Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschusses DP2OD008470 unterstützt.

Die Verfahren für die Arbeit mit in diesem Protokoll beschriebenen Zebrafischembryonen wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der University of Notre Dame genehmigt. 1. Ringer-Lösung Vorbereitung <ol><li> Stellen eine Lösung von 116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 3,6 mM CaCl 2 und 5 mM Hepes mit ultrareinem H 2 O unter ständigem Rühren durch jede Salzfällung vermeiden. </li><li> Nach der Zugabe von Salzen und, während die Lösung immer noch unter Rühren, Zugabe von 100 Einheiten / Penicillin pro ml und 100 ug Streptomycin pro ml. </li><li> Nachdem Sie alle Antibiotika und Salze, führen Sterilfiltration der Lösung und Store in der sterilen Behälter. Anmerkung: N-Phenylthioharnstoff (1-Phenyl-2-thioharnstoff) oder PTU kann Ringer-Lösung hinzugefügt, um die Bildung des Pigments in Perlen implantierten Embryos ohne negative Folgen für die Embryonengesundheits blockieren. Um Ringer / Pigmentierung Blockierlösung herzustellen, verwenden Sie eine Konzentration von 0,003% PTU. Aufgrund der geringen Konzentration von PTU zuzugebenden ist es ratsam, dass eine größere Menge Ringerlösung hergestellt werden, mindestens 1 L, Hinzufügen winzigen Mengen von PTU Pulver zu vermeiden. Hinzuzufügen PTU während Schritt 1.2, während die Lösung gerührt. </li></ol> 2. Tricaine Herstellung der Lösung <ol><li> 2 g Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonatsalz (Tricaine) pro Liter Lösung plus 0,1 M Tris, aus einer 1 M Stammlösung ausgeglichen auf einen pH von 9,5 und mit ultrareinem H 2 O hergestellt Hinweis: Tricaine wird verwendet, um die Zebrafischembryonen am gewünschten Zeitpunkt einschläfern zu Wulst Implantation Phänotypen zu untersuchen sein. </li></ol> 3. E3 Herstellung der Lösung <ol><li> Stellen eine Lösung von 0,25 M NaCl, 10 mM KCl, 12,5 mM CaCl 2 und 16,6 mM MgSO 4-1 L von Reinstwasser auf 1 Liter des E3 erstellen. </li><li> Fügen Sie 200 ul Methylenblau in die E3-Lösung, um das Pilzwachstum zu hemmen. </li></ol>4. Ziehen Nadeln für Microbead Überweisung <ol><li> Feuer poliert Borosilikatglas mit Filament bei einer OD: 1,0 mm, ID: 0,5 mm, bei einer Länge von 10 cm. </li><li> Zeigen Borosilikatglas Glas in eine Mikropipette Abzieher zu feinen Nadeln vorzubereiten. Hinweis: Die folgenden vier Dimensionen können als Ausgangspunkt verwendet werden, um die Nadeln zu ziehen: Wärme = 540, Ziehen = 245, Velocity = 200, und Time = 125. </li><li> Nach dem Ziehen eine ausreichende Anzahl von Nadeln, lagern in abgedeckten Petrischalen aus Kunststoff, auf Streifen aus Knetmasse oder Klebeband brechen die Nadelspitze zu verhindern, positioniert ist, bis zur Verwendung. </li><li> Um die Nadelspitze auf die gewünschte Bohrung schneiden, verwenden Sie einen feinen Pinzette, um das Ende der Nadel punkten. Hinweis: Needle Bohrung wird in Abhängigkeit von der Mikroperlengröße ausgenutzt sowie Benutzer Handhabung Vorlieben variieren. Ein guter Ausgangspunkt ist es, Handwerk Bohrungsgrößen in einem Bereich zwischen 100 und 200 &amp; mgr; m, wenn Mikrokügelchen im Bereich von 50-100 um wird, verwendet werden. </li><li> Prior zu verwenden, legen Sie die Nadel in die getrimmten Kapillarrohrhalter, um den fertigen Mikrokügelchen Transferinstrument Mode. </li></ol> 5. Whisker / Lash Werkzeugvorbereitung <ol><li> Besorgen Sie sich einen Whisker, peitschen, oder andere kleine, aber feste Stück natürliches oder synthetisches Haar Filament. Schneiden der Nähe der Basis des Filaments in einem 45 ° -Winkel. Halten Sie die Whisker zu einem P-1000 Mikropipettenspitze unter Verwendung von Permanent klare Klebstoff Leim. </li></ol> 6. Microbead Implantation Tray Vorbereitung <ol><li> Mix 2 g Agarose mit 100 ml E3 Lösung, um eine 2% E3 Agarosegel machen. </li><li> Erhitzen Sie die 2% igen Lösung für 1 min und 30 s in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben, Schwenken des Kolbens alle 30 Sekunden, um das Gel aus sprudelnden zu vermeiden. </li><li> Nehmen Sie den Deckel eines 60 mm x 15 mm Petrischale und legen Sie sie in einem größeren 150 mm x 15 mm-Schale mit dem Inneren nach oben zeigt. </li><li> Gießen Sie die heiße Agarose-Gel in die 150 mm x 15 mm Petrischale, achten Sie darauf, verankern sichder Deckel des kleineren Schale mit dem Zeigefinger. Hinweis: Lassen Sie eine dünne Schicht von Agarose unter dem Deckel der kleineren Schale, um Kondensation, die beim Gießen des Gels wird zu entfernen; das macht die Perlen leichter unter einer Dissektionsmikroskop sehen. </li><li> Da die Agarose kühlt, aber bevor es erstarrt, legen Sie ein gut Form auf dem Gel. Dies wird zur leichteren Plazierung der Embryonen ermöglicht. </li><li> Hinweis: Um Blasen in den Vertiefungen zu vermeiden, legen Sie die Form langsam in einem Winkel bis er oben auf dem Gel schwimmt. </li><li> Unter Verwendung eines Mikros, entfernen Sie vorsichtig die Form gut, sobald das Gel erstarrt ist. In E3-Lösung und bei 4 ° C. </li></ol> 7. Embryonen <ol><li> Bereiten Paarungskammern durch Trennwände getrennt sind, indem sie mit System Wasser, und dann platzieren erwachsenen Zebrafisch männlichen (n) und Frau (en) Paare in den Kammern O / N. </li><li> Sammeln befruchtete Eier mit einem feinen Drahtgeflecht Sieb (embryonalen Stadien wird leicht variieren). </li><li> Abzuscheiden die befruchteten Eier in einem sauberen, mit 10 cm Durchmesser Petrischale durch Drehen des Siebes auf den Kopf und Spülen mit einem feinen Strahl von E3 bis keine Eier im Sieb gelassen, und etwa 25 ml Lösung E3 in die Schüssel. </li><li> Nach dem Sammeln, teilen Sie die Eier in mehrere Gerichte (etwa 50-60 Eier pro Schale), um Überbelegung, die Entwicklungs Asynchronität innerhalb der Kupplung führen können und machen das Sammeln gewünschten Zeitpunkten schwer zu vermeiden. </li><li> Embryonen in E3 Lösung Inkubation bei 28,5 ° C, um Entwicklungs Beurteilung nach dem Standard Zebrafisch-Staging-Serie 40 zu ermöglichen. Hinweis: Die Embryonen zu E3 / PTU bei 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) übertragen, um Pigment Entwicklung zu verhindern, wenn Manipulationen bei älteren Stadien erfordern optische Klarheit werden. </li></ol> 8. Bead Implantation <ol><li> Der Mikrokügelchen in gewünschten Testmolekül-Konzentration oder das entsprechende Fahrzeug s inkubierenolution für die erforderliche Zeit in einem geeigneten Volumen. Hinweis: Der Forscher kann sterile Petrischalen im Bereich von 3 bis 6 cm im Durchmesser, oder Multi-Well-Platten, von denen beide Visualisierung der Mikrokügelchen in der Lösung aktivieren. Zeit kann in Abhängigkeit von der Art und der Menge des interessierenden Molekül variieren und sollte der Forscher an den Hersteller oder veröffentlichten Empfehlungen zur Dauer der Inkubation und andere Aspekte beziehen, wie beispielsweise Empfindlichkeit gegenüber Licht und Temperatur. </li><li> Sobald die Embryonen das gewünschte Entwicklungszeitpunkt erreicht, entfernen Sie die Embryonen aus ihrem Chorion mit feinen Pinzette. </li><li> Inkubiere die Embryonen in dem gefilterten Ringerlösung mit Antibiotika für 10 Minuten, um sie zu der Lösung akklimatisieren. </li><li> Während die Embryonen akklimatisieren, übertragen Sie die Mikrokugeln in die Mikrokügelchen Platte innerhalb der Implantation Wanne eingebettet und spülen Sie sie in Ringer-Lösung für 10 min. Hinweis: Implantieren Sie die Perlen innerhalb von 50 min nach dem Erreichen dieses Punktes. Dies wdie Wahrscheinlichkeit, daß man einen Wulst mit einer kleineren Konzentration des Moleküls von Interesse zu implantieren schlecht verringern. </li><li> Array die Embryonen in die Vertiefungen der Mikrokügelchen Implantation Tablett, kümmert sich um sie so zu orientieren den Bereich von Interesse, wo der Mikrokügelchen wird implantiert werden zugänglich ist. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt an der Embryo mit der Wolfram-Nadel. </li><li> Übertragen einer Mikroperle auf den Embryo mit der Mikrokapillare Transferpipette: Niederdrücken der Kolben der Pipette vorsichtig die Mikrokügelchen in die Kapillarsäule, und lassen Sie den Druck auf die Mikrokügelchen auf das gewünschte Ziel zu übertragen. </li><li> Verwenden Sie die Whisker / Wimpern Werkzeug, um die Mikrokügelchen innerhalb des Embryos zu positionieren. Hinweis: Achten Sie darauf, um die Mikrokügelchen in das Gewebe entfernt von der Stelle der Schnitt zu positionieren, so dass die Mikrokügelchen nicht aus dem Embryo ausgewiesen werden, wie es heilt. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Im Laufe des letzten Jahrhunderts hat sich das Verständnis von Körper Plan Strukturierung und Organogenese monumentale Fortschritte durchgemacht. Gewebemanipulationstechniken waren entscheidend bei der Aufdeckung wichtige Informationen über diese lebenswichtige Prozesse. Genetische Modifikation ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Ermittlung der Genfunktion und Verfahren zur Mosaikanalyse, wie Zelltransplantation nützliche Ansätze Autonomie der Genfunktion zu verstehen. Microbead Implantation bietet eine weitere Ort, um abzufragen, wie bestimmte Moleküle verändern Entwicklungsdynamik, da diese Methode ermöglicht es dem Forscher, um eine lokale Gewebeumgebung durch die Einführung von Signalmolekülen oder Inhibitoren verändern. Eine Reihe von unterschiedlichen Mikrokügelchen sind im Handel erhältlich, die unterschiedliche Größen und andere physikalische Eigenschaften haben, bestehen (zB Ladung), so daß sie für den experimentellen Bedingungen von Interesse verwendet werden. Somit kann durch Implantieren Mikrokugeln in einem Protein oder chemisch getränktencal von Interesse innerhalb eines Organismus können die Forscher lokalisierte Effekte während der Entwicklung zu untersuchen und Zusammenhänge zwischen dem Gen oder Molekül von Interesse und bestimmten biologischen Phänotyp (n). Studien wie die von Wada geführt und Kollegen verwendeten Mikrokügelchen Implantation, um die Wirkung einer erhöhten Hedgehog-Signalisierung im Skelett Strukturierung im vorderen neurocranium (ANC) in Zebrafisch-23 zu beurteilen. Frühere Studien haben gezeigt, dass Shh für ANC Formation 14 erforderlich. Verwendung Shh beschichteten Mikrokügelchen Forscher festgestellt, dass dieses Signal fördert Knorpelbildung in der ANC. Die Mikrokügelchen-Implantationsprozess wurde verwendet, um eine klare Verbindung zwischen Hedgehog-Signalisierung und Knorpelbildung in der ANC zu demonstrieren. Ein weiteres wichtiges Beispiel für diese Gewebemanipulationstechnik in Zebrafisch wird in Studien beobachtet, wo Wissenschaftler untersuchten die Transkriptionskontrolle des Erythroblastoma Twenty-Six (ETS) Domain-fSchauspieler ETS-verwandtes Molekül (ERM) und Polyoma-Enhancer Aktivator 3 (Pea3) von FGF-Signal während der frühen Zebrafischgehirnentwicklung 19. Durch Mikrokügelchen Implantationsexperimenten konnten sie zeigen, dass Fgf8 und FGF3 können ektopisch Ausdruck erm und PEA3 aktivieren. Diese Beispiele zeigen die Nützlichkeit der Mikrokügelchen, um Einblicke in die Entwicklungsmechanismen, die bei der Gewebebildung zusammenarbeiten, die gut charakterisiert sein kann durch die Verwendung von Methoden, die Genexpression 41 bewerten. Somit können Mikrokügelchen Transplantation eine praktikable Methode, um in anderen Geweben, wie beispielsweise die Zwischen Mesoderm (IM), die zu der Niere verursacht erforschen. Insbesondere wäre es in Nierenentwicklungsstudien zu unterstützen, zu untersuchen, wie verschiedene Moleküle beeinflussen nephron Segmentierung 42 und Tubulogenese 43,44, Prozesse, die nur oberflächlich zur Zeit verstanden. Außerdem Mikrokügelchen Implantation begonnen hat, verwendet werden, um Gestüt werdeny Regenerationsprozesse im Zebrafisch 29] und konnte für die Verwendung mit einer beliebigen Anzahl von Organregeneration Modelle wie folgt Laserablation embryonaler Gewebe wie Nephron 45 oder in Verbindung mit Verfahren, die formuliert wurden, um die Forschung mit den entsprechenden Strukturen auch Erwachsenen angepasst werden 46-49. Schließlich weist Mikrobead Implantation das Potential, in Modellen der menschlichen Krankheit, wie Krebs oder Gewebedegeneration 50,51 52,53 verwendet werden. Im vorliegenden Protokoll zeigen wir die Methode der Mikrokügelchen Implantation in Zebrafischembryonen, die wurde auch in ähnlicher Weise von anderen Forschern beschrieben, aber nicht durch Video-Protokolle 1 gezeigt. Mit minimalen Praxis konnten wir Mikrokügelchen mit einer ungefähren Geschwindigkeit von 8-10 Embryonen / h, die die Machbarkeit dieses Verfahrens betrifft, sobald der Forscher hat einige Erfahrung zu implantieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die hier gezeigten Perlen verschiedener dbmessungen kann in einem frühen Stadium eingepflanzt werden kann und daß mit Sorgfalt kann diese Gewebemanipulationstechnik mit minimalen physikalischen Störung des Embryos eingeführt werden. Eine Verbesserung, die hervorgehoben werden sollten, ist die Verwendung eines Whisker / Wimpern Werkzeug, um die Mikrokügelchen in den Embryo zu positionieren. Diese relativ preiswerten und einfachen Gerät etwa dem gleichen Durchmesser wie die Mikrokügelchen, leicht zu erhalten und hilft Beschleunigung des Implantationsprozesses. Die Whisker / Peitsche auf eine gewünschte Länge geschnitten werden, um eine feste produzieren aber feinen Wulst-Handhabungswerkzeug, je nach Forscher Geschicklichkeit und Vorlieben. Schließlich, während wir hier, wie Sie physisch zu manipulieren Mikroperlen und Zebrafischembryonen der Implantation durchführen beschrieben, dieses Protokoll nicht skizzieren bestimmte Handhabungsverfahren für verschiedene Medikamente oder Peptide. Im allgemeinen sollte chemisch behandelten Mikrokügelchen in das Tier mit Zweckmäßigkeit implantiert werden, zu unerwünschten Effekten in anderen Bereichen des Organismus zu vermeiden, und Forscher sollte gut sein,über die möglichen Sicherheitsbedenken mit solchen Chemikalien vor Beginn ihres Studiums verbunden sind gebildet. Zusammengefasst haben wir eine relativ einfache und effiziente Mikrokügelchen Implantationsverfahren mit einer Vielzahl von Anwendungen unter Verwendung von Materialien, die im Labor leicht verfügbar sind gezeigt. Letztendlich hoffen wir, dass dieses Handbuch werden die Forscher mit dem zarten Wesen der Zebrafisch Gewebemanipulation unterstützen.

Entwicklungsbiologie Forscher nutzen eine Vielzahl von zellularen, molekularen und genetischen Methoden, um die Mechanismen, wie ein Organismus gebildet Kontrolle aufzudecken. Unter diesen Ansätzen ist Gewebemanipulation ein wichtiges Instrument bei der Entschlüsselung komplexer Fragen über das Schicksal der Zelle, Zellbewegung und der Organisation der Gewebe. Ein Weg, um eine lokale Gewebeumgebungen verändert ist durch die chirurgische Anwendung von Mikroperlen, die verwendet werden, um eine fokale Quelle von Proteinen oder anderen Signalmolekülen 1 zu liefern. Diese Art der experimentelle Manipulation wurde in großem Stil in die klassische Wirbel Embryologie Modelle, wie der Frosch und Küken 2 implementiert. Der Zebrafisch ist zu einem wichtigen Wirbelmodellorganismus für das Studium der Organentwicklung und bietet auch viele einzigartige Vorteile für Krankheit Modellierung 3-5, da sie hohe genetische Erhaltung mit 6 Menschen zu teilen. Insbesondere ist die optische Transparenz und exinterne Entwicklung des Zebrafischembryo bietet eine unvergleichliche Sicht für die Beobachtung von Gewebe Ontogenese 3-5. Die Umsetzung des groß angelegten vorn genetischen Screens hat eine leistungsstarke Sammlung von Zebrafisch-Mutanten-Stämme für die weitere Untersuchung 7,8, und die Identifizierung von alternative Screening-Verfahren, die effizient in verkleinertem Maßstab in einzelnen Laboratorien durchgeführt werden können 9,10 erzeugt. Weitere experimentelle Arbeit mit Zebrafisch hat durch Fortschritte in transgenen Methoden erleichtert und Reverse genetische Ansätze 11,12, sowie chemische Genetik 13-15. Gewebemanipulationstechniken, wie die Umsetzung von Mikroperlen, wurden nicht wie in dem Zebrafisch weithin verwendet, aber dennoch ein nützliches Mittel, um die Zellsignalisierung während der Entwicklung weiter zu verstehen. Microbead Implantation verwendet wurde, um die Prozesse der Organbildung im Zebrafisch Retina abzufragen16,17, 18 Herz, Gehirn 19-22, Neuralleiste 23 und fin 24,25. In diesen und anderen Untersuchungen wurde Kügelchen während der Entwicklung aufgebracht wurde, um die Diffusion von Signalmolekülen 26, wie Gradienten beeinflussen Zellmigration 27 und axiale Strukturierung 28 zu verstehen. In jüngerer Zeit wurden Mikrokügelchen verwendet werden, um Regenerationsmechanismen im Zebrafisch Erwachsenen 29 auszuwerten. In Entwicklungsstudien, zum Beispiel Zebrafisch-Mikrokügelchen Arbeit Einblicke in die Mechanismen der Bildung Extremität durch Studien der Brustflosse 25 zur Verfügung gestellt. Der Zebrafisch Brustflosse Knospe ist homolog zu den Vordergliedmaße Knospe in der Maus 30 und 31 Küken. Die wirbelGliedmaßenKnospe hat zwei wesentliche Signalknoten: die Zone polarisierender Aktivität (ZPA), die den vorderen zu hinteren Achse durch den Ausdruck der Sonic hedgehog etabliert (Shh) und nachgelagerten Hox Gen-Targets,und der apikalen ektodermalen Leiste (VRE) an der Spitze der Extremitätenknospe, die proximal zum distalen Identität des Gliedes durch Expression von Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs) herzustellen Akten präsentieren. Durch die Implantation Fgf getränkt Mikrobeads in Zebrabärbling Shh genetische Mutanten Ermittler identifiziert Fgf als wesentlich für das Fortschreiten des Zellzyklus und das Wachstum des Vertebraten Schenkel 25. Neben dem FGF und Shh-Signalkaskaden, die Positionsfeststellung der Identität, bahnbrechenden Studien mit dem Küken Gliedmaßenknospe identifiziert Retinsäure (RA) als ein Molekül, das die Wirkung des Polarisationsbereich imitieren könnten anterior nach posterior 32 Identität zu etablieren. Diese Experimente beteiligt Platzierung kleine Streifen von RA-getränkte Whatman-Papier in die Küken Extremität zu stelligen Strukturierung 32 zu bewerten. Ferner haben die Forscher weitere Studien mit elegant die Verwendung von Mikrokügelchen durchgeführt, Zelltransplantation und exogeneRA-Behandlungen in Zebrafisch, um festzustellen, dass RA wirkt, um Positionsfern Cues innerhalb des Zebrafisch-Hinterhirn und Mesoderm 28 bereitzustellen. Gegenwärtig ist jedoch bleiben viele Fragen über die Rolle von Signalfaktoren wie FGF und RA während zahlreiche Aspekte der Wirbeltierentwicklung. Die Signalisierungs Wirkungen von RA als Morphogen wirkende Einflüsse auf viele Organe 33, wie beispielsweise die Entwicklung von Herz 34 und den Nieren Vorläufern, wobei RA spezifiziert proximalen Nierenzellen vom Typ Schicksal 35-39. Weitere Verständnis solcher Themen wesentlich von experimentellen Studien mit Gewebemanipulation und Mikrokügelchen Implantationstechniken profitieren. Während weniger Studien wurden mit Mikrokügelchen Implantation im Zebrafisch, verglichen mit Modellen wie das Küken durchgeführt wurden, sind diejenigen, die durchgeführt wurden sehr informativ. Ein Grund für den Mangel an Mikrokügelchen Implantation der Basis-Forschung im Zebrafischembryo ist likely die Vorstellung, daß es schwierige technische Herausforderungen auf der Grundlage der Größe des Embryos, die ein Hindernis für die erfolgreiche Durchführung solcher Manipulationen darstellen. Allerdings können Mikrokügelchen Implantation in Zebrafischembryonen mit der Praxis erlernt werden und durch visuelle Beobachtung der Technik unterstützt wird, und kann daher als ein Mittel, um die Mechanismen der Entwicklung verhören verfolgt werden. Hier zeigen wir die präzisen Anwendung eines Mikrokügelchens in den Zebrafischembryos, die für die Durchführung einer Vielzahl von Tests an der Gewebebildung und Zell Morphogenese genutzt werden kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricane)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Mo. P097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FB-500-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint-Gobain Chemware Microspatula</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21-401-50B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Micropipette tips</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>2707402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11 690 516DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethly Sulfoxide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads (45-106 &#181;m)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>140-1454 AG1-X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads (45 &#181;m)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>7314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezer</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Needle</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-6065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tube holder</td>
			<td>Globe Scientific Inc.&#160;</td>
			<td>51674</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbead implantation in the zebrafish embryo

Der Zebrafisch wurde als wertvolle genetische Modellsystem für die Untersuchung der Entwicklungsbiologie und Krankheit entstanden. Zebrabärbling teilen einen hohen Grad an genomischer Erhaltung sowie Ähnlichkeiten in zellulären, molekularen und physiologischen Prozessen, mit anderen Wirbeltieren einschließlich des Menschen. Während der frühen Ontogenese sind Zebrafischembryonen optisch transparent, so dass die Forscher die Dynamik der Organogenese mit einem einfachen Stereomikroskop sichtbar zu machen. Microbead Implantation ist eine Methode, die Gewebemanipulation durch die Veränderung der Faktoren in lokalen Umgebungen ermöglicht. Dies ermöglicht es den Forschern, die Auswirkungen von einer beliebigen Anzahl von Signalmolekülen von Interesse, wie zum Beispiel sezerniert Peptide, in bestimmten räumlichen und zeitlichen Punkte innerhalb des sich entwickelnden Embryos zu testen. Hier haben wir ausführlich ein Protokoll für die, wie man während der frühen Zebrafischentwicklung manipulieren und Implantat-Perlen.

Verschiedene Arten von Bearbeitungswerkzeuge eignen sich zur Handhabung von Mikrokügelchen während der Forschungsanwendungen (Abbildung 1). Darüber hinaus kann eine einfache Agarose-Form mit kleinen Brunnen genutzt werden, um die Zebrafischembryo, die lebenswichtig, diese Experimente in einem rechtzeitig und effizient (Abbildung 1) durchzuführen ist, zu halten. Die Implantation einer Mikroperle kann die räumliche und zeitliche Position der Bühne von Interesse, dass die Forscher ein bestimmtes Fenster der Aktion für das Molekül von Interesse eingrenzen können durchgeführt werden. Hier wurden einzelne Mikrokügelchen in Zebrafischembryonen im Schwanzknospenstadium oder zu späteren Zeitpunkten während Somitogenese Stufen (Abbildung 3) implantiert. Zwei unterschiedliche Größe Microbeads mit Ringer-Lösung allein gespült wurden in diesem Protokoll Demonstration (3A, 3B und 3C) eingesetzt. Diese Mikrokügelchen Implantation in Abwesenheit eines konjugiertenkleinen Molekülen zeigt, dass Perle Implantation kann ohne grobe morphologische Effekte während die richtige Entwicklung des Zebrafischembryo (Abbildung 4) erzielt werden. Der Experimentator kann Schwierigkeiten mit dem Manövrieren des Mikrokügelchen in das Einstichloch durch eine Wolfram-Nadel oben auf den Embryo gemacht begegnen. Um eine bessere Handhabung der Mikroperle einmal auf den Embryo durch die Mikronadel platziert zu erreichen, kann ein Haar / Wimpern Werkzeug verwendet werden. Dies kann mit natürlich vergossen felinen oder caninen Whisker in Handarbeit gemacht werden, obwohl auch andere natürliche oder synthetische Peitsche Filamente können verwendet werden (Abbildung 1). Ein sanfter Druck auf den Mikrokügelchen entweder mit dem Wolfram-Nadel oder der Whisker-Tool sollte sehen, die Mikrokügelchen in der Ringerlösung der Form sinken. Sobald die Mikrokügelchen in die Form versenkt es sollte große Abstände gegebenenfalls verschoben mit der Wolframnadel und einmal oberhalb des Embryos die Nadel oder Whisker Werkzeug zu positio verwendet werdenn die Mikrokügelchen in den Embryo. Der Erfolg des Mikrokügelchens Implantation kann unmittelbar durch Visualisierung auf einem Stereomikroskop gemessen werden, da die Sicke wird stabil in dem Gewebe positioniert bleiben. Zu Wulst Position im Laufe der Zeit zu bewerten, kann jede Embryo Probe durch Live-Zeitverlauf Fotografie abgebildet oder überprüft in regelmäßigen Abständen (wie in Abbildung 4 dargestellt), um sicherzustellen, dass der Wulst Lage hat sich nicht über die Dauer des Experiments durch körpereigenes Gewebe verschoben werden Morphogenese. Verständnis der Position der Wulst über die Zeit ist für die meisten informiert Interpretation der Ergebnisse, wie die Bewertung der Wirkung eines kleinen Moleküls an ein Zielgewebe oder Entwicklungsprozesses. Die Verwendung dieser oben genannten Schritte wird eine ideale Umgebung für die Mikrokügelchen in den Zebrafischembryos zu einem gewünschten Zeitpunkt und Stellung einzubetten. Nach unserer Erfahrung Anfänger dieser Mikrokügelchen Implantation Protokoll typischerweise gewann die Fähigkeit newendig, um konsistente chirurgischen Implantation von Mikroperlen in das Zebrafischembryo nach ca. einer Woche der Praxis durchzuführen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> Abbildung 1. Werkzeuge verwendet werden, um Mikrokügelchen Implantation durchzuführen. (A) Die Wulst Implantation Fach (links, 15 cm Durchmesser) mit Embryo Formen (links) und eine Mikroperle Inkubationswanne (rechts, 6 cm Durchmesser). Diese Arbeitsschale ermöglicht die Forscher, um die Embryonen in die gewünschte Ausrichtung für Mikrokügelchen Implantation zu stellen und die vorbereiteten Mikroperlen zur Implantation in unmittelbarer Nähe an der Mikroskopstation haben. Mikrokugeln sollten in kleinen Molekül (en) und / oder Fahrzeug inkubiert werden und dann, bevor sie in die Wulst Implantation Fach, das unter dem Mikroskop Station positioniert ist in einem separaten Mikrokügelchen Platte (rechts) gespült. (B) Zwei Paare von feinen Pinzette wird verwendet, um die chori entfernenauf um jede Zebrafischembryo und auch, um das Ende der Mikrokapillare Nadel abbrechen. (C) Ein Wolfram-Nadel verwendet werden, um eine sehr feine Punktion in dem Zebrafischembryo, in dem die Mikrokügelchen positioniert werden. (D) Die Mikrokapillare Transferpipette wird verwendet, zu erlernen und zu positionieren, ein Mikrokügelchen auf der Oberseite des Zebrafischembryo in der Nähe der Stelle der Punktion werden. (E) Die Whisker / Wimpern Tool wird die schonende Positionierung der Mikrokügelchen in die Einschnittstelle innerhalb des Embryos, die zuvor von der Wolfram-Nadel gemacht wurde zu ermöglichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Mikrokügelchen Implantationsverfahren. (A) Ein Mikrokügelchen Implantation Tablett mit Mikroperlen soaking in der gewünschten Waschlösung wird unter einem Stereomikroskop Station gesetzt, und die Embryonen mit Gewebe nach oben positioniert. (B) Unter Verwendung einer Wolframnadel kann eine kleine Inzision in den Embryo mit einem leichten doch kraft Bewegung möglich. (C) Unter Verwendung einer Mikrokapillare Transferpipette kann die gewünschte Mikrokügelchen aus dem Mikrokügelchen Inkubationskammer in der Schale, auf der rechten Seite ausgewählt werden, und auf der linken Kammer, wo der Embryo Arbeitsbereich befindet gebracht. Die Mikrokügelchen sollten in der Nähe der Stelle des Einschnitts hinterlegt, dann vorsichtig in die Einschnittstelle durch die Wolfram Nadel mit der Whisker / Wimpern Werkzeug gemacht positioniert. Sobald ein Mikrokügelchen in die Einschnittstelle manövriert, sollte es in das Gewebe (weg vom Einschnitt) gesteckt, um die Mikrokügelchen stabil positionieren und anschließender Bewegung aus dem Embryo als Entwicklung geht weiter zu verhindern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>mieten klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> Abbildung 3. Mikroperlen können in Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien implantiert werden. (A) Zebrafischembryos wurden mit einem Mikrokügelchen (Durchmesser von ca. 50 um) in den Kofferraum an der Schwanzknospenstadium implantiert. Wenn an der 24 h nach der Sicke Implantat (HPBI) untersucht, hatten die Embryonen normal entwickelt und die Mikrokügelchen zeigten minimale Bewegung während des Durchgangs der Entwicklungszeit. (B) Zebrabärblingembryonen implantiert mit Mikrokügelchen (mit einem Durchmesser von etwa 50 um) in den Dottersack an der 3 Somitenstufe (ss) angezeigt normalen Entwicklung mit relativ geringfügigen Wulst Bewegung über die Zeit. (C) größer Mikroperlen (Durchmesser von ca. 70 &amp; mgr; m) wurden in den 7 ss Embryos implantiert ähnlich zeigten normale spätere Entwicklung sowie minimal, wenn eine Bewegung von der Implantationsstelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> Abbildung 4. Gross Entwicklung des Zebrafischembryo ist ungestörten durch die Anwesenheit eines Mikrokügelchen durch 72 HPBI. Zebrabärblingembryonen wurden mit Mikroperlen in Ringer-Lösung eingetaucht (mit einem Durchmesser von etwa 50 &amp; mgr; m) an der 7-Somitenstufe (ss) implantiert. Jeder Mikrokügelchen wurde chirurgisch in den Kofferraum zwischen den Somiten 3 und 4 eingesetzt ist, die Anwesenheit der Raupe wurde nicht mit offenen Entwicklungsstörungen bei 24 Stunden nach der Wulst-Implantat (HPBI), 48 HPBI oder 72 HPBI verbunden sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Figur.</a>

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantation im Zebrafischembryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.1K Aufrufe.  University of Notre Dame. The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Serie: Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Embryo Mikroinjektions und Elektroporation in der bei Chor<em&gt; Schlauchseescheide</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Verwendung von Immunolabeling, stabilen, dynamischen und im Entstehen begriffene Mikrotubuli in Zebrafish Embryos zu analysieren

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

Wirksamkeit der Luft Stripping in zwei Lachsfische Fisch Regenbogenforelle (Oncorhynchus Mykiss) und Bachforelle (Salmo Trutta Morpha Fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Folgenden endokardialen Gewebe Bewegungen über Zelle Ladungszustand des Zebrafish Embryos

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Minimal invasiven Embryotransfer und Embryo-Vitrifizierung auf der Optimal-Botn-Bühne im Kaninchenmodell

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...