Dieses Produkt ist optimiert, um Proteine mit dem Fluoreszenzprotein-Tag zu nivellieren und die Position und Expression des Proteins von interessanten Zebrafisch-Laborindividuen zu visualisieren. Es ist besonders nützlich für die Abbildung von Proteinen, die in geringer Häufigkeit exprimiert werden. Unsere Methode vereinfacht und beschleunigt den Prozess der Spenderkonstruktion.
Diese Komponenten, mit Ausnahme des CDS, werden zuvor in das Rückgrat eingebaut. Auch der Spender wurde optimiert, um die Effizienz zu steigern. Der Workflow des Übertragungsbildschirms akkumuliert vererbbaren Kern mit dem geringsten Zeit- und Arbeitsaufwand.
Der Zebrafisch ist der Modellorganismus, der in der Infektions- und Immunitätsforschung weit verbreitet ist. Wir interessieren uns besonders für die Mechanismen, die der Sepsis zugrunde liegen. Da wir jetzt in der Lage sind, Fluoreszenzmarkierungen mit unserem Protokoll einfach durchzuführen, werden wir versuchen, ein Bild, Sepsisproteine und Zellen im Zebrafisch zu markieren.
Setzen Sie zunächst einen gesunden weiblichen Zebrafisch und zwei gesunde männliche Zebrafische in ein Paarungsbecken. Trennen Sie die Männchen von den Weibchen mit einer Trennwand, um sie auf die Paarung vorzubereiten. Bereiten Sie die Mikroinjektionsmischung am Tag der Mikroinjektion auf Eis in einer RNase-freien Umgebung vor.
Laden Sie die Mikroinjektionslösung mit einer Rnase-freien Pipettenspitze in die Nadel. Legen Sie die geladene Nadel in einen Mikromanipulator, der an einem Mikroinjektor befestigt ist. Schneide unter einem Mikroskop mit einer spitzen Pinzette die Spitze der Nadel ab, indem du sie vorsichtig zusammenkneifst, bis sie bricht.
Passen Sie den Injektionsdruck an, bis die Nadel gleichmäßig ein Tröpfchen von einem Nanoliter ausstößt. Entfernen Sie als Nächstes die Trennwand aus dem Begattungsbecken und lassen Sie die Fische sechs Minuten lang brüten. Sammeln Sie die Embryonen im Einzelzellstadium und übertragen Sie sie in eine Petrischale, die Embryopuffer enthält.
Untersuchen Sie die Gesundheit der Embryonen unter einem Lichtmikroskop und entfernen Sie unbefruchtete Eizellen oder Ablagerungen. Legen Sie 20 gesunde Embryonen in einer separaten Petrischalen als nicht injizierte Kontrollen beiseite und beschriften Sie die Schale. Übertragen Sie mit einem kleinen Pinsel gesunde Embryonen im Zellstadium auf die Rillen einer auf Raumtemperatur erwärmten Mikroinjektionsplatte und richten Sie sie vorsichtig aus.
Entfernen Sie überschüssigen Puffer von der Platte. Stellen Sie mit Hilfe einer Nadelspitze die Position jedes Embryos vorsichtig so ein, dass der Tierstab zur Nadel zeigt. Injizieren Sie einen Nanoliter der gemischten Lösung in den Tierpol.
Spülen Sie die Embryonen nach der Injektion vorsichtig in eine 6-Well-Platte mit Embryopuffer. Stellen Sie die Platte in einen 28,5 Grad Celsius heißen Inkubator mit konstanter Temperatur. Untersuchen Sie 10 Stunden nach der Befruchtung die Embryonalentwicklung unter einem Stereomikroskop und entfernen Sie tote Embryonen.
Sammeln Sie 24 Stunden nach der Befruchtung die Embryonen in 1,5-Milliliter-Röhrchen für die Genotypisierung und entsorgen Sie überschüssiges Wasser vorsichtig. Geben Sie 100 Mikroliter Lysepuffer mit Proteinase K in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei 56 Grad Celsius und dann 15 Minuten lang bei 95 Grad Celsius.
Nach der Inkubation 200 Mikroliter Ethanol hinzufügen und gut mischen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei 19.000 g und verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet mit 500 Mikrolitern 70%igem Ethanol resuspendieren. Zentrifugieren Sie erneut und trocknen Sie das Pellet an der Luft, bevor Sie es in 50 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser auflösen.
Verwenden Sie einen Mikroliter des Extrakts, um das Reaktionsgemisch für die PCR vorzubereiten. Führen Sie nach der PCR Agarose-Gele mit zwei Mikrolitern PCR-Produkten durch, um die erfolgreiche Amplifikation zu bestätigen. Führen Sie einen enzymatischen Verdau durch, um die Effizienz der sgRNAs zu bewerten.
Die Aufschlusslösung vorsichtig mischen und bei Raumtemperatur gemäß den Anweisungen des Herstellers inkubieren. Führen Sie Agarosegele für verdaute Produkte zusammen mit unverdauten PCR-Kontrollen durch, um die Verdauung zu bestätigen. Um die sgRNA-Effizienz zu analysieren, öffnen Sie die TIDE-Website und klicken Sie auf TIDE starten.
Geben Sie die Leitsequenz der sgRNA in den Leitsequenzrahmen ein. Klicken Sie auf Durchsuchen, um das Sequenzierungsergebnis des Wildtyp-Steuerelements in das Chromatogrammfeld der Kontrollprobe hochzuladen. Laden Sie auf ähnliche Weise das Sequenzierungsergebnis der bearbeiteten Probe in das Chromatogrammfeld der Testprobe hoch.
Klicken Sie auf Ansicht aktualisieren, um die Ergebnisse zu analysieren. Verwenden Sie zunächst die ligationsunabhängige Klonierung oder LIC mit Exonuklease III, um das Donorplasmid zu konstruieren. Design-Primer F1 mit einer überlappenden Sequenz mit dem Vektorelement 1 und einem Teil von Element 2.
Design-Grundierung R2 mit einem Teil von Element 1, Element 2 und Element 3. Entwerfen Sie den Primer F2 so, dass er die Elemente 3 und 4 und die 5-Prime-Sequenz des CDS nach der sgRNA-Zielstelle enthält. Design-Primer R1 mit den drei Primzahlen der Beschichtungssequenz und einer überlappenden Sequenz mit dem Vektor.
Verwenden Sie Zebrafisch-CDNA als Template und führen Sie die PCR mit den entworfenen Primern durch. Reinigen Sie die PCR-Produkte durch Ethanolfällung. Verdauen Sie den Donorvektor mit Restriktionsenzymen wie pCI und Acc65I und reinigen Sie den verdauten Donorvektor.
Quantifizieren Sie die gereinigten PCR-Fragmente und den verdauten Donorvektor mittels DNA-Gelelektrophorese. Bereiten Sie anschließend die LIC-Mischung mit dem gereinigten Donorvektor vor und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang auf Eis. Fügen Sie einen Mikroliter 0,5 molare EDTA hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
Pipettieren Sie auf und ab, um die Lösung zu mischen. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch fünf Minuten lang bei 60 Grad Celsius. Kühlen Sie die LIC-Produkte auf Eis.
Transformieren Sie dann DH5-Alpha-kompetente Zellen mit LIC-Produkten. Plattieren Sie die transformierten Zellen auf Luria-Bertani-Platten, die das Ampicillin enthalten, und züchten Sie sie 16 Stunden lang. Entnehmen Sie nach der Inkubation einzelne Kolonien aus den LIC-Platten für die enzymatische Aufschlussanalyse und DNA-Sequenzierung.
Extrahieren und reinigen Sie korrekte Spenderplasmide mit einem Aufreinigungskit. Injizieren Sie Zebrafischembryonen mit einer Mikroinjektionsmischung für Gen-Knockin'12 bis 48 Stunden nach der Mikroinjektion beobachten Sie unter einem Stereofluoreszenzmikroskop die Fluoreszenz der Zebrafischlarven. Mit einer etablierten Screening-Methode werden die fluoreszierenden Larven selektiert und getrennt aufgezogen.
Im Alter von einem Monat sammeln Sie von jedem betäubten Zebrafisch ein kleines Stück der Kotschelflosse in ein beschriftetes PCR-Röhrchen. Legen Sie den entsprechenden anästhesierten Zebrafisch in eine 6-Well-Platte, die mit UV-sterilisiertem, gefiltertem Wasser gefüllt ist, passend zum Etikett auf dem Röhrchen. Extrahieren Sie genomische DNA mit der alkalischen Lysemethode.
Entwerfen Sie einen Vorwärtsprimer stromaufwärts des linken Homologiearms und einen Rückwärtsprimer auf dem Einsatz. Führen Sie eine PCR durch, die auf die fünf Primverbindungen der Sequenz abzielt. Untersuchen Sie die F1-Embryonen, die durch Verpaarung des gescreenten F-Zebrafisches mit Wildtyp-Zebrafischen gewonnen wurden, auf GFP-Expressionsmuster.
Genotypisierung der F1-Embryonen mittels Junction-PCR. Vererbbare spezifische Fluoreszenz wurde in den Muskeln aller F1-Nachkommen beobachtet, was auf die erfolgreiche GFP-Markierung von Connexon 39.9 hinweist. In der Linse aller F2-Nachkommen wurde eine vererbbare spezifische Fluoreszenz nachgewiesen, was auf ein erfolgreiches mCherry-Tagging von connexon 44.1 hindeutet.
Das korrekte Klopfen der Konnexons 39.9 und 44.1 wurde durch Verbindungspolymerase-Kettenreaktionen verifiziert.
