Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen bezüglich der Mechanismen und Energetik des Proteintransports über Chloroplastmembranen sowie die Lage von Proteinen in Plastiden zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik für Thylakoid-Protein-Targeting ist, dass es eine vollständige Kontrolle der Umgebung des Thylakoids während des Transports ermöglicht, einschließlich Temperatur, pH, ionische Bedingungen und Vorläuferkonzentrationen. Beginnen Sie mit dem Einweichen von etwa 55 Gramm Erbsen in 400 Milliliter destilliertes Wasser für drei Stunden.
Die durchnässten Erbsen in einer Plastikschale im Boden säen, mit einer dünnen Schicht Vermiculit bedeckt, und wachsen für neun bis 15 Tage, wie im Textprotokoll beschrieben. Am Tag der Chloroplastenisolierung einen kontinuierlichen Dichtegradienten vorbereiten, indem Sie ein Gemisch aus 15 Milliliter Percoll und 15 Milliliter 2xGB Puffer in einem 15 Milliliter Polykarbonat-Hochgeschwindigkeitszentrifugenrohr bei 30, 900 g in einem festwinkeligen Rotor für 30 Minuten bei vier Grad Celsius mit abbremsendem Abstand zentrifugieren. Dann ernten Sie etwa 25 Gramm von neun bis 15 Tage alten Erbsentrieben.
Fügen Sie sie zu 95 Milliliter kalten 1xGB Puffer in einem gekühlten Mixer, mit geschärften Klingen. Und homogenisieren. Filtern Sie diese Mischung durch mindestens zwei Schichten Käsetuch, in einem Trichter über einem gekühlten Becher gelegt.
Zentrifugieren Sie das Filtrat mit einem 15 Milliliter Polycarbonat Zentrifugenrohr in einem schwingenden Schaufelrotor bei 3.000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und verwenden Sie einen Pinsel, um das Pellet vorsichtig in einem Milliliter 1xGB wieder aufzuhängen. Danach verwenden Sie eine GlashaltungPipette, um die Bildschirmaufhängung vorsichtig auf dem Percoll-Gradienten zu schichten.
Zentrifugieren Sie ihn in einem schwingenden Schaufelrotor bei 8 000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius mit abbremsender Bremse. Mit einer Haltungspipette wieder vorsichtig das untere grüne Band mit intakten Chloroplasten in ein frisches 50 Milliliter Polycarbonat-Rohr übertragen und 30 Milliliter 1xIB Puffer hinzufügen. Zentrifugieren Sie das Rohr in einem schwingenden Schaufelrotor bei 1 800 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Nach dem Wegwerfen des Überstandes das Pellet vorsichtig in einem Milliliter 1xIB mit einem Pinsel wieder aufsetzen. 30 Milliliter 1xIB und Zentrifuge unter den gleichen Bedingungen wieder einwaschen. Setzen Sie das Pellet nach der letzten Zentrifugation in einem Milliliter 1xIB wieder aus.
Um die Chlorophyllkonzentration zu bestimmen, mischen Sie 10 Mikroliter vollständig resuspendierter Chloroplasten mit fünf Millilitern 80%Aceton. Filtern Sie ein 180 Mikrometer dickes Filterpapier mit 11 Mikrometer Porengröße und bestimmen Sie dann die Chlorophyllkonzentration per Spektralphotometer. Das Chloroplastengemisch mit kaltem 1xIB auf ein Milligramm pro Milliliter verdünnen.
Um die Thylakoide zu isolieren, wenn stromalextrakt nicht notwendig ist, wie cpTat Transport, Zentrifuge intakte Chloroplasten in 1,5 Milliliter-Rohren in einem schwingenden Schaufelrotor bei 1.000 g bei vier Grad Celsius für sechs Minuten. Danach entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet im hypotonischen Lysepuffer wieder auf, um mit einer Mikropipette ein Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Inkubieren Sie auf Eis im Dunkeln mit gelegentlichem Mischen für 10 Minuten.
Um Thylokoide zu bergen, zentrieren Sie in einem schwingenden Schaufelrotor bei 3, 200 g bei vier Grad Celsius für acht Minuten. Waschen Sie die Thylokoide zweimal, indem Sie das Pellet mit einem bis zwei MilliliterLysepuffer wieder aufhängen und dann unter den gleichen Bedingungen zentrifugieren. Nach der letzten Zentrifugation das Pellet in einem Milliliter 1xIB-Puffer wieder aufsetzen und die Chlorophyllkonzentration in isolierten Thylokoiden mit einem Spektralphotometer bestimmen, wie zuvor gezeigt.
Für Wege, die eine stromale Extraktrückgewinnung erfordern, wie CPSec1 und CPSRP, entsetzen 600 Mikroliter isolierter Chloroplasten in einem schwingenden Schaufelrotor und Zentrifuge bei 1.000 g für sechs Minuten bei vier Grad Celsius. Bei der Chloroplastenlyse setzen wir das Pellet mit 600 Mikroliter hypotonischen Lysepuffer aus. 10 Minuten lang im Dunkeln mit gelegentlichem Mischen auf Eis bebrüten.
Dann zentrieren Sie die Rohre in einem schwingenden Schaufelrotor bei 3, 200 g für acht Minuten bei vier Grad Celsius. Um den Stroma zu speichern, übertragen Sie den hellgrünen auf gelben Überstand auf ein neues Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie ein gleiches Volumen von 2x rohen Stromalpuffer hinzu. Um Thylokoide zu waschen, fügen Sie zwei Volumina Lysepuffer und Zentrifuge bei 3, 200 g für acht Minuten bei vier Grad Celsius hinzu.
Setzen Sie das Pellet in 1xIB wieder auf, um eine Chlorophyllkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter zu erreichen, und legen Sie es für die spätere Verwendung in Transporttests auf Eis beiseite. Restmembranen aus Rohstroma entfernen, indem Sie den verdünnten Rohstroma in einem festen Winkelrotor bei 42 000 g 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrieren. Dann sammeln Sie 95% des Volumens aus jedem Rohr, um sicherzustellen, dass das kleine gelbe grüne Pellet nicht gestört wird, während Sie das Volumen aus jedem Rohr notieren.
Um den konzentrierten Stromalextrakt vorzubereiten, bündeln Sie die gesammelten Überstande. Verwenden Sie dann einen vier Milliliter 30 Kilodalton Molekulargewichts-Cut-off-Konzentrator, um den Extrakt fünffach zu konzentrieren. Um den cpTat-Transport in einer 1,5-Milliliter-Röhre auf Eis zu prüfen, mischen Sie die isolierten Thylokoide zu einer endgültigen Chlorophyllkonzentration von 0,33 Milligramm pro Milliliter, fünf Millimolar ATP in 1xIB und acht Millimolaren DTT in 1xIB.
Um den Transport zu initiieren, führen Sie Substratprotein in den Transportmix ein. Führen Sie die Reaktion durch Beleuchtung der Suspension mit 80 bis 100 Mikroeinsteinen pro Quadratmeter pro Sekunde photosynthetisch aktiver Strahlung für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Um die Transportreaktion zu stoppen, verdünnen Sie die Suspension achtfach mit eiskaltem 1xIB.
Zentrifuge bei 3, 200 g in einer Mikrozentrifuge für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um Thylokoide zurückzugewinnen. Nach dem Wegwerfen des Überstandes das Pellet in 120 Mikrolitereiseis 1xIB wieder aufsetzen. Um die CPSec1- oder PSRP-Wege zu assayen, mischen Sie Folgendes in einer 1,5-Milliliter-Röhre auf Eis.
Thylakoide auf eine endgültige Chlorophyllkonzentration von 0,33 Milligramm pro Milliliter, 0,83 Milligramm pro Milliliter Chlorophylläquivalente stromalen Extrakt und fünf Millimolar ATP in 1xIB hergestellt. Bringen Sie die Reaktion auf das gewünschte Volumen mit eiskaltem 1xIB und inkubieren Sie auf Eis für 10 Minuten. Um den Transport zu initiieren, führen Sie 10% Volumenvolumen von Substratprotein in diesen Transportmix ein.
Beleuchten Sie mit 80 bis 100 Mikroeinsteinen pro Quadratmeter pro Sekunde photosynthetisch aktiver Strahlung 10 Minuten bei Raumtemperatur. Um die Reaktion zu stoppen, verdünnen Sie die Suspension achtfach mit eiskalt 1xIB. Zentrifuge bei 3, 200g in einer Mikrozentrifuge für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Nach dem Wegwerfen des Überstandes das Pellet in 120 Mikrolitereiseis 1xIB wieder aufsetzen. Um Restsubstrat zu entfernen, das nicht transportiert wurde, verdauen Sie externes Protein, indem Sie sechs Mikroliter mit zwei Milligramm pro Milliliter Thermolysin und 10 Millimolar Calciumchlorid in 1xIB hinzufügen. Inkubieren Sie diese Protease-Reaktion auf Eis für 40 Minuten.
Quench die Protease durch Verdoppelung des Volumens mit 25 Millimolar EDTA in 1xIB. Zentrifuge bei 3, 200 g in einer Mikrozentrifuge für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um Thylokoide zurückzugewinnen. Nach dem Entfernen des Überstandes, wiederaufenthalten wiedergewonnene Thylokoide in 120 Mikroliter von fünf milimolaren EDTA in 1xIB, und übertragen sie auf eine neue 1,5 Milliliter-Röhre.
Nach der zentrifugieren den Überstand wieder bei 3, 200 g in einer Mikrozentrifuge für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem entsprechenden Volumen laemmli Probenpuffer, ergänzt mit 10 Millimolar EDTA, wieder auf. Legen Sie die Proben 10 Minuten in ein kochendes Wasserbad. Analysieren Sie die Beispiele nach SDS-Seite.
Der Transport von iOE17-Protein durch den cpTat-Weg führte zu einer Größenverschiebung von zwei bis drei Kilodaltonen zwischen dem eingeführten Substrat und der ausgereiften verarbeiteten Form. Dies ist auf die Spaltung des n-Klemmensignalpeptids zurückzuführen, das auf einen erfolgreichen cpTat-Transport hinweist. Die Thermolysinbehandlung hinterlässt nur das erfolgreich transportierte und damit proteusresistente reife Band.
Der Transport des OE33-Vorläufers durch den CPSec1-Weg führte zu einer Größenverschiebung des ausgereiften Substrats und zum Proteusschutz des transportierten Substrats. Die Einfügung des LHCP-Vorläufers in die Thylokoid-Membran über den cpSRP-Signalweg, der durch Thermolysinverdauung ausgewertet wurde, führte zu einer Größenverschiebung von 1,5 bis zwei Kilodaltonen. Dies deutete auf eine erfolgreiche Membraneinfügung hin, da die Membran das Uncleaved des reifen LHCP-Abbauprodukts vor einer vollständigen Proteolyse schützt.
Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Thylokoide isolieren und die Tranportivität durch die energieabhängigen cpTat-, cpSec 1- und cpSRP-Pfade isolieren können. Einmal gemeistert kann diese Technik in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn richtig durchgeführt. Obwohl in diesem Video nicht dargestellt, halten wir die Oberlichter im Labor in der Regel aus, wenn wir mit photosynthetisch aktiven Chloroplasten und Thylakoiden arbeiten.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, isolierte Chloroplasten und Thylakoide bei vier Grad Celsius zu halten. Denken Sie daran, Chloroplasten am Anfang sanft wieder auszusetzen. Vermeiden Sie es, den Procoll-Gradienten nach dem ersten Zentriumierungsschritt zu stören.
Zusätzlich kann eine prozentuale Eingangsprobe parallel zu den Transportreaktionen vorbereitet werden und auf demselben Gel ausgeführt werden, um den Substrattransport abzuschätzen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit radioaktiven Substraten eine gewissenhafte Handhabung und eine ordnungsgemäße PSA erfordert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Protein-Targeting, um die Energetik, Kinetik und einzigartige Mechanismen für den Proteintransport über Thylakoid-Membranen zu erforschen.
