach Trennung40Silber-Fleck. Hinweis: Die FCP-Untereinheiten getrennt in zwei prominente Protein Bänder zwischen 18-19 kDa, die Bestandteile des FCPa und FCPb29 (Abbildung 2E) sind.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung von Liposomen und Eingliederung des FCP
<ol><li>
Vorbereitung der Lipid-Mischung und Lipid Waschmittel Mizellen Hinweis: Lipide sind anfällig für warme Temperaturen kombiniert mit oxidativen Bedingungen. Versuchen Sie, die Lipide gekühlt und unter einer N-2 -Atmosphäre zu halten.<ol>
<li>Berechnen Sie die gewünschte Thylakoidmembran Lipid-Verhältnisse für C. Meneghiniana laut Vieler Et Al. 200730. Siehe das Beispiel in Supplemental Tabelle 1. Bereiten Sie die Lipid Stammlösungen der vom Hersteller empfohlenen in einem Lösungsmittel Behältnis.</li>
		<li>Pipette die gewünschte Menge von Lipiden in einer 2 mL Reaktionsgefäß und verdunsten der Chloroform mit einem sanften Stickstoff-Flow und versuchen, die Lipide über die gesamte Fläche der Röhre Basis zu verteilen. Lassen Sie die N2 fließen, bis alle Lösungsmittel verdunstet ist.</li>
		<li>Solubilisieren Sie die Lipid-Mischung in 29 µL n-Octyl-β-D-Glucopyranoside-Lösung (OG) bei 4 ° C für 4 h Inkubation die Lipid-Mischung für 10 min bei 30 ° C. Inkubieren Sie die Lipide in einem sonikator Bad für 3 x 3 min bei 25 ° C unterbrochen von 30 s auf dem Eis.<ol>
<li>Fügen Sie 221 µL Trizin--Puffer und 250 µL 4 X Dialyse-Puffer.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwenden Sie einen Extruder mit 0,1 µm-Polycarbonat-Membranen für einen definierten Liposomen-Durchmesser von 50-70 nm. Montieren Sie den Extruder mit der Membrane und Filter Unterstützung. Vermeiden Sie Luftblasen, und ziehen Sie die Baugruppe gründlich.</li>
		<li>Füllen Sie eine Spritze mit 4 X-Dialyse-Puffer und vornässen des Extruders, bis keine Luftblasen in der zweiten Spritze gesehen werden können.</li>
		<li>Gelten die Lipid-Reinigungsmittel-Mizellen für Extruder und drücken Sie die Lösung aus einer Spritze in die andere her und zurück. Wiederholen Sie diesen Schritt 5 Mal, bis die Lösung homogen erscheint. Hinweis: Diese Lösung kann für mehrere Tage bei 4 ° C aufbewahrt werden. Nicht einfrieren!</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Einbeziehung der FCP-komplexe und Entfernung von Waschmitteln und Aggregate Hinweis: In diesem Beispiel verwenden wir ein Lipid/Chl Verhältnis 12:1, was eine Lipid-Eiweiß-Verhältnis von etwa 100: 1 entspricht.<ol>
<li>Fügen Sie gleich 20 µg Chl FCP ein in einem Gesamtvolumen von 500 µL B1a Puffer zu 250 μL der extrudierten Lipid-Micellen und 250 µL 4 x Dialyse-Puffer. Inkubieren Sie die Proben 3 x 3 min bei 25 ° C in einem Thermomixer bei 1.500-3.000 u/min, unterbrochen von einer 30 s Pause auf dem Eis.</li>
		<li>Schneiden Sie den Deckel des vier 1,5 mL Reaktionsgefäß knapp unter der Spitze geben einen Ring, der noch auf dem Deckel passt. Bereiten Sie 1,5 x 1,5 cm Stücke der Dialysemembran vor und waschen Sie sie in 20 mL 1 X Dialyse-Puffer</li>
		<li>Füllen Sie 250 µL der Probe zu jeder Deckel. Legen Sie die Membran vorsichtig, auf dem Deckel, damit das Fach mit der Probe vollständig gefüllt ist und keine Luftblasen entstehen. Die Reaktion Rohr Ring auf der Versammlung zu verschärfen, um ein geschlossenes Fach haben.</li>
		<li>Die Proben in 50 mL 1 x Dialyse-Puffer über Nacht (12-16 h) auf Eis auf eine taumelnde Shaker Dialyse. Ersetzen Sie den verwendeten Dialyse-Puffer mit frischen und fügen Sie 7 mg des Adsorbens Perlen, die restlichen Waschmittel für mindestens 6 h zu entfernen.</li>
		<li>Den Dialyse-Puffer wieder ersetzen und Dialyse für eine weitere 12 Std. wieder die Liposomen durch piercing die Dialysemembran mit 200 µL Mikropipette Spitze und Aspirieren Sie alle Liposomen aus dem Reaktion Rohr Deckel.</li>
		<li>Optionaler Schritt: Wenn hoher Reinheit (> 95 %) ist erforderlich. Vorbereiten einer diskontinuierlichen Dichtegradienten in 17 mL Ultrazentrifugation Fläschchen mit Schritten, enthält 6 %, 10 %, 15 % und 20 % Saccharose Hitzesensoren Copolymer in Dialyse-Puffer. Laden Sie die Liposomen auf der Oberseite und Ultrazentrifugen bei 100.000 x g für 4 h in einem schwingenden Eimer-Rotor.<ol>
<li>Erholen Sie die oberen braunen Band mit einer Spritze zu, verdünnen Sie der Probe 1:5 mit DP und mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zentrifugieren der FCP-Liposomen in mindestens 2 mL 1 x Dialyse-Puffer für 1,5 h bei 100.000 x g und 4 ° C. Die Liposomen durch drehen die Zentrifugenröhrchen in einem Winkel von 45° zu erholen. Lassen Sie die Liposomen für 1 min (Abbildung 3A) nach unten zu bewegen.</li>
		<li>Wiederherstellen der FCP-Liposomen in einem Endvolumen von 25-50 µL. nicht zu stören den Niederschlag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Regler 1: Absorption, Fluoreszenz-Spektroskopie
	<ol>
<li>Fügen Sie eine Aliquote 3 µL der FCP-Liposomen zu einem Endvolumen von 1 mL 1 x Dialyse-Puffer und Zentrifuge für 5 min bei 12.000 x g.<ol>
<li>Notieren Sie die Absorption zwischen 370 und 750 nm der FCP-Liposomen mit gleicher Ausstattung wie unter 1.2.4. Normalisieren Sie das Spektrum, das Maximum in der Q-y -Region des Chl (670-680 nm) zu und vergleichen sie das normalisierte Spektrum der solubilisiert FCP (Abbildung 3).</li>
		</ol>
</li>
		<li>FCP-Liposomen in 1 mL der DP mit einer Extinktion (ABS) vorbereiten = 0,03 in Bezug auf das Maximum zwischen 670-680 nm. Passen Sie die solubilized FCP in Waschmittel aus Schritt 1.2.6 die gleichen ABS verdünnen mit B1a.</li>
		<li>Nehmen Sie 1.2.4 beschrieben Absorption Spektren beider Proben auf. Zeichnen Sie auf, Chl ein Fluoreszenz-Emissionsspektrum beider Proben in 1.3.3 beschrieben. Hinweis: Die Fluoreszenz-Rendite sinkt in der FCP-Liposomen-Probe (Abbildung 3D und vgl. Diskussion.)</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig3.jpg"> Abbildung 3: Isolierung von FCP Proteoliposomes gefolgt von spektroskopischen Kontrollen und konfokale Bildgebung. (A) Erholung der FCP Liposomen nach Zentrifugation. Drehen Sie die Zentrifugation Röhre auf 45° und warten Sie ca. 1 min - Liposomen bewegt sich nach unten, während der FCP aggregiert die Liposomen-Stick an der Rohrwand nicht berücksichtigt sind. (B) Vergleich der Absorption Spektren von solubilisiert FCP in Waschmittel (blau) und FCP in Liposomen (Orange) (C) die gleiche Spektren wie in (B) normiert auf Chl maximal in den roten Bereich (~ 670 nm - Qy Peak); solubilisiert FCP in Waschmittel (blau) und FCP in Liposomen (Orange). Potenziell, gäbe es ein Pigmentverlust hauptsächlich der Carotinoide sichtbar im Bereich 500-550 nm. Das clustering von FCP in Liposomen führen zu einer Peak Verbreiterung und eine leichte Verschiebung der Chl maximal (~ 670 nm) auf dem roten. (D) Emissionsspektren solubilisiert FCP in Waschmittel und FCP in Liposomen. Clustering von FCP in den Liposomen erhöht energetischen Interaktionen der FCP-komplexe, die senkt der Fluoreszenz-Ausbeute (orange Kurve) und verschiebt sich die Emission Maxima leicht den roten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

FCP Liposomen mit natürlichen lipidzusammensetzung bieten eine praktische, einfache und reproduzierbare Werkzeug, um spektroskopische Eigenschaften zu untersuchen in-vitro-. Die Lipid-Umwelt in FCP Liposomen ähnelt die Situation innerhalb der Thylakoidmembran Membran, was zu experimentellen Ergebnissen, die näher an der natürlichen Bedingungen sind.
Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung von C. Meneghiniana als Modellsystem für FCP-Antenne. Es wächst relativ schnel...

Photosynthetische Organismen wie Kieselalgen müssen mit wechselnden Lichtverhältnissen bewältigen und mit anspruchsvollen Akklimatisierung Mechanismen, die nachhaltig hohe photosynthetischen Leistungsfähigkeit und schützt vor Foto-oxidative Schäden, die durch das übermäßige Licht reagieren. Ein bedeutenden Licht-Schutz-Prozess in den photosynthetischen Eukaryotes ist die hochenergetische abschrecken (QE) absorbiert Licht, das auftritt, als der wichtigste Beitrag zur nicht-photochemische abschrecken (NPQ) unter Lichtstress Bedingungen1,2 ,3. Die leichte Ernte Antennenkomplexe (LHC) sind bei der Regulierung der Übertragung Energiebahnen Erregung beteiligt. Als Reaktion auf hohe Licht induzierten niedriger pH-Wert in den Chloroplasten Lumen, die Antenne System Schalter aus dem Licht, die Ernte in den abschrecken Zustand. Dieses dissipativen Energiezustand verhindert photosysteme (PS) und anderen Anlagen in der Thylakoidmembran Membran Photooxidation. In den photosynthetischen Eukaryotes wird QE in der Regel durch zwei Faktoren1,2,3induziert. Ein Faktor ist das spezielle Licht Ernte Protein, das auf den niedrigen pH-Wertreagiert. Die PsbS-Protein induziert die QE in höheren Pflanzen4. LhcSRs5, moduliert durch PsbS Aktivität induzieren die QE in Grünalgen6. Kieselalgen besitzen Lhcx-ähnliche Proteine, die strukturell verwandt mit LHCSRs7,8,9,10.
Der zweite Faktor qE ist das Xanthophyll Zyklus wo Carotinoide der Antenne in Form eines Foto-Schutz durch de-Epoxidierung umgewandelt und durch Epoxidierung zurückgesetzt. In Pflanzen und Grünalgen wird Violaxanthin in Zeaxanthin konvertiert. In Diatomeen ist Diatoxanthin, Diadinoxanthin konvertiert, die dann mit dem Ausmaß der NPQ11 korreliert. Die Diatomee Licht Ernte Antenne besitzt einige Besonderheiten, obwohl es evolutionär im Zusammenhang mit Pflanzen und Algen LHCs ist. Der Wechsel von Licht, die Ernte bis zur Foto-Schutz ist enorm schnell und die NPQ Kapazität ist höher im Vergleich zu Pflanzen12. Dies könnte ein Grund sein, warum Diatomeen sind sehr erfolgreich in verschiedenen ökologischen Nischen in einer Weise, die sie für bis zu 45 % der ozeanischen Primärproduktion13verantwortlich sind. Diatomee leichte Ernte Systeme sind daher ein interessantes Objekt der Fotosynthese Forschung.
Diatomeen, wie die centric Art Cyclotella Meneghiniana Thylakoidmembran inneren Licht Ernte Systeme benannt nach die Pigmente, die sie besitzen binden - Fucoxanthin, Chlorophyll (Chl) a und C, also FCP Licht Ernte Proteine, wie z. B. FCPs, sind eingebettet in die Thylakoidmembran-Membran-System, bestehend aus mehreren Schichten der Membran. Kieselalgen bilden Bands der drei Thylakoids. Dieser Komplex Situation macht es schwierig, sie zu studieren, auf molekularer Ebene in die Thylakoidmembran Membran. Darüber hinaus tragen viele Komponenten bei der Regulierung von Licht, die Ernte (siehe oben). Daher wurden in vielen Ansätzen, die komplexe isoliert aus der Membran mit Feinwaschmittel, wie n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (β-DDM), die anderweitig der Membran aber die FCP-komplexe intakt zu halten. Viele spektroskopische Untersuchungen wurden durchgeführt mit solubilisiert FCP, um Intramolekulare Energie Übertragung14,15,16,17zu untersuchen. Jedoch war dieser ehemaligen Ansatz beschränkt, da die Regulierung der Energieübertragung excitonic Interaktion mit anderen Antennenkomplexe oder photosysteme braucht. Daher können nicht diese Art von Studien mit solubilisiert komplexe erfolgen, weil die Interaktion zwischen komplexen verloren geht.
Ein wichtiges Merkmal im Antenne-Verordnung ist die "Molekulare Verdrängung" der Antenne und phototrophen in die Thylakoidmembran Membran18. Früher ein einfacher Ansatz wurde durchgeführt, um diesen Effekt zu simulieren in-vitro-. Das Waschmittel wurde entfernt, was zu zufälligen Aggregation der Antennenkomplexe führt. Obwohl einige vernünftigen Daten von diesem Ansatz17,19erworben wurde, das Reinigungsmittel entfernen spiegelt nicht die Situation in Vivo und hat einige Einschränkungen, da die komplexe nicht in ihre regelmäßigen Tertiär interagieren Struktur.
Die Verwendung von Liposomen überwindet einige der ehemaligen Einschränkungen. Die Tertiärstruktur ist noch völlig intakt. Der liposomenmembran bietet eine quasi-native Umgebung für die Antennenkomplexe. Die Membran trennt das Innere der Liposomen aus der äußeren Umgebung. Auf diese Weise bieten Liposomen zwei Reaktion Fächer für Studien von Ionen und pH Gradienten sowie Transportprozesse. Darüber hinaus können die Parameter des experimentellen Systems leichter für Studien in der Thylakoidmembran Membran gesteuert werden. Liposomen bereits erwiesen sich ein ausgezeichnetes Werkzeug, photosynthetischen komplexe zu studieren. Ein wichtiger Schwerpunkt in der Vergangenheit wurde auf Pflanze LHC, wo die Wirkung der veränderte lipidzusammensetzung am LHC II20getestet wurde. In anderen Ansätzen Proteinprotein Interaktionen zwischen verschiedenen LHC II waren untersuchten21. Darüber hinaus wurden einige Studien in Grünalgen durchgeführt, die beschreiben, spontane clustering zwischen LHC22. In Anbetracht der Bedeutung von Kieselalgen für aquatische Ökosysteme wurden relativ wenige Studien mit Antennenkomplexe von Kieselalgen durchgeführt. Zwei Studien untersuchten die Antennenkomplexe centric Cyclotella Meneghiniana, wo das clustering der FCP Antenne23 und Reaktionsfähigkeit des FCP auf elektrochemischen Gradienten24 wurden gezeigt. Liposomen sind somit ein hervorragendes Instrument Diatomee Antennen und deren Interaktion und Regulierung in fast native Bedingungen zu studieren. Die Liposomen sind vielseitig, da viele Bedingungen wie lipidzusammensetzung, Liposomen Größe, Protein-Dichte und die umgebende wässrige Phase angesteuert werden. Die Methode erfordert darüber hinaus geringe Mengen an Proben. Die experimentelle System ist robust und hoch reproduzierbare. Die Abschottung der Liposomen ermöglicht Studium pH und Ionen-Gradienten, die wichtig sind bei der Regulierung der Antennenkomplexe Faktoren.
Hier beschreiben wir die Isolation der FCP Antennenkomplexe von C. Meneghiniana und ihre Eingliederung in den Liposomen mit natürlichen Thylakoidmembran lipidzusammensetzung. Auch wir bieten beispielhafte Daten für die spektroskopische Charakterisierung von solubilisiert FCP und vergleichen Sie sie mit FCP in Liposomen. Die Methode fasst wissen und standardisierte Protokolle von den Verbesserungen der Gundermann und Büchel 201223, Natali Et Al. 201622und Ahmad und Dietzel 201724erhalten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Workflows. (1) bezieht sich auf Absatz 1 beschreibt Zellwachstum, Störung und Thylakoidmembran Isolation mit FCP Trennung im Anschluss an Saccharose Dichtegradienten; C. m. -Cyclotella Meneghiniana Zellen. (2) Vorbereitung der natürlichen Thylakoidmembran Lipid Mischung (MGDG, DGDG und SQDG) gemäß Absatz 2 und die Schaffung von Lipid-Reinigungsmittel Micellen mit Octylglycoside (OG). Eine definierte Lipid-Micelle Größe wird durch Extrusion mit Membranen von einer definierten Porendurchmesser erreicht. FCP und Lipid-Mizellen sind vereint in einem vordefinierten Lipid: Protein-Verhältnis und die Reinigungsmittel OG und β-DDM sind entfernte über kontrollierte Dialyse FCP Proteoliposomes bilden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>500 ml centrifuge vials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>high speed centrifuge</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill VI 2</td><td>Edmund-B&amp;uuml;hler (edmund-buehler.de)</td><td></td><td>newer version: Vibrogen-Zellm&amp;uuml;hle Vl 6</td></tr><tr><td>Silibeads S 400 &amp;micro;m</td><td>Sigmund-Lindner.com</td><td>5223-7</td><td></td></tr><tr><td>Silibeads S 1,-1,3 mm</td><td>Sigmund-Lindner.com</td><td>4504</td><td></td></tr><tr><td>VitraPOR filter funnel - por1</td><td>ROBU GmbH</td><td>21121</td><td></td></tr><tr><td>polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865</td><td>Beranek Laborger&amp;auml;te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>314348</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Discovery 90SE</td><td>Sorvall</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>rotor T 865</td><td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td><td>51411</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Cell Counter Chamber (improved)</td><td>Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Mikroskop Primostar (7)</td><td>Optik-Pro (optik-pro.de)</td><td>51428</td><td></td></tr><tr><td>optical glass cuvettes (6040-OG)</td><td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td><td>&quot;6040-10-10&quot;</td><td></td></tr><tr><td>V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)</td><td>Jasco (jasco.de)</td><td>V-630</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&amp;beta;-D-Maltopyranoside</td><td>ANATRACE (anatrace.com)</td><td>D310LA</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629</td><td>Beranek Laborger&amp;auml;te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>344061</td><td></td></tr><tr><td>rotor AH629-17-mL</td><td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td><td>54285</td><td></td></tr><tr><td>Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff</td><td>Millipore (merckmillipore.com)</td><td>4307</td><td></td></tr><tr><td>Biometra Minigel-Twin</td><td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td><td>846-010-100</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td><td>1610449</td><td></td></tr><tr><td>libre office spread sheet</td><td>The document foundation</td><td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td><td></td></tr><tr><td>special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)</td><td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td><td>101-10-20</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)</td><td>Jasco (jasco.de)</td><td>FP-6500</td><td></td></tr><tr><td>SDS-loading buffer Roti-Load</td><td>ROTH (carlroth.com)</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>n-octyl &amp;beta;-D-glucopyranoside</td><td>ANATRACE (anatrace.com)</td><td>O311</td><td></td></tr><tr><td>Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1300</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1310</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1230</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>37-0150</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylcholine</td><td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td><td>P3782 SIGMA</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>sonicator bath S-50TH</td><td>Sonicor (getmedonline.com</td><td>SONICOR-S-50TH</td><td></td></tr><tr><td>mini-Extruder</td><td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Nuleopore polycarbonate membrane</td><td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td><td>610005</td><td></td></tr><tr><td>dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff</td><td>ROTH (carlroth.com)</td><td>0653.1</td><td>boil in destilled water before use</td></tr><tr><td>Biobeads SM2 Adsorbent</td><td>Biorad (Bio-rad.com)</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td><td>F4375</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4</td><td>Beranek Laborger&amp;auml;te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>252150</td><td></td></tr><tr><td>rotor TFT 80.4</td><td>Millipore (merckmillipore.com)</td><td>54356</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;material listed in order of appearance &lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.&lt;br /&gt;Standard lab material and substances are not listed.&lt;/em&gt;</td></tr></tbody></table>

isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids

Die photosynthetische Leistungsfähigkeit von Pflanzen, Algen und Diatomeen hängt stark von der schnelle und effiziente Regulierung der leichte Ernte und Energie Transferprozesse in der Thylakoidmembran Membran der Chloroplasten. Das Licht, die Ernte Antenne von Kieselalgen, die so genannte Fucoxanthin Chlorophyll a/c-bindende Proteine (FCP), sind erforderlich für die Lichtabsorption und effiziente Übertragung der photosynthetischen Reaktion Zentren sowie für Foto-Schutz vor übermäßig viel Licht. Der Wechsel zwischen diesen beiden Funktionen ist eine langjährige Frage der Forschung. Viele dieser Studien wurden mit FCP in Waschmittel Micellen durchgeführt. Für Studien zu Wechselwirkungen wurden die Reinigungsmittel entfernt, was dazu führte, eine unspezifische Aggregation der FCP-komplexe. Bei diesem Ansatz ist es schwer, zwischen Artefakten und physiologisch relevanten Daten zu unterscheiden. Daher erhalten wertvoller Informationen zu FCP und andere Membran gebunden leichte Ernte komplexe von Protein-Protein-Wechselwirkungen, Energieübertragung und andere spektroskopischen Eigenschaften zu studieren, wenn sie in ihrer Muttersprache Lipid-Umgebung eingebettet sind. Der Hauptvorteil ist, dass Liposomen haben eine definierte Größe und einem definierten Lipid/Protein-Verhältnis durch die das Ausmaß der FCP-clustering gesteuert wird. Darüber hinaus können Veränderungen in der pH und Ionen-Zusammensetzung, das Licht, die Ernte in Vivo regulieren einfach simuliert werden. Im Vergleich zu der Thylakoidmembran Membran sind die Liposomen homogener und weniger komplex, wodurch es einfacher, spektroskopischen Daten zu erhalten. Das Protokoll beschreibt den Ablauf der FCP-Isolierung und Reinigung, Liposomen Vorbereitung und Einbindung der FCP in Liposomen mit natürlichen lipidzusammensetzung. Ergibt sich aus einer typischen Anwendung sind gegeben und diskutiert.

Das Protokoll beschreibt die Isolierung des gesamten FCP-Fraktion aus Cyclotella Meneghiniana und Einbindung in Liposomen mit native lipidzusammensetzung. Die Thylakoidmembran Isolation ist hoch reproduzierbare, aber die Thylakoidmembran Ausbeute kann sich ändern. Das Ergebnis ist akzeptabel, wenn mehr als 50 % aller Pigmente im Schritt 1.1.4 wiederhergestellt werden. Mehr als 80 % ist optimal.
Die Solubilisierung der ...

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Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Fucoxanthin Chlorophyll a/c-bindende Proteine (FCP) von Kieselalgen zu isolieren und integrieren sie in Liposomen mit natürlichen Lipid Kompositionen Erregung Energieübertragung auf Ionen-Zusammensetzung Änderungen zu studieren.

Isolieren und die Einbeziehung von Licht-ernten Antennen von Diatomee Cyclotella Meneghiniana in Liposomen mit Thylakoidmembran Lipide

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

isolating-incorporating-light-harvesting-antennas-from-diatom

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Biochemistry

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Unit 1

Chloroplasts and Photosynthesis

SCIENTISTS IN ACTION

7.7K Aufrufe.  Goethe University. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Fucoxanthin Chlorophyll a/c-bindende Proteine (FCP) von Kieselalgen zu isolieren und integrieren sie in Liposomen mit natürlichen Lipid Kompositionen Erregung Energieübertragung auf Ionen-Zusammensetzung Änderungen zu studieren.

Serie: Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within the chloroplasts, the thylakoid membrane system houses all the photosynthetic pigments, reaction center complexes, and most of the electron carriers, and is responsible for light-dependent ATP synthesis. Over 90% of chloroplast proteins are encoded in the nucleus, translated in the cytosol, and subsequently imported into the chloroplast. Further protein transport into or across the thylakoid membrane utilizes one of four translocation pathways. Here, we describe a high-yield method for isolation of transport-competent thylakoids from peas (Pisum sativum), along with transport assays through the three energy-dependent cpTat, cpSec1, and cpSRP-mediated pathways. These methods enable experiments relating to thylakoid protein localization, transport energetics, and the mechanisms of protein translocation across biological membranes.

We present protocols herein for high-yield isolation of physiologically active thylakoids and protein transport assays for the chloroplast twin arginine translocation (cpTat), secretory (cpSec1), and signal recognition particle (cpSRP) pathways.

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Isolierung von Cellular Lipid Droplets: Zwei Reinigungstechniken Ausgehend von Hefezellen und menschlichen Plazenten

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Biotechnik

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a large membrane protein complex coordinating hundreds of light harvesting and electron transport factors and is the most efficient light harvesting system found in nature. Photons absorbed by the four LHCA antenna proteins that make up LHCI are transferred through excitonic interaction to the PSI core reaction center and are used to facilitate light-driven charge separation across the thylakoid membrane, providing reducing power and energy for carbon fixation in photoautotrophic organisms. The high quantum efficiency of PSI makes this complex an excellent model to study light-driven energy transfer. In this protocol, plant tissue is mechanically homogenized, and the chloroplasts are separated from the bulk cellular debris by filtration and centrifugation. The isolated chloroplasts are then osmotically lysed, and the thylakoid membranes are recovered via centrifugation and solubilized using the detergent n-dodecyl-beta-maltoside. The solubilized material is loaded onto an anion exchange column to collect most of the chlorophyll-containing complexes. Larger complexes are precipitated from the solution, resuspended in a small volume, and loaded on sucrose gradients to separate the major chlorophyll-containing complexes. The resulting sucrose gradient fractions are characterized to identify the band of interest containing PSI-LHCI. This protocol is highly similar to the protocol used in the crystallization of plant PSI-LHCI with some simplifications and relies on methods developed over the years in the lab of Nathan Nelson.

This protocol describes the isolation of Photosystem I (PSI) - Light Harvesting Complex I (LHCI) from plant tissues. PSI along with PSII is responsible for the conversion of light to chemical energy in oxygenic photoautotrophs and has a quantum efficiency of ~1, making it a target for studying light-driven energy transfer.

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a ...

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient association of pore-forming and auxiliary subunits, lateral diffusion, and clustering with other proteins. However, the relationship between lateral diffusion and function is poorly understood. To approach this problem, we describe how lateral mobility and activity of individual channels in supported lipid membranes can be monitored and correlated using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Membranes are fabricated on an ultrathin hydrogel substrate using the droplet interface bilayer (DIB) technique. Compared to other types of model membranes, these membranes have the advantage of being mechanically robust and suitable for highly sensitive analytical techniques. This protocol measures Ca2+ ion flux through single channels by observing the fluorescence emission of a Ca2+-sensitive dye in close proximity to the membrane. In contrast to classical single-molecule tracking approaches, no fluorescent fusion proteins or labels, which can interfere with lateral movement and function in the membrane, are required. Possible changes in ion flux associated with conformational changes of the protein are only due to protein lateral motion in the membrane. Representative results are shown using the mitochondrial protein translocation channel TOM-CC and the bacterial channel OmpF. In contrast to OmpF, the gating of TOM-CC is very sensitive to molecular confinement and the nature of lateral diffusion. Hence, supported droplet-interface bilayers are a powerful tool to characterize the link between lateral diffusion and the function of ion channels.

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol describes how to use TIRF microscopy to track individual ion channels and determine their activity in supported lipid membranes, thereby defining the interplay between lateral membrane movement and channel function. It describes how to prepare the membranes, record the data, and analyze the results.

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Neurowissenschaften

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

Untersuchen BCL-2 Family Funktion mit großen unilamellaren Vesikeln

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Biologie

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are simplistic cellular mimics composed of an aqueous interior surrounded by a lipid bilayer; they are valuable in designing synthetic cells and understanding the fundamentals of biological cells in an in vitro fashion and are important for applied sciences, such as cargo delivery for therapeutic applications. This article describes a detailed working protocol for an on-chip microfluidic technique, octanol-assisted liposome assembly (OLA), to produce monodispersed, micron-sized, biocompatible liposomes. OLA functions similarly to bubble blowing, where an inner aqueous (IA) phase and a surrounding lipid-carrying 1-octanol phase are pinched off by surfactant-containing outer fluid streams. This readily generates double-emulsion droplets with protruding octanol pockets. As the lipid bilayer assembles at the droplet interface, the pocket spontaneously detaches to give rise to a unilamellar liposome that is ready for further manipulation and experimentation. OLA provides several advantages, such as steady liposome generation (&#62;10 Hz), efficient encapsulation of biomaterials, and monodispersed liposome populations, and requires very small sample volumes (~50 &#181;L), which can be crucial when working with precious biologicals. The study includes details on microfabrication, soft-lithography, and surface passivation, which are needed to establish OLA technology in the lab. A proof-of-principle synthetic biology application is also shown by inducing the formation of biomolecular condensates inside the liposomes via transmembrane proton flux. It is anticipated that this accompanying video protocol will facilitate the readers to establish and troubleshoot OLA in their labs.

The present protocol describes octanol-assisted liposome assembly (OLA), a microfluidic technique to generate biocompatible liposomes. OLA produces monodispersed, micron-sized liposomes with efficient encapsulation, allowing immediate on-chip experimentation. This protocol is anticipated to be particularly suitable for synthetic biology and synthetic cell research.

On-Chip-Oktanol-gestützte Liposomen-Assemblierung für die Biotechnologie

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are ...

Lichtgesteuerte reversible Proteinstrukturierung auf Lipidmembranen

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

Autor im Rampenlicht: Photoschaltbare Proteinrekrutierung für reversible Musterbildung in künstlichen zellulären Systemen

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

Isolieren und die Einbeziehung von Licht-ernten Antennen von Diatomee Cyclotella Meneghiniana in Liposomen mit Thylakoidmembran Lipide

Zusammenfassung

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Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen