Wir danken R. Sun und andere Studenten von Chens Labor für ihren Beitrag zur Material-Generation zu pflanzen. Wir danken auch Dr. D. Green für seine Unterstützung von Bachelor-Forschung in der Hochschule für Technik und Innovation (KTI). Diese Forschung wurde teilweise durch Zuschüsse NIH U01 AI075549 und 1R21AI101329 zu Q. Chen und eine SSE Zuschuss von CTI der Arizona State University auf Q. Chen unterstützt. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado und J. Stahnke sind Studenten von der SSE Zuschuss unterstützt.

1. Plant Growth <ol><li> Platz 60 Torf Pellets in einem Anzuchtplatte. In 4 l Leitungswasser und lassen Sie den Torf Pellets absorbieren das Wasser für 2 Stunden. </li><li> In 2 N. benthamiana Samen in jeder Torf Pellets mit einem seeder, decken Sie das Fach mit einem transparenten Kunststoff-Kuppel und es ihnen ermöglichen, in einem 25 ° C, 84% Luftfeuchtigkeit Umgebung mit einem 16/8 h Tag / Nacht-Zyklus (Abbildung 1A) keimen. </li><li> Entfernen Sie die Kuppel zwei Wochen nach Aussaat, lassen Sie das Wasser aus dem Fach, und mit 2 L von Jacks Dünger in einer Konzentration von 1,48 g / L (Abbildung 1B). Weiter zu Pflanzen in einem 25 ° C, 50% Luftfeuchtigkeit Umgebung mit einem 16/8 h Tag / Nacht-Zyklus wachsen. Versorgung 2 L von Jacks Dünger alle 2 Tage pro Fach. </li><li> In Woche 4, übertragen Sie die Pflanzen mit Torf Pellets zu einem neuen Fach, das sechs Pflanzen beherbergt, um ausreichend Platz für weiteres Wachstum (Abbildung 1C) bereitzustellen, bis sie bereit sind, an Alter von 6 Wochen (Abbildung infiltriert werden1D). </li></ol> 2. A. tumefaciens Kultur Vorbereitung 2.1 Vorbereitung für Spritze Infiltration <ol><li> Serie A. tumefaciens GV3101 Stämme mit den geminiviral Vektoren p19, pREP110, pBYGFP und pBYDsRed auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (100 ug / ml). Streak ein Stamm pro Platte und wachsen bei 30 ° C für 48 Stunden. </li><li> Ebenso Streifen und wachsen GV3101 Stämmen, die magnICON Vektoren der 5 &#39;Modul (pICH15879), das 3&#39;-Modul, das die Target-Gen von GFP oder DsRed (Pich-GFP oder Pich-DsRed) und Integrase (pCH14011) auf LB-Agar Platten mit Carbenicillin (100 ug / ml). </li><li> Von einer einzigen Kolonie auf der LB-Agar Platte, impfen GV3101 Stämmen, geminiviral Vektoren in 3 ml YENB Medien (0,75% Bacto Hefeextrakt, 0,8% Nährbouillon, pH-Wert auf 7,5 mit NaOH) + Kanamycin (100 ug / ml) in eine 15-ml-Tube Kultur, wachsen die Flüssigkeit Kultur bei 30 ° C ina Schüttler über Nacht mit einer 300 rpm Drehzahl. </li><li> Ebenso impfen und zu wachsen GV3101 Stämmen, magnICON Vektoren in YENB media + Carbenicillin (100 ug / ml) in einem Schüttler über Nacht bei 30 ° C. </li><li> Messung und Aufzeichnung von OD 600-Werte für jede Flüssigkeit Kultur mit einem Spektralphotometer und verwenden Sie die folgende Formel, um das notwendige Volumen (V sub), um für eine neue Kultur mit einem Startpreis von 0,025 OD 600 werden in 10 ml YENB subkultiviert mit geeigneten Antibiotika berechnen . V sub (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD 600 </li><li> Transfer-V sub (ml) der Übernacht-Kultur auf (10 - V sub) ml YENB Medien mit entsprechenden Antibiotika für jeden Stamm. Wachsen die neue Kultur über Nacht bei 30 ° C in einem Schüttler mit einer 250 rpm Drehzahl bis die OD 600-Wert im Bereich von 1,7-2,0. </li><li> Messen und aufzeichnen OD 600-Werte für jede Flüssigkeit Kultur und verwenden Sie die folgende Formel in CalcUlate das benötigte Volumen (V inf) in 50 ml Infiltration Puffer verdünnt werden, um einen endgültigen OD 600 von 0,12 für jeden Stamm geben. V inf (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 </li><li> Transfer-V inf (ml) von jeder Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Spin-Down der Zellen durch Zentrifugation bei 12.000 xg für 2 min, Überstand entfernen und dann die Zellen in 10 ml Infiltration Puffer (10 mM MES, pH 5,5; 10 mM MgSO 4) durch Vortexen kurz. </li><li> Mischen resuspendiert Zellen pBYGFP + + pREP110 p19, drehen Sie die Zellen nach unten bei 12.000 xg für 2 min, und resuspendieren in insgesamt 50 ml Puffer Infiltration. Diese Kombination ist für Agrobakterien geminiviral Expression von GFP. </li><li> Ebenso mischen die folgenden Kombinationen von Agrobakterien Zellen, Spin-down und resuspendieren sie in 50 ml Puffer Infiltration. Dazu gehören (1) pBYDsRed + + pREP110 p19 für geminiviral Expression von DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 für geminiviral Co-Expression von GFP und DsRed, (3) pREp110 + p19 als negative Kontrolle geminiviral Ausdruck, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 für magnICON Expression von GFP, (5) Pich-DsRed + + pICH15879 pCH14011 für magnICON Expression von DsRed, und (6) pICH15879 + pCH14011 als negative Kontrolle für magnICON Ausdruck. </li></ol> 2.2 Vorbereitung für Vakuuminfiltration <ol><li> Impfen und Kultur jedes GV3101 Stamm, geminiviral Vektoren oder magnICON Vektoren in 15 ml YENB Medien mit entsprechenden Antibiotika in einem 50 ml Autoklaven überführt und über Nacht wachsen wie für Spritze Infiltration oben beschrieben. </li><li> Messung und Aufzeichnung von OD 600-Werte für jede Flüssigkeit Kultur mit einem Spektralphotometer und verwenden Sie die folgende Formel, um das notwendige Volumen (V sub), um für eine neue Kultur mit einem Startpreis von 0,025 OD 600 werden in 250 ml YENB subkultiviert mit geeigneten Antibiotika berechnen . V sub </sub&gt; (Ml) = (250 ml) x (0.025) / OD 600 </li><li> Transfer-V sub (ml) der Übernacht-Kultur auf (250 - V sub) ml YENB Medien in einer 1 L autoklavierte Kolben mit geeigneten Antibiotika für jeden Stamm und wachsen die neue Kultur über Nacht wie für Spritze Infiltration oben beschrieben. </li><li> Messen und aufzeichnen OD 600-Werte für jede Flüssigkeit Kultur und verwenden Sie die folgende Formel, um das notwendige Volumen (V inf) in 3 L der Infiltration verdünnt werden, um eine endgültige OD 600 von 0,12 für jeden Stamm geben berechnen. V inf (ml) = (3000 ml) x (0,12) / OD 600 </li><li> Pellet resuspendieren und V inf (ml) von jeder Kultur in Infiltration Puffer für Spritze Infiltration beschrieben und mischen Sie die resuspendierten Kulturen nach den Kombinationen für Spritze Infiltration beschrieben. Repellet die gemischten Agrobakterien Zellen resuspendieren und sie in 3 L der Infiltration Puffer. </li></ol> 3.1 Spritze Infiltration <ol><li> Wählen Sie vier 6-Wochen alten N. benthamiana Pflanzen mit 5 verlässt jeder. Die ersten drei Blätter von oben gezählt von jeder Pflanze wird vollständig mit einer der Kombinationen von A. infiltriert tumefaciens-Stämme in Infiltration Puffer. Das vierte Blatt wird spot-infiltriert mit allen vier Stamm-Kombinationen für geminiviral Ausdruck oder allen drei Kombinationen für magnICON Ausdruck. Das letzte Blatt auf jeder Anlage wird mit einer Kombination aus negativen Kontrollen infiltriert werden. </li><li> Erstellen einer kleinen Einschnitt mit einer Nadel in der Epidermis an der Rückseite des Flügels (Abbildung 2A). Vorsicht: Achten Sie darauf, nicht zu kratzen, so hart wie zu durchbohren das Blatt durch beide Seiten, da die Zellen in der Agrobakterien Infiltration Mischung wird durch die Punktion auf die andere Seite des Blattes passieren. </li><li> Nehmen Sie einen festen Halt der Vorderseite des Blattes und unter sanftemGegendruck der nick mit dem Daumen einer Hand, injizieren die Mischungen in Agrobacterium Infiltration Puffer in die nick mit einer Spritze ohne Nadel (Abbildung 2B). Hinweis: Da die Agrobacterium Gemisch tritt die Interzellulärraum des Blattes, das infiltrierte Bereich wird sichtbar dunkleren Grün drehen (Abbildung 2C). </li><li> Fahren Sie mit dem Agrobacterium Mischungen in die nick injizieren, bis die dunkleren grünen Kreis stoppt, um zu erweitern. Erstellen Sie eine weitere nick und wiederholen Sie die Schritte, bis die gesamte 3.1.2-3.1.4 Blatt infiltriert wird und das ganze Blatt wird dunkler grün für die ersten drei Blätter und das letzte Blatt. </li><li> Für das vierte Blatt jeder Pflanze, werden alle vier (geminiviral Vektor) oder drei (magnICON Vektor) Kombinationen hinein infiltriert werden. Machen Sie einen nick für jede Kombination von Agrobacterium-Stämme, und infiltrieren jede nick mit einer Kombination. </li><li> Nach der Infiltration bewegen Pflanzen wieder zum Wachstum Zimmer und monitor Proteinexpression zwischen 2-15 Tage nach der Infiltration (dpi). </li></ol> 3.2 Vakuuminfiltration <ol><li> Legen Sie eine Badewanne in einem Vakuum-Exsikkator und Transfer 3 L Infiltration Puffer, die Agrobacterium-Stämme in die Wanne. Verbinden Sie den Exsikkator zu einem Vacuubrand Membran-Vakuumpumpe (3A). </li><li> Legen Sie eine Pflanze kopfüber auf den Exsikkator Platte (3B) und senken Sie die Platte mit der Pflanze, bis das gesamte Blatt und Stamm-System wird in den Puffer Infiltration mit der Platte ruht oben auf der Wanne untergetaucht. Setzen Sie den O-Ring Exsikkator entlang des Randes und setzen Sie den Deckel auf den Exsikkator Kammer (3C). </li><li> Einschalten der Vakuumpumpe und den Startzeitpunkt, wenn das Vakuum erreicht 100 mbar. Langsam öffnen Sie das Ablassventil auf dem Exsikkator nach 1 min bei 100 mbar bis zum Eingang von Agrobakterien in die Zwischenräume des untergetauchten Pflanzengewebe zu ermöglichen. Wiederholen Sie diesen Schritt ein additionalen Zeit, um gute Infiltration zu gewährleisten. </li><li> Nach der Infiltration, nehmen Sie die Pflanze aus dem Exsikkator und steckte es wieder in die aufrechte Position. Bewegen Pflanzen wieder zum Wachstum Zimmer und Monitor Proteinexpression zwischen 2-15 dpi. </li></ol> 4. Fluorescent Protein Detection and Photography <ol><li> Ausgehend von 2 dpi, move Pflanzen in dunklen Raum und Glanz UV-Licht auf der Rückseite des infiltrierten Blätter mit einem handgeführten UV-Lampe. </li><li> Beachten Sie die grüne Fluoreszenz von GFP oder die rote Fluoreszenz von DsRed. GFP gibt ein stärkeres Signal mit langwelligen UV-Licht, während DsRed ist stärker unter kurzwelligem UV-Licht. </li><li> Machen Sie Fotos von fluoreszierenden Blätter mit einer normalen Digitalkamera ohne Blitz. </li><li> Bewegen Pflanzen wieder zum Wachstum Zimmer nach Beobachtung oder Fotografie. </li></ol>

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	<li>Chen, Q., Mou, B., Scorza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. , 86-126 (2011).</li><li>Chen, Q., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+virus-like+particles+as+vaccines.">Plant-derived virus-like particles as vaccines.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).</li><li>Landry, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+and+clinical+development+of+plant-made+virus-like+particle+vaccine+against+avian+H5N1+influenza.">Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza.</a> PLoS One. 5, e15559 (2010).</li><li>Lai, H., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprocessing+of+plant-derived+virus-like+particles+of+Norwalk+virus+capsid+protein+under+current+Good+Manufacture+Practice+regulations.">Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations.</a> Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).</li><li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+Pharmaceutical+Proteins+in+Plants.">Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants.</a> Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).</li><li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+new+leaf.">Turning a new leaf.</a> European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).</li><li>Chen, Q., Levine, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> New Generation Vaccines. , 306-315 (2009).</li><li>Lai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+produced+in+plants+efficiently+treats+West+Nile+virus+infection+in+mice.">Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).</li><li>Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+porcine+prorelaxin+in+transgenic+tobacco.">Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).</li><li>Lico, C., Chen, Q., Santi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+production+of+recombinant+proteins+in+plants.">Viral vectors for production of recombinant proteins in plants.</a> J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).</li><li>Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geminiviral+vectors+based+on+bean+yellow+dwarf+virus+for+production+of+vaccine+antigens+and+monoclonal+antibodies+in+plants.">Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants.</a> Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).</li><li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry,+mutagenesis,+and+oligomerization+of+DsRed,+a+red+fluorescent+protein+from+coral.">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).</li><li>Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+production+of+virus-like+particles+and+monoclonal+antibodies+with+geminiviral+replicon+vectors+in+lettuce.">Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce.</a> Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).</li><li>Giritch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+high-yield+expression+of+full-size+IgG+antibodies+in+plants+coinfected+with+noncompeting+viral+vectors.">Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).</li><li>Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+replicon+system+for+rapid+high-level+production+of+virus-like+particles+in+plants.">A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).</li><li>Santi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+plant+viral+expression+system+generating+orally+immunogenic+Norwalk+virus-like+particles.">An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles.</a> Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).</li><li>He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+System+for+Rapid+and+Cost-Effective+Production+of+Detection+and+Diagnostic+Reagents+of+West+Nile+Virus+in+Plants.">A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+rapid+production+of+full-size+monoclonal+antibodies+in+plants+by+a+single-vector+DNA+replicon+system.">High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).</li><li>Kuta, D., Tripathi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-induced+hypersensitive+necrotic+reaction+in+plant+cells:+a+resistance+response+against+Agrobacterium-mediated+DNA+transfer.">Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).</li><li>Phoolcharoen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+an+immunogenic+Ebola+immune+complex+in+Nicotiana+benthamiana.">Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana.</a> Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).</li><li>Phoolcharoen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonreplicating+subunit+vaccine+protects+mice+against+lethal+Ebola+virus+challenge.">A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).</li><li>Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norwalk+virus-like+particles+as+vaccines.">Norwalk virus-like particles as vaccines.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins.">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die steigenden Anforderungen an die Protein-basierten Pharmazeutika weltweit erfordern neue Produktion Plattformen, die robuste, skalierbare, kostengünstige und sicher sind. Pflanzen haben gezeigt, dass eine der vielversprechendsten alternativen Produktionssystemen für Herstellung pharmazeutischer Proteine ​​sein. In den letzten Jahren wurde die Entwicklung von deconstructed Virus basierende Vektoren transienten Expression von Proteinen in Pflanzen, die eine wesentliche Steigerung der Geschwindigkeit und Ausbeute ...

Seit den 1970er Jahren haben die Pflanzen als Alternative zu Säugetier-, Insekten-und bakteriellen Zellkulturen für die kommerzielle Produktion von rekombinanten Proteinen und Protein-Therapeutika 1 untersucht. Plant-basierte Systeme für die Expression von Biopharmazeutika haben Versprechen in den letzten Jahren als mehrere neue Behandlungen für Krankheiten, wie Morbus Gaucher 2 und aviäre Influenza H5N1 3 dargestellt ist, haben gezeigt, Erfolg in klinischen Studien. Die Entwicklung von Mechanismen für die zuständigen Expression rekombinanter Proteine ​​in Pflanzen in den Jahrzehnten seit den ersten Versuchen hat das Potenzial für eine Anlage-basierte Systeme, um die aktuelle Paradigma der Protein-Produktion für drei Hauptgründe verändern erstellt. Erstens gibt es eine bemerkenswerte Abnahme der Kosten als Säugetier-, Insekten und Bakterien Bioreaktoren erfordern erhebliche Anlaufkosten, teure Nährmedien und komplizierte Prozesse für Downstream-Reinigung 4. Die Schaffung von stabilen transgenen PflanzeLinien ermöglicht ihnen auch die Skalierbarkeit der Systeme übertreffen anderen Ausdruck als Protein exprimieren Pflanzen angebaut und geerntet werden in einem landwirtschaftlichen Skala 5. Zweitens, auf pflanzlicher Basis Ausdruck Systeme deutlich reduzieren das Risiko der Übertragung eines menschlichen oder tierischen Erreger aus dem Protein-Expression Host für den Menschen, zeigt Überlegenheit in der öffentlichen Sicherheit 6. Schließlich verwenden Pflanzen einen eukaryotischen Endomembransystem ähnlich Säugerzellen ist, für eine angemessene posttranslationale Modifikation von Proteinen einschließlich Glycosylierung und der Zusammenbau von mehreren Untereinheit Proteine ​​7. Diese Fähigkeit bringt pflanzliche Systeme vor solche auf Basis von prokaryotischen Systemen, wie Bakterien, da eine größere Anzahl von pharmazeutischen rekombinanten Proteinen, einschließlich monoklonale Antikörper (mAbs), eine kompliziertere Struktur und erfordern umfangreiche posttranslationale Modifikationen oder Anordnung 8. Es gibt zwei große entspreschmerzt zu Expression rekombinanter Proteine ​​in Pflanzen. Die erste ist die Entwicklung einer stabilen transgenen Linie, wobei DNA, die für das Zielprotein in eine Expressionskassette kloniert und eingeführt, um die Kern-oder Chloroplastengenome nicht. Dabei wird die Fremd-DNA durch die nachfolgenden Generationen vererbbar und ermöglicht enorm verbesserte Skalierbarkeit, weit über die anderer Expressionssysteme 1. Einführung von exogener DNA in das Kerngenom wird normalerweise durch Agrobacterium tumefaciens Infektion von Pflanzengewebe erreicht oder, seltener, durch Mikroprojektilbeschuss des Gewebes 9. Pflanzenhormone werden dann verwendet, um die Differenzierung und das Wachstum von transgenen Pflanzengewebe wie Wurzeln und Blätter zu induzieren. Transformation des Chloroplasten-Genom nicht erreicht werden A. tumefaciens, sondern verlässt sich ganz auf Gold-oder Wolfram-Partikel mit DNA beschichtet gefeuert ballistisch in Pflanzenzellen. Das zweite Verfahren zur Expression Rekombinationnt-Protein in Pflanzen durch transiente Expression 10. In diesem Szenario werden Virus-abgeleiteten Vektoren, die das Gen von Interesse via A. geliefert tumefaciens zu voll entwickelten Pflanzen durch einen Prozess namens Agroinfiltration. Statt der Integration in das pflanzliche Genom, wird die gelieferte Genkonstrukt dann damit beginnen, die transiente Produktion des gewünschten Proteins, die geerntet und nach kurzer Inkubationszeit isoliert werden zu lenken. Transient Genexpression bietet den Vorteil einer größeren allgemeinen Protein-Akkumulation sowie einer verbesserten Zeit von Protein-Produktion, wie die Pflanzen bereit sein wird, ca. 1-2 Wochen nach Agroinfiltration 11 ernten. Dies ist deutlich schneller als die Prozesse der Erzeugung, Auswahl und Bestätigung von stabilen transgenen Linien, die mehrere Monate dauern kann bis zu einem Jahr. Dies ist aber auch die Begrenzung der transienten Expressionssystem, da es nicht ergeben genetisch stabile Anlage lines, die verwendet werden, um eine Samenbank für groß angelegte kommerzielle Produktion erzeugen kann. Trotzdem haben Ansätze entwickelt worden, um in großem Maßstab transiente Expression zu verbessern. Hier zeigen wir eine Methode zur Erzeugung von transienten Protein-Expression Nicotiana benthamiana Pflanzen mittels viraler Vektoren dekonstruiert von A. geliefert tumefaciens. Zwei wichtige Methoden werden für die Lieferung von A. entwickelt tumefaciens in Pflanzengewebe: bench scale Infiltration über eine Spritze und große Infiltration über Vakuumkammer. Beide Protokolle werden hier mit N. beschrieben benthamiana, die eng mit der gemeinsamen Tabakpflanze verwandt ist, als Wirtspflanze für transiente Expression von zwei fluoreszierende Proteine: das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Qualle Aequorea victoria und der rot fluoreszierendes Protein aus Discosoma Koralle (DsRed) 12,13. N. benthamiana ist die häufigste Wirtspflanzerekombinantes Protein, weil es zugänglich für genetische Transformation ist, können große Mengen an Biomasse rasch ergeben, und ist ein überaus produktiver Saatguthersteller für Scale-up-Produktion 14. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von N. benthamiana als Gastgeber für die Proteinexpression ist die Verfügbarkeit einer Vielzahl von Expressionsvektoren 2,5. In dieser Studie wurden zwei dekonstruiert virale Vektoren, eine auf einer Tabak-Mosaik-Virus (TMV) RNA Replikon System (magnICON Vektoren) und die andere von der Bohne yellow dwarf virus (BeYDV) DNA Replikon System (geminiviral Vektoren) 4,11 ermittelt, die 15-18, werden verwendet, um die GFP und DsRed-Gen tragen und sie geben in N. benthamiana Zellen über A. tumefaciens. Drei DNA-Konstrukte für GFP oder DsRed Expression mit magnICON Vektoren verwendet werden. Dazu gehören das 5&#39;-Modul (pICH15879), das den Promotor und andere genetische Elemente für den Antrieb der Expression des Ziel-Gens, das 3&#39;-Modul, das das Gen von Interesse (PICH-GFP oder PICH-DsRed) und der Integrase-Modul (pICH14011) für ein Enzym codiert, das die 5 &#39;und 3&#39;-Module miteinander integriert bei Expression 8,15. Drei DNA-Konstrukte werden auch für die Expression mit geminiviral Vektoren benötigt. Zusätzlich zu Vektoren, die Replikon des Zielgens (pBYGFP oder pBYDsRed) ist ein Vektor, der für die Replikation Protein (pREP110) für die Amplifikation der Ziel-Replikon 11,14,16 erforderlich. Darüber hinaus ist die Einbeziehung eines Vektors Codieren des Silencing Suppressor p19 aus Tomate buschigen stunt virus für hohe Zielgenexpression 11,16 gewünscht. Im Allgemeinen gibt es drei wesentliche Schritte zur Einführung von Genen von rekombinanten Proteinen in Pflanzenzellen durch Agroinfiltration einschließlich Pflanzenwachstums, A. tumefaciens Kultur Vorbereitung und Infiltration. Da jeder Schritt ist entscheidend für den letztendlichen Erfolg dieses Verfahrens daher wird eine detaillierte Beschreibung für jede vorgesehen istsowohl für Spritze Infiltration und Vakuuminfiltration unten.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V353-20</td>
			<td><a href="http://www.invitrogen.com/" target="_blank">www.invitrogen.com</a> See reference: Lico and Chen, et al 2008</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632152</td>
			<td><a href="http://www.clontech.com/" target="_blank">www.clontech.com</a> See reference: Baird and Zacharias, et al 2000</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MagnICON Vector</td>
			<td>Icon Genetics</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.icongenetics.com/" target="_blank">www.icongenetics.com</a> See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Geminiviral Vector</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See reference: Chen and He, et al 2011</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>N. benthamiana</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.herbalistics.com.au" target="_blank">herbalistics.com.au</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens strain gv3101</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See reference: Lai and Chen 2012</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LB Agar Carbenicillin-100, plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0418</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LB Agar Kanamycin-50, plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0543</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Magnesium sulfate hepa hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773-500 g</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>Becton, Dickinson &amp; CO.</td>
			<td>REF 212750</td>
			<td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difco Nutrient Broth</td>
			<td>Becton, Dickinson &amp; CO.</td>
			<td>REF 234000</td>
			<td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MES hydrate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-1kg</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1613-1ML</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70560-51-9</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Jack's Fertilizer</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>Jul-25</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vacuubrand MD4 Vacuum Pump</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-878-113</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vacuum Air Regulator Valve</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9386590</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Desiccator 12 1/8" with O ring</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-594-15C </td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>3 L Tub</td>
			<td>Rubber-Maid</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Rubbermaid Servn' Saver Bowl, 10-cup will work</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>plate/shelf 230ML</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9489269</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peat Pellet</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>14-2370-1</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propagation Tray Dome</td>
			<td>hydrofarm</td>
			<td>132052</td>
			<td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propagaiton Tray</td>
			<td>hydrofarm</td>
			<td>138758</td>
			<td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Virbo Hand Seeder</td>
			<td>Gro-Mor INC</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.gro-morent.com/" target="_blank">www.gro-morent.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flora Cart 4 shelf</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>65-6924-1</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Round Bottom Culture Tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430172-500EA</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectrophotometer Cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>223-9950</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2500</td>
			<td><a href="http://www.usascientific.com/" target="_blank">www.usascientific.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>166-0602EDU</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubator/Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td><a href="http://www.eppendorf.com/" target="_blank">www.eppendorf.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultraviolet Light Model#: UVGL-25</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0021-12</td>
			<td><a href="http://www.uvp.com/" target="_blank">www.uvp.com</a></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins

Säugerzellen ist das wichtigste Plattform für die kommerzielle Produktion von menschlichen Impfstoffen und therapeutischen Proteinen. Allerdings kann es nicht die steigende weltweite Nachfrage nach Arzneimitteln wegen seiner begrenzten Skalierbarkeit und hohe Kosten. Pflanzen haben gezeigt, dass eine der vielversprechendsten alternativen pharmazeutischen Produktion Plattformen, die robuste, skalierbare, kostengünstige und sicher sind. Die jüngste Entwicklung von Virus-basierten Vektoren hat rasche und High-Level transiente Expression von rekombinanten Proteinen in Pflanzen erlaubt. Zur weiteren Optimierung der Nützlichkeit des transienten Expressionssystem zeigen wir eine einfache, effiziente und skalierbare Methode zur Target-Gen, das in Agrobacterium Pflanzengewebe einzuführen in dieser Studie. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl mit Agroinfiltration Spritze und Vakuumverfahren bei der effizienten Einführung von Agrobacterium in Blätter und robuste Produktion von zwei fluoreszierenden Proteinen geführt haben; GFP und DsRed. Fernerdemonstrieren wir die einzigartigen Vorteile von beiden Methoden angeboten. Spritze Infiltration ist einfach und braucht keine teure Ausrüstung. Es ermöglicht auch die Flexibilität, um entweder die gesamte infiltrieren verlassen mit einem Ziel-Gen oder von Genen von mehreren Zielen auf ein Blatt einzuführen. So kann es für Labormaßstab Expression rekombinanter Proteine ​​sowie für den Vergleich verschiedener Proteine ​​oder Vektoren für die Ausbeute oder Expressionskinetik verwendet werden. Die Einfachheit der Spritze Infiltration schlägt auch ihre Nutzbarkeit in der High School und College-Ausbildung für das Fach Biotechnologie. Im Gegensatz dazu ist Vakuuminfiltration robuster und Scale-Up für die kommerzielle Herstellung von pharmazeutischen Proteinen. Es bietet auch den Vorteil, dass sie in der Lage, Pflanzenarten, die nicht zugänglich sind für Spritze Infiltration wie Salat und Arabidopsis agroinfiltrate. Insgesamt bietet die Kombination aus Spritze und Vakuum Agroinfiltration Forscher und Pädagogen eine einfache, effiziente und robusteMethodik für die transiente Proteinexpression. Es wird dadurch wesentlich erleichtert die Entwicklung von pharmazeutischen Proteinen und Förderung von Wissenschaft Bildung.

1. Expression von fluoreszierenden Proteinen durch Spritze Infiltration Um die Wirksamkeit der Spritze Infiltration von Agrobacterium in Pflanzengewebe zu demonstrieren, testeten wir die Expression von zwei fluoreszierenden Proteinen - GFP und DsRed - von zwei verschiedenen dekonstruiert Anlage virale Vektoren - geminiviral und magnICON - in N. benthamiana. Für N. benthamiana Blätter, die vollständig mit Agrobakterien haltigen geminiviral Vektoren wurden i...

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Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Pflanzen bieten ein neuartiges System für die Produktion von pharmazeutischen Proteinen in einem kommerziellen Maßstab, die besser skalierbare, kosteneffiziente und sichere als aktuellen Ausdruck Paradigmen ist. In dieser Studie berichten wir über eine einfache und bequeme, aber skalierbaren Ansatz zur Ziel-Gen enthält, einführen<em&gt; Agrobacterium tumefaciens</em&gt; In Anlagen zur Protein transiente Expression.

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

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Research

JoVE Journal

Biology

47.7K Aufrufe.  Arizona State University. Pflanzen bieten ein neuartiges System für die Produktion von pharmazeutischen Proteinen in einem kommerziellen Maßstab, die besser skalierbare, kosteneffiziente und sichere als aktuellen Ausdruck Paradigmen ist. In dieser Studie berichten wir über eine einfache und bequeme, aber skalierbaren Ansatz zur Ziel-Gen enthält, einführen Agrobacterium tumefaciens In Anlagen zur Protein transiente Expression.

Serie: Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Expression von rekombinanten Proteinen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Effizienten Herstellung und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 von Insektenzellen für biophysikalische Studien

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Transiente Expression von Proteinen durch Hydrodynamische Gentransfer in Mäusen

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

Basierend HeLa Zellfreie Expressionssysteme zur Expression von<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteine

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

Vorübergehende Expression und zelluläre Lokalisation von rekombinanten Proteinen in gezüchteten Insektenzellen

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

In Planta transiente Transformation von Kakaopflanzen mit Agrobacterium tumefaciens

Vacuum-Forced Agroinfiltration for In planta Transformation of Recalcitrant Plants: Cacao as a Case Study

Transient in planta transformation is a fast and cost-effective alternative for plant genetic transformation. Most protocols for in planta transformation rely on the use of Agrobacterium-mediated transformation. However, the protocols currently in use are standardized for small-sized plants due to the physical and economic constraints of submitting large-sized plants to a vacuum treatment. This work presents an effective protocol for localized vacuum-based agroinfiltration customized for large-sized plants. To assess the efficacy of the proposed method, we tested its use in cacao plants, a tropical plant species recalcitrant to genetic transformation. Our protocol allowed applying up to 0.07 MPa vacuum, with repetitions, to a localized aerial part of cacao leaves, making it possible to force the infiltration of Agrobacterium into the intercellular spaces of attached leaves. As a result, we achieved the Agrobacterium-mediated transient in planta transformation of attached cacao leaves expressing for the RUBY reporter system. This is also the first Agrobacterium-mediated in planta transient transformation of cacao. This protocol would allow the application of the vacuum-based agroinfiltration method to other plant species with similar size constraints and open the door for the in planta characterization of genes in recalcitrant woody, large-size species.

Autor im Rampenlicht: Gewebekulturfreie Agrobakterien-vermittelte Transformation in großen Gehölzen

Here, we present the first protocol for localized vacuum infiltration for in vivo studies of the genetic transformation of large-sized plants. Using this methodology, we achieved for the first time the Agrobacterium-mediated in planta transient transformation of cacao.

Vakuumforcierte Agroinfiltration zur In-planta-Transformation widerspenstiger Pflanzen: Kakao als Fallstudie

Transient in planta transformation is a fast and cost-effective alternative for plant genetic transformation. Most protocols for in planta transformation ...