Die Autoren bedanken sich bei Jen Sheen von Massachusetts General Hospital für die großzügige Spende von Nicotiana benthamiana Sämlinge danken. Jen Bush hat uns sehr geholfen in der Beratung in den Anbau von Pflanzen und die Einrichtung einer Wachstumskammer Region. Tom Ferrante des Wyss Institute angeboten entscheidende Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Die Autoren möchten besonders Don Ingber der Kinderklinik Boston und der Wyss-Institut für die großzügige Spende eines Gene Gun und die damit verbundenen Lieferungen danken. Die Finanzierung für dieses Projekt wurde durch eine Kooperation mit dem Department of Energy Advanced Research Projects Agency (ARPA-E-Award # DE-000079) für PAS, JCW und MdM durch Chimerion Biotechnology, Inc. für MJV vorgesehen ist, und.

1. Entwurf von Alternativ-gespleißt Sequenzen für mehrere Organelle Targeting <ol><li> Bestimmen Sie die Standorte für die endgültige Protein-Expression. Für diese Arbeit ist das Interesse an der Ausrichtung der Chloroplasten, Peroxisomen und Cytosol. </li><li> Verwenden Sie die Literatur, um Protein-und DNA-Sequenzen bekannt, dass Proteine, die Organellen von Interesse gezielt zu identifizieren. In diesem Fall wird ein Chloroplasten-Targeting-Sequenz aus Arabidopsis thaliana L-Methyltransferase isoaspartate 6,15 und eine Peroxisomen-Zielsequenz aus Arabidopsis thaliana-Transthyretin wie S-Synthase Allantoin 16,17 bestimmt. </li><li> Identifizieren Sie eine alternative Spleißen-Regime, die die Proteine ​​von Interesse für die richtige Zielorganellen sollten. Für diese Arbeit Spleißstellen wie in einem natürlichen System Arabidopsis 6 beobachtet. Die mRNA-Sequenz wurde neu gestaltet Verlassen der natürlichen Spleißstellen, sondern Sequenzen wurden Kodierung Chloroplasten-oder peroxis platziertome-Targeting-Tags innerhalb der alternativ gespleißten Introns (Abbildung 1). </li></ol> 2. Gibson Versammlung der DNA-Teile Siehe auch Abbildung 2. Die Gibson Montageverfahren ist abhängig von der Wirkung mehrerer Enzyme in einem vorgefertigten Mischung zu 1) teilweise verdauen die Enden des doppelsträngigen DNA-Einzelstränge auf und 2) Glühen kostenlose Basenpaare der benachbarten DNA-Teile. Dies ermöglicht die Klonierung der DNA-Fragmente ohne die Einschränkungen von Restriktionsstellen. <ol><li> Wähle einen Auftrag für die Elemente in der DNA-Plasmid-Konstrukt. Als Beispiel TriTag-1 Elemente: a) einen Plasmidvektor (Poren, enthaltend ein GFP-Konstrukt bekannt, in Pflanzen, ein Kanamycin-Resistenz-Marker zu arbeiten, und Replikationsursprünge für E. coli und Agrobacterium tumefaciens Hosts), b) ein Promotor-Sequenz, (P ENTCUP2 gezeigt konstitutiv zu sein in Pflanzen), C) einem Chloroplasten-Targeting-Sequenz (CTS), c) eine Peroxisomen-Zielsequenz (PTS), und d) eine Reihe von Spleißstellen wie zuvor 6 beschrieben. </li><li> Gestalten Sie das Konstrukt Basis-for-Basis mit in silico Design-Software. ApE ist ein Open-Source-Freeware-Paket, die für diese Arbeit. Hinweis: TriTag-1, hat die Reihenfolge: Plasmid-Vektor, einen Promotor, ATG, Splice-Donor-Stelle, Chloroplasten-Zielsequenz, Splice-Donor-Stelle, neutral, Spleiß-Akzeptor-Stelle, Peroxisomen-Zielsequenz, Splice-Akzeptor-Stelle, wie in GFP-Plasmid-Vektor enthalten ist . <ol><li> Entwerfen Sie die in silico DNA-Konstrukt, so dass eine 50-bp-Überlappung zwischen jedem Stück bei der Bestellung Primer für die PCR. Es ist möglich, die 50-bp-Überlappung als Primer verwendet: 25 bp in jeder Richtung. <ol><li> Achten Sie darauf, den Überblick über die Herkunft der einzelnen Stücke Reihenfolge halten. Ist es so: ein Plasmid gewachsen und miniprepped werden; eine lineare Sequenz, die als PCR-Matrize verwendet werden kann; oder eine Sequenz, die müssen seinkommerziell synthetisiert? Mehrere Firmen bieten Low-Cost-DNA-Synthese Dienstleistungen für Fragmente &lt;500 bp. In diesem Fall wird die TriTag selbst ist 437 bp, so ist es vorteilhaft, sie kommerziell Ordnung. </li><li> Die besten Ergebnisse werden kommen, wenn alle Fragmente mittels PCR amplifiziert und aus den Matrizen-DNA gereinigt. Die Resistenzmarker ist ein guter Ort, um dieses große DNA in zwei kleinere Vorlagen, die leichter sind PCR-amplifizierte teilen. </li><li> Beschränkung Restriktionsenzym DpnI schneidet methylierte DNA. Wenn die PCR-Vorlage war ein Miniprep von E. coli, Dpnl Behandlung wird die Template-DNA kontaminiert entfernen. </li></ol></li></ol></li><li> Reinige alle DNA-Sequenzen getrennt und Elution in Wasser, TE-oder EB-Puffer. <ol><li> Poren Vektor-Teil 1, ~ 3000 bp (grüne Pfeile). PCR amplifiziert und DpnI behandelt. </li><li> Poren Vektor-Teil 2, ~ 3000 bp (schwarze Pfeile). PCR amplifiziert und DpnI behandelt. </li><li> TriTag Einsatz, 437 bp (blaue Pfeile). Handel bestellt. Resuspend in ddH 2 O. </li><li> P ENTCUP-Promotor, ~ 750 bp (orange Pfeile). PCR-amplifiziert und DpnI behandelt. </li></ol></li><li> Messung der Konzentrationen von jedem der DNA-Stücke. Ziel für 150 ng / ul der Vektor-Stücke. </li><li> Einen aliquoten der Gibson Montage-Mix aus dem Gefrierfach und tauen auf Eis. Dies ist im Handel erhältlich, sondern auch einfach zu machen im Labor 14.12. <ol><li> Es gibt zwei Schritte, um dieses Rezept: eine viskose 5x Master-Mix und 15 ul Reaktions-Größe 1,33 x Aliquots. Der 5x Mastermix enthält: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 300 &amp;mgr; l 1 M MgCl 2, 600 &amp;mgr; l 10 mM von jedem dNTP, 300 &amp;mgr; l 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000, 20 mg NAD und ddH 2 O 6 ml. Planen 320 ul Aliquots (18) und gefrier alle außer einer bei -20 ° C Die Lösung wird sehr viskos sein. Beschriften Sie diese &quot;5X Isotherme Puffer&quot; </li><li> Zum einen verbleibenden (320 ul), fügen Sie 1,2 ul T5 Exonuclease, 20 ul Phusion High-Fidelity DNA Polymerase, 160 ul Taq-DNA-Ligase und 700 ul ddH 2 O. Bereiten Sie 15 ul Aliquots (~ 80) auf Eis in PCR-Röhrchen und bei -20 ° C </li></ol></li><li> Bestimmen Volumina für äquimolare Mengen von jedem der Fragmente. Es gibt ein paar Online-Rechner, einschließlich Gibthon.org. Es sollten insgesamt 5 ul aller DNA-Stücke sein. Fügen Sie sie zu den 15 ul Aliquot Gibson mischen. Wenn dies erfordert Volumen zu klein, um Pipette verdünnen, die DNA-Fragmente und / oder mehr als einen aliquoten. <ol><li> Vergessen Sie nicht, eine Kontrolle der Vektor-DNA allein vorzubereiten (zB der DNA-Teil des Antibiotikaresistenz-Marker enthalten) und bis zur Marke mit Wasser. </li></ol></li><li> Die Rohre in einem Thermocycler bei 50-55 ° C für 30-60 Minuten inkubiert. Ersetzen auf Eis und verwandeln sich in E. coli durch Hitzeschock chemisch kompetente Zellen. Verwenden Sie keine elektroZellen. Die hohe Salzkonzentration und der relativ niedrigen DNA-Konzentrationkann dazu führen, dass die Zellen Bogens. <ol><li> Wenden Sie alle 20 ul einer kommerziellen Herstellung von 200 ul Calciumchlorid-kompetenten E. coli. Inkubation auf Eis 30 min und 60 sec Hitzeschock bei 42 ° C </li><li> Zurück zu Eis 2 min, gelten 750 ul SOC oder LB-Medium und erholen sich in einem Mikrozentrifugenröhrchen 30 min Schütteln bei 37 ° C Platte der Mischung und geeignete Verdünnungen auf LB + Kan (oder anderen geeigneten Antibiotikum). Dies kann zu höheren Hintergrund (und eine höhere Anzahl von Nicht-Ziel-Rekombination) als traditionelle Ligation-basierte Klonen führen, aber es lohnt sich, etwa 10 Kolonien zu screenen. </li></ol></li><li> Bestätigen Sie mit Klon-Sequenz und speichern ein Aliquot bei -80 ° C </li></ol> 3. Biolistic Transfektion von Tabak mit der Gene Gun Dies ist eine Technik, die in JoVE 18,19 hergestellt wird. Schlüsselschritte und die Unterschiede werden unten beschrieben. <ol><li> Wachsen 50-100 ml E. coLi oder 200 ml Agrobacterium. Maxi-prep die Kultur. Eine Konzentration von etwa 1.500 ng / &amp;mgr; l erforderlich, um fortzufahren. </li><li> Bereiten Gen Gewehrkugeln wie zuvor beschrieben. Legen Sie sie in die Gene Gun. </li><li> Für die Transfektion von Nicotiana benthamiana Tabakblatt epidermale Gewebe, wählen Sie ein großes Blatt in der Nähe der Basis eines 3 Monate alten Anlage. Sorgfältig schneiden Sie es und legen Sie es Unterseite nach oben auf nassen Papierhandtücher in einer 15 cm Petrischale. </li><li> Stellen Sie den Druck für die Er Gene Gun auf 200-250 psi. </li><li> Sorgfältig Ziel der Genkanone zwischen den Rippen auf der Unterseite eines Blattes, etwa 3-5 cm darüber. Lassen Sie die Sicherheit und liefern die Teilchen auf dem Blatt. Jede Kugel kann zweimal an der gleichen Stelle auf dem Blatt verwendet werden. Wenn die Blatt explodiert, verwerfen und beginnen ein neues Blatt-es gibt einige Varianz in Blatt Zähigkeit durch Wachstumsbedingungen wie Alter, Feuchtigkeit, etc. Für eine 12-cm-Blatt, erwarten, dass etwa 6 Aufnahmen passen. </li><li> Bewahren Sie die mit der Oberseite der eine überdachte Blatt,Petrischale für 2-3 Tage bei wenig Licht auf der Bank. </li><li> Untersuchen Sie das Blatt in einem Binokular mit UV-Fluoreszenz ausgestattet, und die Suche nach einzelnen Zellen, die GFP. Dissect 5-10 mm Abschnitte Blatt. </li><li> Tauchen Sie das Blatt in einem tiefen Brunnen Mikroskop-Objektträger unter ~ 200 ul 0,1% Triton X-100. Das Detergens verhindert Bildung von Luftblasen an der Oberfläche, und die Tiefbohrung Objektträger ermöglicht eine größere Gewebeabbildungsbereich. </li></ol> 4. Konfokale Mikroskopie transfizierter Tissue Diese Anweisungen variieren für jedes Instrument, so ist es wichtig, gut ausgebildet zu werden. <ol><li> Für die Fluoreszenzdetektion Experimente, stellen Sie die Anregungslaser bis 489 nm, und stellen Sie die Photomultiplier-Detektoren 500-569 nm für GFP-Fluoreszenz und 630-700 nm für Chlorophyll-Autofluoreszenz. Bild Zellen unter Verwendung eines 40x Wasserimmersionsobjektiv. </li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li><li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl/D-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis.">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li><li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. 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Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+Fluorescence+Complementation+(BiFC)+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene.">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In dieser Studie werden einfache Strategien zur Lokalisierung eines einzelnen transgenen Proteins mehrere Zellkompartimente in Pflanzen beschrieben. Das Ziel war, ein Konstrukt, das Gen in mehr als einer Organelle in Nicotiana benthamiana ausdrücken würde entwerfen. Strategien sind rationale Design von GFP-basierten DNA-Konstrukte, Gibson Montage, Lieferung der Plasmide zu Blattzellen mit der Gene Gun und Beobachtung der Ergebnisse mit der konfokalen Mikroskopie. Drei verschiedene...

Diese Arbeit ist eine Stoffwechseltechnik / synthetischen Biologie-Projekt, bei Pflanzenzellen werden ausgeführt, um ein Reporterprotein in mehreren Organellen ausdrücken, aber mit nur einem einzigen DNA-Konstrukt. Ein Ansatz, um Proteine ​​an mehr als einem Ort gezielt beinhaltet Klonen mehrere genetische Kopien, die jeweils eine unterschiedliche Lokalisation Peptid. Jede Kopie muss durch sukzessive Rücktransformation eingeführt werden oder alternativ durch Rückkreuzung einzelnen Transformationen ein. Dies beinhaltet zusätzliche Klonen, und wird von einem Lokalisierungs Tag pro Terminus begrenzt. Ein anderer Weg, um ein Protein zu mehreren Stellen lokalisiert ist, durch alternatives Splicing 2-5. RNA wird aus einem einzigen Gen transkribiert werden, aber verschiedene Kopien des Transkripts sind unterschiedlich in mehr als einen Weg pro Zelle verarbeitet wird, häufig. Dies kann in mehr als einer Boten-RNA in der Zelle von einem einzigen Gen transkribiert führen. Diese unterschiedlichen messenger RNAs können für verschiedene Isoformen des gleichen Proteins in dem Fall einer Leserahmen, einem anderen Protein vollständig zu kodieren, oder. Obwohl alternative Spleißen ist in der Literatur seit vielen Jahren beschrieben worden ist, die Wirkmechanismen und Donor-und Rezeptor konservierten Spleißstellen werden zur Zeit nur in jüngerer 6 erläutert. Da diese Standorte werden besser beschrieben, eröffnen sie Chancen für den Maschinenbau. Pflanzenstoffwechsel Ingenieure mit einer Herausforderung bei der Expression eines Proteins in mehreren Organellen konfrontiert. Ein Protein, das zu mehr als einer Organelle lokalisiert ist, muss der Ingenieur das gleiche Gen mit einer separaten Signalsequenz an die Organellen von Interesse zu klonieren mehrere Male, jedes. Für ein einzelnes Gen in drei Organellen, ist dies nur drei Gene. Aber für einen Sechs Gen Stoffwechselweg erweitert dies auf 18 Gene eine signifikante Klonen Aufwand. Die Kombination mehrerer Lokalisationssequenzen in einem einzigen, alternativ gespleißte Gen Zeichenificantly reduziert diese Anstrengung. Zum Beispiel, Re-Engineering Photorespiration 7,8 und 9,10 isoprenoiden Synthese betrifft sowohl die Chloroplasten und Peroxisomen. In unserem Fall nutzten wir Spleißstellen wie in einem natürlichen System Arabidopsis thaliana beobachtet zuvor beschriebenen 6. Wir rational gestaltete die mRNA-Sequenz, so dass die natürliche Spleißstellen allein, sondern platziert Sequenzen, die Chloroplasten oder Peroxisomen-Targeting-Tags innerhalb der alternativ gespleißten Introns (Abbildung 1) zu kodieren würde. Das exprimierte Protein kann oder kann nicht mit einem Tag, je nachdem, ob die prä-mRNA codiert, die es als ein Intron (Fig. 1g und 1h) ausgeschnitten. Für weitere Informationen über das Design der Konstrukte in dieser Arbeit vorgestellten, finden Sie im Artikel 11 Begleiter. Da dies immer noch eine signifikante Anstrengung Klonen, Gibson Anordnung, ein neues Verfahren zur Klonierung von DNA-Konstrukten, uim Aufbau sed. Gibson Verfahren kann für jede Sequenz verwendet werden, unabhängig von Restriktionsstellen (Fig. 2) 12-14. Die spezifische Kombination von Enzymen erlaubt eine Ein-Schritt-, Isothermischer Zusammenbau. In diesem Verfahren werden mehrere doppelsträngige lineare DNA Teile ausgebildet sind, daß sie überlappende Sequenzen von ~ 50 bp. Die Gibson Montage Enzym-Mix teilweise verdaut die lineare DNA-Teile, Belichten Einzelstränge von homologen Sequenzen. Diese Teil einzelsträngigen Sequenzen erneut geglüht in der Reaktionsmischung, was zu einer schnellen, einem Schritt, sequenzunabhängige Ligation freien Subklonierung Reaktion. Diese Arbeit beschreibt 1) rationale Design alternativ gespleißte Konstrukte für die Expression in Pflanzen Chloroplasten, Peroxisomen und Cytosol, 2), deren Klonierung mit dem neuen Ligation freie Methode von Gibson Montage, 3), deren Lieferung in Tabakblattzellen mit der Gene Gun und 4) Ergebnisse zeigen, Organellen-Targeting, als mit GFP beobachtetund konfokale Mikroskopie.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotide primers</td><td>IDT</td><td>(custom)</td><td>Design specifically for construct</td></tr><tr><td>GeneBlocks</td><td>IDT</td><td>(custom)</td><td>500 bp oligonucleotides</td></tr><tr><td>ApE software</td><td>U Utah</td><td>(download)</td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td></tr><tr><td>MinElute kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Used to purify PCR products</td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid</td></tr><tr><td>Phusion Master Mix with GC Buffer</td><td>NEB</td><td>M0532S</td><td>Used to PCR-amplify gene of interest</td></tr><tr><td>Gibson assembly reaction mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Master mix of the following 9 ingredients</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH7.5</td><td>Teknova</td><td>T1075</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>G Biosiences</td><td>82023-086</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Fermentas</td><td>R0192</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>1 M DTT</td><td>Fermentas</td><td>R0861</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Affymetrix</td><td>19966</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Applichem</td><td>A1124,0005</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>T5 exonuclease</td><td>Epicentre</td><td>T5E4111K</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>Phusion polymerase</td><td>NEB</td><td>F530S</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>Taq DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0208L</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>Gibthon.org</td><td></td><td></td><td>Website to simplify calculations</td></tr><tr><td>Plasmid PLUS Maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td>Used to prepare DNA for gene gun bullets</td></tr><tr><td>Gene Gun system</td><td>BioRad</td><td>165-2451</td><td>Includes all parts necessary</td></tr><tr><td>Nicotania benthamiana</td><td>(n/a)</td><td>(n/a)</td><td>Gift of Jen Sheen, MGH</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP5 X MP</td><td>Imaging of resultant cells</td></tr><tr><td>Deep well slides</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71561-01</td><td>Used for confocal imaging</td></tr><tr><td>A Plasmid Editor (ApE) </td><td>University of Utah </td><td></td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td></tr><tr><td>Gibthon:Ligation calculator</td><td></td><td></td><td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td></tr></tbody></table>

transient gene expression in tobacco using gibson assembly and the gene gun

Um ein einzelnes Protein, mehrere subzelluläre Organellen Ziel, Pflanzen in der Regel duplizieren die relevanten Genen und Express jedes Gen einzeln mit Hilfe komplexer Regulierungsstrategien einschließlich Differentialpromotoren und / oder Signalsequenzen. Metabolische Ingenieure und synthetische Biologen interessiert Zielenzyme zu einer bestimmten Organelle mit einer Herausforderung: ein Protein, das zu mehr als einer Organelle lokalisiert ist, muss der Ingenieur das gleiche Gen mehrfach klonen. Diese Arbeit stellt eine Lösung für diese Strategie: Nutzung alternatives Spleißen der mRNA. Diese Technologie nutzt die Vorteile der etablierten Chloroplasten und Peroxisomen-Targeting-Sequenzen und kombiniert sie zu einem einzigen mRNA, die alternativ gespleißt wird. Einige Splice-Varianten sind mit der Chloroplasten geschickt, um einige der Peroxisomen, und einige in das Cytosol. Hier wird das System für mehrere Targeting-Organellen mit alternativem Spleißen ausgebildet. In dieser Arbeit wurde GFP erwartet werden exprEssed in den Chloroplasten, Cytosol und Peroxisomen durch eine Reihe von rational entworfenen 5 &#39;mRNA-Tags. Diese Tags haben das Potential, die Menge der Klonierung heterologer Gene erforderlich, wenn benötigt, in mehreren subzellulären Organellen ausgedrückt reduzieren. Die Konstrukte wurden in früheren Arbeiten 11 ausgelegt und wurden mit Gibson Anordnung, eine Ligation unabhängigen Klonen Methode, die nicht Restriktionsenzyme erfordert geklont. Die resultierenden Plasmide wurden in Nicotiana benthamiana epidermale Blattzellen mit einem modifizierten Gene Gun-Protokoll eingeführt. Schließlich wurden umgewandelte Blätter mit der konfokalen Mikroskopie beobachtet.

Der konstruktive Aufwand war eine Folge der erheblichen Planung. Neuartige an diesem Projekt ist der Einsatz von alternativen Spleißen, eine pre-mRNA, die in differentiell exprimierten Proteine ​​übersetzt wird, zu erstellen. Diese Proteine ​​werden in verschiedenen Organellen ausgedrückt, in diesem Fall die Chloroplasten, Peroxisomen und / oder Cytosol. Wir passten natürliche Arabidopsis-Gen, das alternativ gespleißte ist 6 und platziert bekannt Chloroplasten 6 und 17</s...

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Diese Arbeit beschreibt ein neues Verfahren zur selektiven Targeting subzellulären Organellen in Pflanzen untersucht, mit dem BioRad Gene Gun.

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

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Research

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Environment

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Serie: Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the transgene, as multi-copy integrations are often subjected to gene silencing. The Gateway-compatible binary vector based on bacterial artificial chromosomes (pBIBAC-GW), like other pBIBAC derivatives, allows the insertion of single-copy transgenes with high efficiency. As an improvement to the original pBIBAC, a Gateway cassette has been cloned into pBIBAC-GW, so that the sequences of interest can now be easily incorporated into the vector transfer DNA (T-DNA) by Gateway cloning. Commonly, the transformation with pBIBAC-GW results in an efficiency of 0.2&#8211;0.5%, whereby half of the transgenics carry an intact single-copy integration of the T-DNA. The pBIBAC-GW vectors are available with resistance to Glufosinate-ammonium or DsRed fluorescence in seed coats for selection in plants, and with resistance to kanamycin as a selection in bacteria. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic plants using pBIBAC-GW: starting from recombining the sequences of interest into the pBIBAC-GW vector of choice, to plant transformation with Agrobacterium, selection of the transgenics, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts using DNA blotting. Attention is given to designing a DNA blotting strategy to recognize single- and multi-copy integrations at single and multiple loci.

Using a pBIBAC-GW binary vector makes generating transgenic plants with intact single-copy insertions, an easy process. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic Arabidopsis plants, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts.

Generierung von transgenen Pflanzen mit Single-Copy-Einschübe mit binären Vektor BIBAC-GW

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

Forschung

Genetik

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

Transiente Expression in Nicotiana Benthamiana Blätter für Triterpene Produktion im präparativen Maßstab

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Biochemie

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

Charakterisierung komplexer Systeme Mit dem Design of Experiments Ansatz: Transient Protein Expression in Tabak als Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Biotechnik

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virus-induzierten Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana Und Tomaten

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Biologie

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized plasmids for expression of exogenous genes in mouse embryonic stem cells (mESCs). Expression of exogenous genes under the control of the SV40 or human cytomegalovirus promoters diminishes quickly after transfection into mESCs. A remedy for this diminished expression is to use the human elongation factor-1 alpha (hEF1&#945;) promoter to drive gene expression. Plasmid vectors containing hEF1&#945; are not as widely available as SV40- or CMV-containing plasmids, especially those also containing N-terminal 3xFLAG-tags. The protocol described here is a rapid method to create plasmids expressing FLAG-tagged CstF-64 and CstF-64 mutant under the expressional regulation of the hEF1&#945; promoter. GA uses a blend of DNA exonuclease, DNA polymerase and DNA ligase to make cloning of overlapping ends of DNA fragments possible. Based on the template DNAs we had available, we designed our constructs to be assembled into a single sequence. Our design used four DNA fragments: pcDNA 3.1 vector backbone, hEF1&#945; promoter part 1, hEF1&#945; promoter part 2 (which contained 3xFLAG-tag purchased as a double-stranded synthetic DNA fragment), and either CstF-64 or specific CstF-64 mutant. The sequences of these fragments were uploaded to a primer generation tool to design appropriate PCR primers for generating the DNA fragments. After PCR, DNA fragments were mixed with the vector containing the selective marker and the GA cloning reaction was assembled. Plasmids from individual transformed bacterial colonies were isolated. Initial screen of the plasmids was done by restriction digestion, followed by sequencing. In conclusion, GA allowed us to create customized plasmids for gene expression in 5 days, including construct screens and verification.

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Erzeugung von Plasmid-Vektoren, die FLAG-markierten Proteine ​​Nach der Verordnung der Menschen Elongation Factor-1α Promoter Mit Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine ​​in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imaging Räumliche Reorganisation eines MAPK Signalweg Verwendung des Tabak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

Zusammenfassung

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Generierung von transgenen Pflanzen mit Single-Copy-Einschübe mit binären Vektor BIBAC-GW

Transiente Expression in Nicotiana Benthamiana Blätter für Triterpene Produktion im präparativen Maßstab

Charakterisierung komplexer Systeme Mit dem Design of Experiments Ansatz: Transient Protein Expression in Tabak als Case Study

Virus-induzierten Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana Und Tomaten

Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing Assay In Cotton

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Optimierung und Nutzung von

Erzeugung von Plasmid-Vektoren, die FLAG-markierten Proteine Nach der Verordnung der Menschen Elongation Factor-1α Promoter Mit Gibson Assembly

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Imaging Räumliche Reorganisation eines MAPK Signalweg Verwendung des Tabak Transient Expression System

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

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Generierung von transgenen Pflanzen mit Single-Copy-Einschübe mit binären Vektor BIBAC-GW

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Optimierung und Nutzung von

Erzeugung von Plasmid-Vektoren, die FLAG-markierten Proteine ​​Nach der Verordnung der Menschen Elongation Factor-1α Promoter Mit Gibson Assembly

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine ​​in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Imaging Räumliche Reorganisation eines MAPK Signalweg Verwendung des Tabak Transient Expression System

Erzeugung von Plasmid-Vektoren, die FLAG-markierten Proteine Nach der Verordnung der Menschen Elongation Factor-1α Promoter Mit Gibson Assembly

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme