Die Autoren bedanken sich bei Jen Sheen von Massachusetts General Hospital für die großzügige Spende von Nicotiana benthamiana Sämlinge danken. Jen Bush hat uns sehr geholfen in der Beratung in den Anbau von Pflanzen und die Einrichtung einer Wachstumskammer Region. Tom Ferrante des Wyss Institute angeboten entscheidende Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Die Autoren möchten besonders Don Ingber der Kinderklinik Boston und der Wyss-Institut für die großzügige Spende eines Gene Gun und die damit verbundenen Lieferungen danken. Die Finanzierung für dieses Projekt wurde durch eine Kooperation mit dem Department of Energy Advanced Research Projects Agency (ARPA-E-Award # DE-000079) für PAS, JCW und MdM durch Chimerion Biotechnology, Inc. für MJV vorgesehen ist, und.

1. Entwurf von Alternativ-gespleißt Sequenzen für mehrere Organelle Targeting <ol><li> Bestimmen Sie die Standorte für die endgültige Protein-Expression. Für diese Arbeit ist das Interesse an der Ausrichtung der Chloroplasten, Peroxisomen und Cytosol. </li><li> Verwenden Sie die Literatur, um Protein-und DNA-Sequenzen bekannt, dass Proteine, die Organellen von Interesse gezielt zu identifizieren. In diesem Fall wird ein Chloroplasten-Targeting-Sequenz aus Arabidopsis thaliana L-Methyltransferase isoaspartate 6,15 und eine Peroxisomen-Zielsequenz aus Arabidopsis thaliana-Transthyretin wie S-Synthase Allantoin 16,17 bestimmt. </li><li> Identifizieren Sie eine alternative Spleißen-Regime, die die Proteine ​​von Interesse für die richtige Zielorganellen sollten. Für diese Arbeit Spleißstellen wie in einem natürlichen System Arabidopsis 6 beobachtet. Die mRNA-Sequenz wurde neu gestaltet Verlassen der natürlichen Spleißstellen, sondern Sequenzen wurden Kodierung Chloroplasten-oder peroxis platziertome-Targeting-Tags innerhalb der alternativ gespleißten Introns (Abbildung 1). </li></ol> 2. Gibson Versammlung der DNA-Teile Siehe auch Abbildung 2. Die Gibson Montageverfahren ist abhängig von der Wirkung mehrerer Enzyme in einem vorgefertigten Mischung zu 1) teilweise verdauen die Enden des doppelsträngigen DNA-Einzelstränge auf und 2) Glühen kostenlose Basenpaare der benachbarten DNA-Teile. Dies ermöglicht die Klonierung der DNA-Fragmente ohne die Einschränkungen von Restriktionsstellen. <ol><li> Wähle einen Auftrag für die Elemente in der DNA-Plasmid-Konstrukt. Als Beispiel TriTag-1 Elemente: a) einen Plasmidvektor (Poren, enthaltend ein GFP-Konstrukt bekannt, in Pflanzen, ein Kanamycin-Resistenz-Marker zu arbeiten, und Replikationsursprünge für E. coli und Agrobacterium tumefaciens Hosts), b) ein Promotor-Sequenz, (P ENTCUP2 gezeigt konstitutiv zu sein in Pflanzen), C) einem Chloroplasten-Targeting-Sequenz (CTS), c) eine Peroxisomen-Zielsequenz (PTS), und d) eine Reihe von Spleißstellen wie zuvor 6 beschrieben. </li><li> Gestalten Sie das Konstrukt Basis-for-Basis mit in silico Design-Software. ApE ist ein Open-Source-Freeware-Paket, die für diese Arbeit. Hinweis: TriTag-1, hat die Reihenfolge: Plasmid-Vektor, einen Promotor, ATG, Splice-Donor-Stelle, Chloroplasten-Zielsequenz, Splice-Donor-Stelle, neutral, Spleiß-Akzeptor-Stelle, Peroxisomen-Zielsequenz, Splice-Akzeptor-Stelle, wie in GFP-Plasmid-Vektor enthalten ist . <ol><li> Entwerfen Sie die in silico DNA-Konstrukt, so dass eine 50-bp-Überlappung zwischen jedem Stück bei der Bestellung Primer für die PCR. Es ist möglich, die 50-bp-Überlappung als Primer verwendet: 25 bp in jeder Richtung. <ol><li> Achten Sie darauf, den Überblick über die Herkunft der einzelnen Stücke Reihenfolge halten. Ist es so: ein Plasmid gewachsen und miniprepped werden; eine lineare Sequenz, die als PCR-Matrize verwendet werden kann; oder eine Sequenz, die müssen seinkommerziell synthetisiert? Mehrere Firmen bieten Low-Cost-DNA-Synthese Dienstleistungen für Fragmente &lt;500 bp. In diesem Fall wird die TriTag selbst ist 437 bp, so ist es vorteilhaft, sie kommerziell Ordnung. </li><li> Die besten Ergebnisse werden kommen, wenn alle Fragmente mittels PCR amplifiziert und aus den Matrizen-DNA gereinigt. Die Resistenzmarker ist ein guter Ort, um dieses große DNA in zwei kleinere Vorlagen, die leichter sind PCR-amplifizierte teilen. </li><li> Beschränkung Restriktionsenzym DpnI schneidet methylierte DNA. Wenn die PCR-Vorlage war ein Miniprep von E. coli, Dpnl Behandlung wird die Template-DNA kontaminiert entfernen. </li></ol></li></ol></li><li> Reinige alle DNA-Sequenzen getrennt und Elution in Wasser, TE-oder EB-Puffer. <ol><li> Poren Vektor-Teil 1, ~ 3000 bp (grüne Pfeile). PCR amplifiziert und DpnI behandelt. </li><li> Poren Vektor-Teil 2, ~ 3000 bp (schwarze Pfeile). PCR amplifiziert und DpnI behandelt. </li><li> TriTag Einsatz, 437 bp (blaue Pfeile). Handel bestellt. Resuspend in ddH 2 O. </li><li> P ENTCUP-Promotor, ~ 750 bp (orange Pfeile). PCR-amplifiziert und DpnI behandelt. </li></ol></li><li> Messung der Konzentrationen von jedem der DNA-Stücke. Ziel für 150 ng / ul der Vektor-Stücke. </li><li> Einen aliquoten der Gibson Montage-Mix aus dem Gefrierfach und tauen auf Eis. Dies ist im Handel erhältlich, sondern auch einfach zu machen im Labor 14.12. <ol><li> Es gibt zwei Schritte, um dieses Rezept: eine viskose 5x Master-Mix und 15 ul Reaktions-Größe 1,33 x Aliquots. Der 5x Mastermix enthält: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 300 &amp;mgr; l 1 M MgCl 2, 600 &amp;mgr; l 10 mM von jedem dNTP, 300 &amp;mgr; l 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000, 20 mg NAD und ddH 2 O 6 ml. Planen 320 ul Aliquots (18) und gefrier alle außer einer bei -20 ° C Die Lösung wird sehr viskos sein. Beschriften Sie diese &quot;5X Isotherme Puffer&quot; </li><li> Zum einen verbleibenden (320 ul), fügen Sie 1,2 ul T5 Exonuclease, 20 ul Phusion High-Fidelity DNA Polymerase, 160 ul Taq-DNA-Ligase und 700 ul ddH 2 O. Bereiten Sie 15 ul Aliquots (~ 80) auf Eis in PCR-Röhrchen und bei -20 ° C </li></ol></li><li> Bestimmen Volumina für äquimolare Mengen von jedem der Fragmente. Es gibt ein paar Online-Rechner, einschließlich Gibthon.org. Es sollten insgesamt 5 ul aller DNA-Stücke sein. Fügen Sie sie zu den 15 ul Aliquot Gibson mischen. Wenn dies erfordert Volumen zu klein, um Pipette verdünnen, die DNA-Fragmente und / oder mehr als einen aliquoten. <ol><li> Vergessen Sie nicht, eine Kontrolle der Vektor-DNA allein vorzubereiten (zB der DNA-Teil des Antibiotikaresistenz-Marker enthalten) und bis zur Marke mit Wasser. </li></ol></li><li> Die Rohre in einem Thermocycler bei 50-55 ° C für 30-60 Minuten inkubiert. Ersetzen auf Eis und verwandeln sich in E. coli durch Hitzeschock chemisch kompetente Zellen. Verwenden Sie keine elektroZellen. Die hohe Salzkonzentration und der relativ niedrigen DNA-Konzentrationkann dazu führen, dass die Zellen Bogens. <ol><li> Wenden Sie alle 20 ul einer kommerziellen Herstellung von 200 ul Calciumchlorid-kompetenten E. coli. Inkubation auf Eis 30 min und 60 sec Hitzeschock bei 42 ° C </li><li> Zurück zu Eis 2 min, gelten 750 ul SOC oder LB-Medium und erholen sich in einem Mikrozentrifugenröhrchen 30 min Schütteln bei 37 ° C Platte der Mischung und geeignete Verdünnungen auf LB + Kan (oder anderen geeigneten Antibiotikum). Dies kann zu höheren Hintergrund (und eine höhere Anzahl von Nicht-Ziel-Rekombination) als traditionelle Ligation-basierte Klonen führen, aber es lohnt sich, etwa 10 Kolonien zu screenen. </li></ol></li><li> Bestätigen Sie mit Klon-Sequenz und speichern ein Aliquot bei -80 ° C </li></ol> 3. Biolistic Transfektion von Tabak mit der Gene Gun Dies ist eine Technik, die in JoVE 18,19 hergestellt wird. Schlüsselschritte und die Unterschiede werden unten beschrieben. <ol><li> Wachsen 50-100 ml E. coLi oder 200 ml Agrobacterium. Maxi-prep die Kultur. Eine Konzentration von etwa 1.500 ng / &amp;mgr; l erforderlich, um fortzufahren. </li><li> Bereiten Gen Gewehrkugeln wie zuvor beschrieben. Legen Sie sie in die Gene Gun. </li><li> Für die Transfektion von Nicotiana benthamiana Tabakblatt epidermale Gewebe, wählen Sie ein großes Blatt in der Nähe der Basis eines 3 Monate alten Anlage. Sorgfältig schneiden Sie es und legen Sie es Unterseite nach oben auf nassen Papierhandtücher in einer 15 cm Petrischale. </li><li> Stellen Sie den Druck für die Er Gene Gun auf 200-250 psi. </li><li> Sorgfältig Ziel der Genkanone zwischen den Rippen auf der Unterseite eines Blattes, etwa 3-5 cm darüber. Lassen Sie die Sicherheit und liefern die Teilchen auf dem Blatt. Jede Kugel kann zweimal an der gleichen Stelle auf dem Blatt verwendet werden. Wenn die Blatt explodiert, verwerfen und beginnen ein neues Blatt-es gibt einige Varianz in Blatt Zähigkeit durch Wachstumsbedingungen wie Alter, Feuchtigkeit, etc. Für eine 12-cm-Blatt, erwarten, dass etwa 6 Aufnahmen passen. </li><li> Bewahren Sie die mit der Oberseite der eine überdachte Blatt,Petrischale für 2-3 Tage bei wenig Licht auf der Bank. </li><li> Untersuchen Sie das Blatt in einem Binokular mit UV-Fluoreszenz ausgestattet, und die Suche nach einzelnen Zellen, die GFP. Dissect 5-10 mm Abschnitte Blatt. </li><li> Tauchen Sie das Blatt in einem tiefen Brunnen Mikroskop-Objektträger unter ~ 200 ul 0,1% Triton X-100. Das Detergens verhindert Bildung von Luftblasen an der Oberfläche, und die Tiefbohrung Objektträger ermöglicht eine größere Gewebeabbildungsbereich. </li></ol> 4. Konfokale Mikroskopie transfizierter Tissue Diese Anweisungen variieren für jedes Instrument, so ist es wichtig, gut ausgebildet zu werden. <ol><li> Für die Fluoreszenzdetektion Experimente, stellen Sie die Anregungslaser bis 489 nm, und stellen Sie die Photomultiplier-Detektoren 500-569 nm für GFP-Fluoreszenz und 630-700 nm für Chlorophyll-Autofluoreszenz. Bild Zellen unter Verwendung eines 40x Wasserimmersionsobjektiv. </li></ol>

<ol>
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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li><li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl/D-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis.">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li><li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. 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Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+Fluorescence+Complementation+(BiFC)+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene.">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In dieser Studie werden einfache Strategien zur Lokalisierung eines einzelnen transgenen Proteins mehrere Zellkompartimente in Pflanzen beschrieben. Das Ziel war, ein Konstrukt, das Gen in mehr als einer Organelle in Nicotiana benthamiana ausdrücken würde entwerfen. Strategien sind rationale Design von GFP-basierten DNA-Konstrukte, Gibson Montage, Lieferung der Plasmide zu Blattzellen mit der Gene Gun und Beobachtung der Ergebnisse mit der konfokalen Mikroskopie. Drei verschiedene...

Diese Arbeit ist eine Stoffwechseltechnik / synthetischen Biologie-Projekt, bei Pflanzenzellen werden ausgeführt, um ein Reporterprotein in mehreren Organellen ausdrücken, aber mit nur einem einzigen DNA-Konstrukt. Ein Ansatz, um Proteine ​​an mehr als einem Ort gezielt beinhaltet Klonen mehrere genetische Kopien, die jeweils eine unterschiedliche Lokalisation Peptid. Jede Kopie muss durch sukzessive Rücktransformation eingeführt werden oder alternativ durch Rückkreuzung einzelnen Transformationen ein. Dies beinhaltet zusätzliche Klonen, und wird von einem Lokalisierungs Tag pro Terminus begrenzt. Ein anderer Weg, um ein Protein zu mehreren Stellen lokalisiert ist, durch alternatives Splicing 2-5. RNA wird aus einem einzigen Gen transkribiert werden, aber verschiedene Kopien des Transkripts sind unterschiedlich in mehr als einen Weg pro Zelle verarbeitet wird, häufig. Dies kann in mehr als einer Boten-RNA in der Zelle von einem einzigen Gen transkribiert führen. Diese unterschiedlichen messenger RNAs können für verschiedene Isoformen des gleichen Proteins in dem Fall einer Leserahmen, einem anderen Protein vollständig zu kodieren, oder. Obwohl alternative Spleißen ist in der Literatur seit vielen Jahren beschrieben worden ist, die Wirkmechanismen und Donor-und Rezeptor konservierten Spleißstellen werden zur Zeit nur in jüngerer 6 erläutert. Da diese Standorte werden besser beschrieben, eröffnen sie Chancen für den Maschinenbau. Pflanzenstoffwechsel Ingenieure mit einer Herausforderung bei der Expression eines Proteins in mehreren Organellen konfrontiert. Ein Protein, das zu mehr als einer Organelle lokalisiert ist, muss der Ingenieur das gleiche Gen mit einer separaten Signalsequenz an die Organellen von Interesse zu klonieren mehrere Male, jedes. Für ein einzelnes Gen in drei Organellen, ist dies nur drei Gene. Aber für einen Sechs Gen Stoffwechselweg erweitert dies auf 18 Gene eine signifikante Klonen Aufwand. Die Kombination mehrerer Lokalisationssequenzen in einem einzigen, alternativ gespleißte Gen Zeichenificantly reduziert diese Anstrengung. Zum Beispiel, Re-Engineering Photorespiration 7,8 und 9,10 isoprenoiden Synthese betrifft sowohl die Chloroplasten und Peroxisomen. In unserem Fall nutzten wir Spleißstellen wie in einem natürlichen System Arabidopsis thaliana beobachtet zuvor beschriebenen 6. Wir rational gestaltete die mRNA-Sequenz, so dass die natürliche Spleißstellen allein, sondern platziert Sequenzen, die Chloroplasten oder Peroxisomen-Targeting-Tags innerhalb der alternativ gespleißten Introns (Abbildung 1) zu kodieren würde. Das exprimierte Protein kann oder kann nicht mit einem Tag, je nachdem, ob die prä-mRNA codiert, die es als ein Intron (Fig. 1g und 1h) ausgeschnitten. Für weitere Informationen über das Design der Konstrukte in dieser Arbeit vorgestellten, finden Sie im Artikel 11 Begleiter. Da dies immer noch eine signifikante Anstrengung Klonen, Gibson Anordnung, ein neues Verfahren zur Klonierung von DNA-Konstrukten, uim Aufbau sed. Gibson Verfahren kann für jede Sequenz verwendet werden, unabhängig von Restriktionsstellen (Fig. 2) 12-14. Die spezifische Kombination von Enzymen erlaubt eine Ein-Schritt-, Isothermischer Zusammenbau. In diesem Verfahren werden mehrere doppelsträngige lineare DNA Teile ausgebildet sind, daß sie überlappende Sequenzen von ~ 50 bp. Die Gibson Montage Enzym-Mix teilweise verdaut die lineare DNA-Teile, Belichten Einzelstränge von homologen Sequenzen. Diese Teil einzelsträngigen Sequenzen erneut geglüht in der Reaktionsmischung, was zu einer schnellen, einem Schritt, sequenzunabhängige Ligation freien Subklonierung Reaktion. Diese Arbeit beschreibt 1) rationale Design alternativ gespleißte Konstrukte für die Expression in Pflanzen Chloroplasten, Peroxisomen und Cytosol, 2), deren Klonierung mit dem neuen Ligation freie Methode von Gibson Montage, 3), deren Lieferung in Tabakblattzellen mit der Gene Gun und 4) Ergebnisse zeigen, Organellen-Targeting, als mit GFP beobachtetund konfokale Mikroskopie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oligonucleotide primers</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td style="width:167px;">Design specifically for construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneBlocks</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td>500 bp oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ApE software</td>
			<td style="width:191px;">U Utah</td>
			<td style="width:119px;">(download)</td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28004</td>
			<td>Used to purify PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td>Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Master Mix with GC Buffer</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0532S</td>
			<td>Used to PCR-amplify gene of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibson assembly reaction mix</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2611L</td>
			<td>Master mix of the following 9 ingredients</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M Tris-HCl pH7.5</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">T1075</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M MgCl2</td>
			<td style="width:191px;">G Biosiences</td>
			<td style="width:119px;">82023-086</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0192</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M DTT</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0861</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEG-8000</td>
			<td style="width:191px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">19966</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NAD</td>
			<td style="width:191px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1124,0005</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:191px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">T5E4111K</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">F530S</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0208L</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibthon.org</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Website to simplify calculations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid PLUS Maxi kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12963</td>
			<td>Used to prepare DNA for gene gun bullets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Gun system</td>
			<td style="width:191px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">165-2451</td>
			<td>Includes all parts necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nicotania benthamiana</td>
			<td style="width:191px;">(n/a)</td>
			<td style="width:119px;">(n/a)</td>
			<td>Gift of Jen Sheen, MGH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">SP5 X MP</td>
			<td>Imaging of resultant cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deep well slides</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">71561-01</td>
			<td>Used for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">A Plasmid Editor (ApE) </td>
			<td style="width:191px;">University of Utah </td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gibthon:Ligation calculator</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient gene expression in tobacco using gibson assembly and the gene gun

Um ein einzelnes Protein, mehrere subzelluläre Organellen Ziel, Pflanzen in der Regel duplizieren die relevanten Genen und Express jedes Gen einzeln mit Hilfe komplexer Regulierungsstrategien einschließlich Differentialpromotoren und / oder Signalsequenzen. Metabolische Ingenieure und synthetische Biologen interessiert Zielenzyme zu einer bestimmten Organelle mit einer Herausforderung: ein Protein, das zu mehr als einer Organelle lokalisiert ist, muss der Ingenieur das gleiche Gen mehrfach klonen. Diese Arbeit stellt eine Lösung für diese Strategie: Nutzung alternatives Spleißen der mRNA. Diese Technologie nutzt die Vorteile der etablierten Chloroplasten und Peroxisomen-Targeting-Sequenzen und kombiniert sie zu einem einzigen mRNA, die alternativ gespleißt wird. Einige Splice-Varianten sind mit der Chloroplasten geschickt, um einige der Peroxisomen, und einige in das Cytosol. Hier wird das System für mehrere Targeting-Organellen mit alternativem Spleißen ausgebildet. In dieser Arbeit wurde GFP erwartet werden exprEssed in den Chloroplasten, Cytosol und Peroxisomen durch eine Reihe von rational entworfenen 5 &#39;mRNA-Tags. Diese Tags haben das Potential, die Menge der Klonierung heterologer Gene erforderlich, wenn benötigt, in mehreren subzellulären Organellen ausgedrückt reduzieren. Die Konstrukte wurden in früheren Arbeiten 11 ausgelegt und wurden mit Gibson Anordnung, eine Ligation unabhängigen Klonen Methode, die nicht Restriktionsenzyme erfordert geklont. Die resultierenden Plasmide wurden in Nicotiana benthamiana epidermale Blattzellen mit einem modifizierten Gene Gun-Protokoll eingeführt. Schließlich wurden umgewandelte Blätter mit der konfokalen Mikroskopie beobachtet.

Der konstruktive Aufwand war eine Folge der erheblichen Planung. Neuartige an diesem Projekt ist der Einsatz von alternativen Spleißen, eine pre-mRNA, die in differentiell exprimierten Proteine ​​übersetzt wird, zu erstellen. Diese Proteine ​​werden in verschiedenen Organellen ausgedrückt, in diesem Fall die Chloroplasten, Peroxisomen und / oder Cytosol. Wir passten natürliche Arabidopsis-Gen, das alternativ gespleißte ist 6 und platziert bekannt Chloroplasten 6 und 17</s...

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Diese Arbeit beschreibt ein neues Verfahren zur selektiven Targeting subzellulären Organellen in Pflanzen untersucht, mit dem BioRad Gene Gun.

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

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Research

JoVE Journal

Environment

20.4K Aufrufe.  Harvard University.  Diese Arbeit beschreibt ein neues Verfahren zur selektiven Targeting subzellulären Organellen in Pflanzen untersucht, mit dem BioRad Gene Gun. 

Serie: Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Much of the nutrient cycling and carbon processing in natural environments occurs through the activity of extracellular enzymes released by microorganisms. Thus, measurement of the activity of these extracellular enzymes can give insights into the rates of ecosystem level processes, such as organic matter decomposition or nitrogen and phosphorus mineralization. Assays of extracellular enzyme activity in environmental samples typically involve exposing the samples to artificial colorimetric or fluorometric substrates and tracking the rate of substrate hydrolysis. Here we describe microplate based methods for these procedures that allow the analysis of large numbers of samples within a short time frame. Samples are allowed to react with artificial substrates within 96-well microplates or deep well microplate blocks, and enzyme activity is subsequently determined by absorption or fluorescence of the resulting end product using a typical microplate reader or fluorometer. Such high throughput procedures not only facilitate comparisons between spatially separate sites or ecosystems, but also substantially reduce the cost of such assays by reducing overall reagent volumes needed per sample.

Microplate based procedures are described for the colorimetric or fluorometric analysis of extracellular enzyme activity. These procedures allow for the rapid assay of such activity in large numbers of environmental samples within a manageable time frame.

Bestimmung mikrobieller extrazelluläre Enzymaktivität in Wasser, Böden und Sedimente mit hohem Durchsatz Mikrotiterplatten-Assays

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Forschung

Umwelt

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

Transcript und Metabolite Profiling für die Beurteilung von Tabakbaum und Pappel als Rohstoff für die Bio-basierte Industrie

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Tracking Microbial Contamination in Retail Environments Using Fluorescent Powder - A Retail Delicatessen Environment Example

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne illness. Ready-to-eat (RTE) processed foods such as deli meats, cheese, and in some cases fresh produce, have been involved in foodborne disease outbreaks due to contamination with pathogens such as Listeria monocytogenes. With respect to L. monocytogenes, deli slicers are often the main source of cross contamination. The goal of this study was to use a fluorescent compound to simulate bacterial contamination and track this contamination in a retail setting. A mock deli kitchen was designed to simulate the retail environment. Deli meat was inoculated with the fluorescent compound and volunteers were recruited to complete a set of tasks similar to those expected of a food retail employee. The volunteers were instructed to slice, package, and store the meat in a deli refrigerator. The potential cross contamination was tracked in the mock retail environment by swabbing specific areas and measuring the optical density of the swabbed area with a spectrophotometer. The results indicated that the refrigerator (i.e. deli case) grip and various areas on the slicer had the highest risk for cross contamination. The results of this study may be used to develop more focused training material for retail employees. In addition, similar methodologies could also be used to track microbial contamination in food production environments (e.g.&#160;small farms), hospitals, nursing homes, cruise ships, and hotels.

The overall goal of this study was to demonstrate the potential cross contamination mechanism of foodborne pathogen Listeria monocytogenes in a retail deli setting. This methodology may be applied to a variety of different environments to track pathogen contamination. &#160;

Tracking-Mikrobielle Kontamination in Einzelhandelsumgebungen mit fluoreszierenden Pulver - Ein Feinkost Einzelhandel Beispiel Umwelt

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne ...

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

Expression von rekombinanten Cellulase aus Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In Tabakpflanzen

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

Screening-Lebensmittel, die für Klasse 1 und Integrons Genkassetten

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That represents 100 million tons of food being destroyed or diverted to non-human consumption each year. Aflatoxins are powerful carcinogens normally accumulated by the fungi Aspergillus flavus and A. parasiticus in cereals, nuts, root crops and other agricultural products. Silencing of five aflatoxin-synthesis genes by RNA interference (RNAi) in peanut plants was used to control aflatoxin accumulation following inoculation with A. flavus. Previously, no method existed to analyze the effectiveness of RNAi in individual peanut transgenic events, as these usually produce few seeds, and traditional methods of large field experiments under aflatoxin-conducive conditions were not an option. In the field, the probability of finding naturally contaminated seeds is often 1/100 to 1/1,000. In addition, aflatoxin contamination is not uniformly distributed. Our method uses few seeds per transgenic event, with small pieces processed for real-time PCR (RT-PCR) or small RNA sequencing, and for analysis of aflatoxin accumulation by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). RNAi-expressing peanut lines 288-72 and 288-74, showed up to 100% reduction (p&#8804;0.01) in aflatoxin B1 and B2 compared to the control that accumulated up to 14,000 ng.g-1 of aflatoxin B1 when inoculated with aflatoxigenic A. flavus. As reference, the maximum total of aflatoxins allowable for human consumption in the United States is 20 ng.g-1. This protocol describes the application of RNAi-mediated control of aflatoxins in transgenic peanut seeds and methods for its evaluation. We believe that its application in breeding of peanut and other crops will bring rapid advancement in this important area of science, medicine and human nutrition, and will significantly contribute to the international effort to control aflatoxins, and potentially other mycotoxins in major food crops.

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

We demonstrate a method for the analysis of aflatoxins and transgene expression in peanut seeds that contain RNA-interference signals for silencing aflatoxin-synthesis genes in the fungus Aspergillus flavus. RNAi-mediated control of mycotoxins in plants has not been reported previously.

RNAi-vermittelten Kontrolle der Aflatoxine in Peanut: Methode, um Mykotoxinproduktion und Transgenexpression in der Erdnuss-Analyse /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

Die Barnacle Balanus Improvisus als Marine Modell - Kultivierung und Genexpression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

Agrobacterium Tumefaciens und Agrobacterium Rhizogenes-vermittelte Umwandlung der Kartoffel und die Promotoraktivität eines Suberin-Gens durch GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

Freistehende Leaf Assays zur Vereinfachung der Genexpressionsstudien in Kartoffeln während des Befalls durch Kauen Voninsekt Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Leaf Area Index Estimation mit drei unterschiedlichen Methoden in reinen Laubständen

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...