Diese Arbeit wurde durch das BMBF Forschungsinitiative unterstützt &quot;BioEnergie 2021 - Forschung für sterben nutzung von Biomasse&quot; und der Exzellenzcluster &quot;Maßgeschneiderte Kraftstoffe aus Biomasse&quot;, die durch die Exzellenzinitiative des Bundes und der Länder gefördert wird, die Wissenschaft zu fördern und Forschung an deutschen Hochschulen.

1. Wachstum von Wildtyp N. tabacum Pflanzen <ol><li> Um N. wachsen tabacum L. cv. Petit Havana SR1 Pflanzen auf Erde, legen Tabaksamen über geeignete Töpfe mit normaler Blumenerde für die Keimung gefüllt. Nach 2 Wochen übertragen Sämlinge auf einzelne Töpfe. Inkubieren Pflanzen in einem Gewächshaus mit konstanten 22 ° C (dunkle Zeit) bzw. 25 ° C (Lichtperiode) und die relative Luftfeuchte 70%. Geben Beleuchtung in einem 16/8 h Licht / Dunkel-Zyklus (zB Philips IP65 400 W-Lampen, 180 mmol · s -1 · m -2; λ = 400-700 nm) und Wasser täglich. </li></ol> 2. Transiente Expression von TrCel5A und TrCel5A-Proteine ​​mCherry <ol><li> Unter sterilen Bedingungen, nehmen einzelne Kolonien von Agarobacterium tumefaciens (GV3101 :: pMP90RK GMR, KmR, RifR), die entweder pTRAkc-ER-TrCel5A oder pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry und Transfer zu einem Erlenmeyerkolben mit 10 ml HefeextraktBrühe (YEB, nach Herstellerangaben hergestellt) Medium und Kanamycin (50 mg / ml), Rifampicin (50 mg / ml) und Carbenicillin (100 mg / ml) für die Selektion. Inkubation für 36-40 Stunden bei 26 ° C und 180 UpM. Hinweis: Die Gestaltung geeigneter Konstrukte für die Proteinexpression ist außerhalb des Geltungsbereichs dieses Papier, sondern zur Orientierung, können die Verfahren der Maclean et al 13 und Munro und Pellham 14 für Konstrukt Design folgen.. </li><li> Nehmen Sie 200 &amp;mgr; l jeder Kultur zu 20 ml YEB mit den oben genannten Konzentrationen an Antibiotikum zu inokulieren und Inkubation unter den gleichen Bedingungen wie zuvor. </li><li> Nach 36-40 h preinduce die Kulturen durch Zugabe von 2 &amp;mgr; l Acetosyringon (200 &amp;mgr; M Endkonzentration), 100 &amp;mgr; l 40% (w / v) Glucoselösung und 200 &amp;mgr; l 1 M MES-Puffer pH 5,6. Inkubieren über Nacht. </li><li> Es werden 100 ml einer Infiltration 2x Puffer (100 g / l Saccharose, 3,6 g / l Glucose, 8,6 g / l Murashige und Skoog-Basalsalze, PH-Wert auf 5,6 mit Kaliumhydroxid). </li><li> Messen OD 600 der Kulturen mit 1.05 Verdünnungen bis eine OD 600 von 5-6 erreicht. Berechnen Kulturvolumen von 30 ml Infiltrationsmedium benötigt bei OD 600. 15 ml 2x Infiltration Puffer, dann fügen deionisiertem H 2 O, um den Puffer auf 30 ml zu machen. </li><li> Nehmen Sie Pflanzen aus Gewächshaus und eine Pipettenspitze verwenden, um den nick abaxial Seite der 3. bis 5. Blatt von oben, um die Infiltration zu erleichtern. </li><li> Verwenden Sie eine Pipettenspitze nick die unterseits der Blätter, um die Infiltration zu erleichtern. </li><li> Füllen Sie eine Spritze mit Infiltrationsmedium und legen Sie sie (ohne Nadel) auf einem der bisherigen Nicks. Unterstützen Spritze mit einem Finger auf dem adaxial Blatt Seite. Drücken Sie das Medium vorsichtig in das Gewebe zwischen den Blattblattzonen. Anmerkung: Nach der Infiltration pflegen Pflanzen im Gewächshaus unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben. Auch pflegen einen gleichen Anteil von untreated, nicht-transiente Expressionspflanzen (NTEPs) als Kontrollen, unter den gleichen Bedingungen wie infiltrierten Pflanzen. </li></ol> 3. Beurteilung der TrCel5A-mCherry Expression in Pflanzenblätter <ol><li> Nach 4-6 Tagen nehmen Pflanzen mit A. infiltriert tumefaciens enthält pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry aus dem Gewächshaus und legen Sie sie in einem dunklen Raum für die Fluoreszenzanalyse. </li><li> Um die Fluoreszenz in Blattstücke ausdrücken TrCel5A-mCherry, Lichtanlagen mit einem tragbaren Lichtquelle, die grünes Licht bei 515 nm mit einem roten Filter (620-750 nm) zu visualisieren. Hinweis: In Tiefe Charakterisierung von Protein-Expression in den Pflanzenblättern durch Dünnschnitt Blätter mit einem Vibratom und Prüfung unter Licht-und Fluoreszenzmikroskopie erreicht werden. Dazu gehen Sie folgendermaßen vor: <ol><li> Schneiden kleine Abschnitte von ca. 5 x 5 mm Größe aus einer infiltrierten Blatt und betten sie in 4% Agarose in 50 mM Phosphatpuffer gelöst (pH 5,7). </li><li> CutAbschnitt von 80-90 um der Größe von Embedded-Blätter mit einem Vibratom. Legen sie auf einen Objektträger, Deckel mit Puffer oder ein Deckglas und untersuchen sie mit einem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung mit einem Fluoreszenzdetektor unter Verwendung der gleichen Wellenlänge und Filter oben angegeben. </li></ol></li></ol> 4. TrCel5A Extraktion aus Tabakblättern <ol><li> Schneiden Sie Stücke aus Tabakblättern zu einem ungefähren Gewicht von 1 g aus Pflanzen mit A. infiziert tumefaciens enthält pTRAkc-ER-TrCel5A und in einem Mörser mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt. Hinzufügen einer geeigneten Menge von flüssigem Stickstoff auf den Proben. Grind Blätter zu Pulver mit Hilfe eines vorgekühlten Stößel. </li><li> 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid auf den Boden Blatt Materie und mischen, bis die Mehrheit der Blatt Materie in Suspension. Zentrifuge Extrakt bei 15.000 × g für 20 min bei 4 ° C an, um Protein-haltige Überstand. </li><li> Centrifuge der Extrakt bei 15.000 g für 20 min bei 4 ° C und nehmen proteinhaltigen Überstand man aufpassen, nicht, um das Pellet zu stören. Entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Teilweise zu reinigen TrCel5A durch Inkubation der proteinhaltigen Überstands bei 55 ° C für 10 min. Bei Raumtemperatur für weitere 10 min ruhen, dann Zentrifugieren bei 15.000 xg für 10 min bei RT. Wiederholen Teilreinigungsverfahren für nicht-infiltrierten Pflanzen zu Kontrollproben zu erhalten. Mit diesen Proben für alle folgenden Versuche. Achtung: Die Proteinlösungen bei 4 ° C für bis zu 1 Woche bei -20 ° C für bis zu 3 Monate aufbewahrt werden. </li><li> Wiederholen Sie die Teilreinigungsverfahren für nicht-infiltrierten Pflanzen zu Kontrollproben zu erhalten. Mit diesen Proben für alle folgenden Versuche. Achtung: Die Proteinlösungen bei 4 ° C für bis zu 1 Woche bei -20 ° C für bis zu 3 Monate aufbewahrt werden. </li></ol> 5. SDS-PAGE, Western Blot und Azo-Zymographie von CMC TrCel5A-mCherry &lt;/ P&gt; <ol><li> Kauf oder bereiten 12% (w / v) SDS-PAGE-Gelen nach etablierten Methoden 15. </li><li> CMC in Wasser auflösen, um eine 1,5% (w / v) Lösung zu erhalten. CMC-SDS-PAGE-Gelen zu machen, ersetzen 1 ml 1,5% CMC zu 1 ml Wasser in einem 10 ml SDS-PAGE-Gel-Mix-Lösung, was zu einer 0,1% (w / v) CMC + 12% (w / v ) SDS-PAGE-Gel-Mix. Gießen Gel normal. Hinweis: Sicherstellen, dass die CMC in der ursprünglichen Lösung ist vollständig durch eine Kombination von Rühren und Erwärmen auf 40 ° C gelöst (Wiederholung direkt vor der Herstellung der Gel-Lösung). </li><li> Denaturieren Proben durch Kochen in Gegenwart von SDS, nach etablierten Methoden 12. Als positive Kontrolle, verwenden Sie eine 1:500-Verdünnung eines kommerziell erhältlichen Cellulase Mischung aus T. reesei, wie T. reesei ATCC 26921. Als Negativkontrolle mit einem ähnlich hergestellten Proteinlösung aus nicht-infiltrierten Blätter (NTEPs). </li><li> Führen Sie die Elektrophorese wie für normale Protokolle 15,zB verwenden, 200 V für ~ 50 min mit der Elektrophorese gestoppt, sobald der Farbstofffront das Ende des Gels erreicht. </li><li> Fleck eine SDS-PAGE-Gel unter Verwendung von 0,1% (w / v) Coomassie-Brilliantblau und Entfärbung unter Verwendung eines Methanol / Eisessig-Gemisch. Hinweis: Schnellfärbung und Entfärbung kann durch leichtes Erwärmen der Färbung und Entfärbung Lösungen, dh durch Verwendung einer Mikrowelle für ~ 15 Sek. erwärmen (aber nicht kochen) zunächst die Färbung und dann die Entfärbung Lösungen, die Änderung der Entfärbelösung nach 10 Minuten durchgeführt werden oder wenn sie abgekühlt, und wiederholen Sie mit neuen Entfärbelösung. </li><li> Führen eines Western-Blotting SDS-PAGE-Gel unter Verwendung etablierter Protokolle 16,17. Mit den folgenden Antikörpern: ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen ein His-tag (primären) und einem polyklonalen Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper-Fc-Region, die zu einer alkalischen Phosphatase (sekundäre) konjugiert wurde. Hinweis: Sekundärantikörper sollten ausgewählt werden, um Visualisierung mit Nitro Tetrazol ermöglichenium chloride/5-bromo-4-chloro-3 &#39;-p-indolyphosphate Toluidinsalz (NBT / BCIP), wie beschrieben 18. </li><li> Führen in-Gel-Protein-Rückfaltungs auf 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE-Gel, das durch Inkubation des Gels in 1,5% (w / v) β-Cyclodextrin, 20 mM Phosphat-Citrat-Puffer, pH 6,5, bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln 15 min 19. </li><li> Entsorgen Sie die β-Cyclodextrin-Lösung und kurz waschen das Gel mit H 2 O. Inkubieren bei Raumtemperatur in 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 4,8) für 15 min. Führen CMC-Zymographie unter Verwendung des rückgefalteten 0,15% CMC SDS-PAGE-Gel durch Inkubation des Gels in 30 mM Natriumacetat-Puffer pH 4,8 für 20 min bei 50 ° C. </li><li> Führen CMC-Zymographie unter Verwendung des rückgefalteten 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE-Gel durch Inkubation des Gels in 30 mM Natriumacetat-Puffer (pH 4,8) für 20 min bei 50 ° C. </li><li> Färben Sie das Gel für 10 min mit einer 0,1% w / v Kongo rote Lösung entfärben und für 30 Minuten oder bis klar Bänder werden mit 1 M Na beobachtetCl. Mit 0,3% (v / v) Essigsäure für klarere Abbildungs ​​Waschen des Gels. </li></ol> 6. 4-MUC Aktivitätstest von TrCel5A <ol><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM 4-MUC in 50% (v / v) Methanol, und speichern sie in der Dunkelheit bei RT </li><li> Unmittelbar vor dem Test, bereiten ein 4-MUC 2x Arbeitslösung von 1 mM 4-MUC zusammengesetzt und 60 mM Natriumacetat, pH 4,8. </li><li> Diese Prüfung auf Proben mit 100 ul Protein-Blatt (mit oder ohne TrCel5A induzierbar exprimiert), 100 &amp;mgr; l einer im Handel erhältlichen Mischung aus Cellulase T. reesei 1:1.000 und reinem H 2 O auf. Führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Je 100 ul der 4-MUC-Arbeitslösung in einzelne Wells einer 96-Well-Platte, dann fügen Sie 100 ul jeder Probe. </li><li> Bestimmen Zeitpunkt 0 min von 4-MU-Fluoreszenz durch Fluoreszenzspektroskopie unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm auf. </li><li> Inkubation erfolgt während 20min bei 50 ° C, mit Klebstoff Deckel abgedeckt, um Verdampfung zu verhindern. Stoppen der Reaktion durch Einfrieren (oder durch Kombinieren von 100 &amp;mgr; l 0,15 M Glycin, pH 10,0, und 100 ul der Probe in einer separaten Platte). </li><li> Bestimmen den Endpunkt der 4-MU-Fluoreszenz durch Fluoreszenzspektroskopie unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm auf. Subtrahieren von 0 min Endpunkt (20 min) Zeitpunkt, um die Änderung in der Fluoreszenzwerte zu erhalten. </li></ol> 7. Azo-Carboxymethyl Cellulose Aktivitätstest von TrCel5A <ol><li> Bereiten Sie einen Bestand von 1,5% (w / v) Azo-CMC, die bei Raumtemperatur gelagert wird, und eine Fällungslösung mit 18 mM Zink-Acetat, 0,5 M Natriumacetat, pH 5 und 80% Ethanol (v / v), bei Zimmer Temperatur. </li><li> Unmittelbar vor dem Assay Vorbereiten eines Azo-CMC 2x Arbeitslösung, bestehend aus 1% (w / v) Azo-CMC (in H 2 O) und 60 mM Natriumacetat, pH 4,8. </li><li> Kombinieren 50 ul Probe und 50 ul des Arbeitsten Lösung in 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Testproben, die 50 ul Blatt Protein (mit oder ohne TrCel5A transient exprimiert); 100 &amp;mgr; l eines handelsüblichen Cellulase-Mischung aus T. reesei verdünnt 1:1000; und reinem H 2 O. Führen Proben und Standards in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Proben für 20 min Inkubation bei 50 ° C. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 250 ul Fällungslösung. Vortex jede Probe kräftig für 10 Sekunden, um sicherzustellen, Lösungen wurden vollständig zusammen. </li><li> Proben Inkubation bei RT für 10 min und dann wieder Wirbel. Zentrifuge Proben bei 1000 g für 10 min. Entfernen 200 ul jeder Probe Überstand auf eine 96-Well-Platte, kümmert sich nicht um das Pellet zu stören. </li><li> Assay unter Verwendung von Absorptionsspektroskopie bei einer Wellenlänge von 590 nm aufweist. </li></ol> 8. PAHBAH Test der TrCel5A <ol><li> Verwenden Sie einen Locher, um einen Kreis (~ Durchmesser 5,5 mm) aus Filterpapier geschnitten. 100 l 60 mM NaAc, pH 4,8 und 100 ul-Proben, enthaltend entweder Blatt-Protein (mit oder ohne TrCel5A induzierbar exprimiert) oder eine kommerzielle T. reesei Cellulase Mischung 1:1000 verdünnt, und Inkubation mit Filterpapier Kreise für 20 Stunden bei 50 ° C mit 300 rpm schütteln. Für jede Probe mit Filterpapier inkubiert, auch inkubieren eine doppelte Lösung ohne Filterpapier als individuelle Probe-Kontrollen. </li><li> Vorbereitung einer 330 mM p-Hydroxybenzoesäure (PAHBAH) Lösung A durch Auflösen PAHBAH in H 2 O unter Zugabe von 5 ml konzentrierter HCl für insgesamt 100 ml Lösung, und Lagern bei RT. Hinweis: Die besten Ergebnisse werden durch Zugabe von HCl auf einen kleineren Volumen PAHBAH Aufschlämmung, dh 30 ml, der unter Temperatur gerührt wird, um die Auflösung, bevor das Volumen auf 100 ml mit H 2 O gelöst helfen </li><li> Bereiten PAHBAH Lösung B, die 50 mM Natriumcitrat, 10 mM Calciumchlorid und 500 mM NaOH und lagern bei RT. </li><li> Immediately vor dem Test, bereiten eine 1,5 x Arbeitslösung von 1 ml PAHBAH Reagenz zu 9 ml Pufferlösung auf Eis aufbewahren bis zur Verwendung (innerhalb von 4 Stunden verwendet werden). </li><li> Bereiten Proben in thermo 0,2 oder 0,5-ml-Röhrchen. Kombinieren 5 ul jeder Lösung mit Filterpapier (Schritt 8.1), 45 ul H &amp;sub2; O und 100 ul PAHBAH Arbeitslösung inkubiert. Probenkontrollen (Proben ohne Filterpapier inkubiert) sollte unter den gleichen Konzentrationen (5 ul Probe, 45 ul H 2 O, 100 ul PAHBAH Arbeitslösung) ausgeführt werden. Auch testen 5 Standards (5 ul), die zwischen 0 und 0,2 g / l Glucose und reinem H 2 O. Führen Proben und Standards in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Proben inkubieren genau 10 min bei 100 ° C, dann bei RT abkühlen genau 10 min. Pipette Lösungen in eine 96-Well-Platte und Assay-spektroskopisch bei einer Wellenlänge von 410 nm aufweist. Subtrahieren Sie einzelne Probe-Kontrollen (ohne Filterpapier inkubiert) aus Proben endgültig zu erhaltenWerte. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Rekombinante Expression von Cellulasen ist ein Feld von großem Interesse, auf den Wunsch nach effizienteren Produktion von Biokraftstoffen Systeme ein. Pflanzen bieten viele Möglichkeiten für eine erfolgreiche Cellulaseproduktion, mit Funktionen wie wirtschaftliche Erntetechniken und Methoden Autohydrolyse sehr wünschenswerte Eigenschaften für eine groß angelegte Produktion von Biokraftstoffen. Ferner ist die Verwendung von verschiedenen Lokalisierungen zur Herstellung von Proteinen erlauben, falls erfo...

<html> Der Abbau von Lignocellulose-Biomasse und deren Umwandlung in flüssigen Kraftstoff als ein Verfahren, um die Abhängigkeit von fossilen Brennstoffen verringern vorgestellt worden. Eine wesentliche Hürde bei der Gründung wirtschaftlich machbar Biomasse Verarbeitungssysteme ist in den enzymatischen Abbau von Cellulose und Hemicellulose ein. Pflanzenexpressionssystemen zeigen großes Potenzial für die Produktion von Enzymen im industriellen Maßstab. Landwirtschaftliche Anlagen bis zur Ernte Pflanzen wirtschaftlich und Volumen bereits etabliert sind, wie sie seit Tausenden von Jahren. Die Produktion von Cellulasen in Pflanzen aufgrund von Faktoren wie die Leichtigkeit der Autohydrolyse 2, und das Potential für die Maximierung der Verwendung von geringeren Enzymmengen durch die Erhöhung der Verdaulichkeit von Pflanzenzellwänden 1 wünschenswert. Schließlich Anlagensysteme ermöglichen die Ausrichtung von rekombinanten Proteinen, um bestimmte Bereiche von Pflanzenzellen und sind in der Lage, Enzyme posttranslational wo erforderlich 3 ändern. ve_content &quot;&gt; Nicotiana tabacum (Tabak) ist sehr häufig als Modellorganismus für die heterologe Proteinexpressionsstudien in Pflanzen verwendet wird, durch sein schnelles Wachstum und Biomasseakkumulation verfügt über 4. Transiente Expression von rekombinanten Proteinen ist eine Technik, die die Proteinproduktion können in kurzen Zeitperioden 5, wobei die Flexibilität in Bezug auf die Lokalisierung und somit posttranslationale Modifikationen der Proteine ​​ausgewählt, dh Cellulasen. Dies ermöglicht die Herstellung der Cellulase (n) für die Grundlagenanalyse, aber auch die Grundlagen für weitere Expressionsstrategien in Pflanzen. Unter Verwendung eines solchen transienten Expressionsstrategie ist eine Endoglucanase aus Glykosylhydrolase Familie 5, Cel5A von der Pilzwirts Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) abgeleitet 6 hergestellt (nachstehend als TrCel5A bezeichnet). TrCel5A ist ein 42 kDa Protein, das nativ glykosyliert ist und in hyd hochaktivenroylzing Celluloseketten 7. Die transiente Expression Technik hier beschrieben wird, auf einem relativ häufigsten verwendete System basiert, Infiltrieren des Pflanzenblätter mit Agrobakterien, die das Gen von Interesse in einen geeigneten Expressionsvektor. Um für eine schnelle Analyse der in planta Ausdruck erfolgreich zu ermöglichen, können TrCel5A auch als Fusionsprotein mit mCherry, einer monomeren fluoreszierenden Protein ursprünglich aus Discosoma sp ausgedrückt werden. Protein DsRed 8, mit weiteren sechs Histidin-Reste (His-Tag) fusioniert der C-Terminus (TrCel5A-mCherry). Expression der heterologen Fusionsprotein, TrCel5A-mCherry, kann somit innerhalb der wachsenden Pflanze durch Verwendung von grünem Licht zu untersuchen mCherry Verbreitung überwacht werden. Wenn gewünscht, kann Dünnschnitte des Pflanzenmaterials unter grünem Licht mikroskopisch untersucht werden, um die spezifische Lokalisation des Proteins zu etablieren. Für diese Arbeit, Signal-und Übersitzen Peptide wurden in das Konstrukt eingebracht, um das heterologe Protein den Export nach dem endoplasmatischen Retikulum 9 lokalisieren. Zur Analyse der Aktivität der Pflanze exprimiert Cellulasen, einschließlich TrCel5A eine Anzahl von Cellulase-Aktivitätstests ausgeführt werden kann. Nach der Extraktion der gesamten löslichen Pflanzenproteinen, kann TrCel5A teilweise unter Verwendung eines thermischen Inkubation Technik gereinigt werden. Proteingröße wird mit SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blot etabliert. Zymographie kann verwendet werden, um die Aktivität gegen Gründen, z. B. Zellulose, die seit Carboxy-methylierte hat zu analysieren (was Carboxymethylcellulose: CMC) für die Löslichkeit 10. Cellulase und Glucosidase-Aktivität kann mit dem Fluorophor 4-Methylumbelliferyl-(4-MU) mit β-D-cellobiosid assoziiert (4-MUC kombiniert) überwacht werden. Ein weiteres Verfahren zur Endoglucanase-Aktivität zu beurteilen beinhaltet die spektrometrische Analyse der CMC, die mit einer Azo-d zugeordnet worden istihr (Remazolbrilliant Blue R) 11. Darüber hinaus können Protein-Aktivität beider Endoglucanasen und eine Reihe von Cellulasen, die durch die Verwendung einer Zuckeranalyse Test, wie der p-Hydroxybenzoesäure (PAHBAH) Test 12 überwacht werden. Diese Techniken können verwendet werden, um aufzuklären und Quantifizierung der Aktivität des exprimierten Cellulase von Interesse sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:308px;">4-methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside</td>
			<td style="width:127px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:156px;">M6018</td>
			<td style="width:232px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringon (concentrated)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - kanamycin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - rifampicin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - carbenicillin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - rabbit anti His(6) pAb</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-401-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb</td>
			<td>DIANOVA</td>
			<td>111-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Azo-carboxymethyl cellulose</td>
			<td>MEGAZYME</td>
			<td>S-ACMC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C4805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carboxymethyl cellulose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3333.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C2730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Congo red</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>75768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coomasie brilliant blue G 250</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>9598.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D(+)-glucose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>K928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter paper - Rotilabo blotting paper</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>CL67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NBT/BCIP</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>72091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES buffer</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium citrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Soil, Einheitserde classic&#160;</td>
			<td>PATZER GMBH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrometer - Infinite M200</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S-5390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Hydroxy benzhydrazide&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV light source - BLAK RAY</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibratome - VT1000S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of recombinant cellulase cel5a from trichoderma reesei in tobacco plants

Zellulose abbauende Enzyme, Cellulasen, sind Ziele der Forschung und industriellen Interessen. Das Übergewicht dieser Enzyme in schwer Kulturorganismen wie Hyphen bild Pilze und anaeroben Bakterien, ist die Verwendung von rekombinanten Technologien in diesem Bereich beschleunigt. Pflanzenexpressionsverfahren sind ein wünschenswertes System zur großtechnischen Herstellung von Enzymen und anderen industriell nützlichen Proteinen. Hierin sind Verfahren für die transiente Expression eines Pilz-Endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A in Nicotiana tabacum demonstriert. Erfolgreiche Proteinexpression angezeigt wird, durch Fluoreszenz mit einem mCherry-Enzym-Fusionsproteins überwacht. Zusätzlich ist ein Satz von Basistests werden verwendet, um die Aktivität von transient exprimierten T. prüfen reesei Cel5A, einschließlich SDS-PAGE, Western Blot, Zymographie, wie Fluoreszenz-und farbstoffbasierten Substratabbau Assays. Das hier beschriebene System kann auf eine aktive Zelle verwendet werdenULASE in einer kurzen Zeitperiode, um so das Potential für die weitere Produktion in Pflanzen durch konstitutive oder induzierbare Expressionssysteme zu beurteilen.

TrCel5A und TrCel5A-mCherry wurden erfolgreich in Tabakpflanzen unter Verwendung des transienten Expressionssystem (1A und 1B) ausgedrückt. Die Untersuchung der Expressionsmuster des TrCel5A mCherry-Fusionsprotein zeigte gesunde Blätter (1C), die weit verbreiteten Proteinexpression unter grünen Licht (1D) zeigte. Extraktion der gesamten löslichen Proteine ​​wurden auf Tabakpflanzen, die Blätter, die enthalten waren ...

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Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tabakpflanzen wurden verwendet, um eine Pilz-Cellulase, TrCel5A erzeugen, über einen transienten Expressionssystem. Die Expression kann unter Verwendung eines fluoreszierenden Fusionsproteins überwacht werden, und die Proteinaktivität wurde nach der Expression charakterisiert.

Expression von rekombinanten Cellulase aus Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In Tabakpflanzen

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

expression-recombinant-cellulase-cel5a-from-trichoderma-reesei

Research

JoVE Journal

Environment

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

12.7K Aufrufe.  RWTH Aachen University.  Tabakpflanzen wurden verwendet, um eine Pilz-Cellulase, TrCel5A erzeugen, über einen transienten Expressionssystem. Die Expression kann unter Verwendung eines fluoreszierenden Fusionsproteins überwacht werden, und die Proteinaktivität wurde nach der Expression charakterisiert. 

Serie: Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Forschung

Umwelt

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

Transcript und Metabolite Profiling für die Beurteilung von Tabakbaum und Pappel als Rohstoff für die Bio-basierte Industrie

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Mess Flüsse von Mineralstoffen und Giftstoffe in Pflanzen, die mit radioaktiver Tracer

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

Die Verwendung von hochauflösenden Infrarot-Thermografie (HRIT) für das Studium der Ice Ice Keimbildung und Ausbreitung in Pflanzen

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That represents 100 million tons of food being destroyed or diverted to non-human consumption each year. Aflatoxins are powerful carcinogens normally accumulated by the fungi Aspergillus flavus and A. parasiticus in cereals, nuts, root crops and other agricultural products. Silencing of five aflatoxin-synthesis genes by RNA interference (RNAi) in peanut plants was used to control aflatoxin accumulation following inoculation with A. flavus. Previously, no method existed to analyze the effectiveness of RNAi in individual peanut transgenic events, as these usually produce few seeds, and traditional methods of large field experiments under aflatoxin-conducive conditions were not an option. In the field, the probability of finding naturally contaminated seeds is often 1/100 to 1/1,000. In addition, aflatoxin contamination is not uniformly distributed. Our method uses few seeds per transgenic event, with small pieces processed for real-time PCR (RT-PCR) or small RNA sequencing, and for analysis of aflatoxin accumulation by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). RNAi-expressing peanut lines 288-72 and 288-74, showed up to 100% reduction (p&#8804;0.01) in aflatoxin B1 and B2 compared to the control that accumulated up to 14,000 ng.g-1 of aflatoxin B1 when inoculated with aflatoxigenic A. flavus. As reference, the maximum total of aflatoxins allowable for human consumption in the United States is 20 ng.g-1. This protocol describes the application of RNAi-mediated control of aflatoxins in transgenic peanut seeds and methods for its evaluation. We believe that its application in breeding of peanut and other crops will bring rapid advancement in this important area of science, medicine and human nutrition, and will significantly contribute to the international effort to control aflatoxins, and potentially other mycotoxins in major food crops.

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

We demonstrate a method for the analysis of aflatoxins and transgene expression in peanut seeds that contain RNA-interference signals for silencing aflatoxin-synthesis genes in the fungus Aspergillus flavus. RNAi-mediated control of mycotoxins in plants has not been reported previously.

RNAi-vermittelten Kontrolle der Aflatoxine in Peanut: Methode, um Mykotoxinproduktion und Transgenexpression in der Erdnuss-Analyse /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

Enhancement of the Initial Growth Rate of Agricultural Plants by Using Static Magnetic Fields

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing seeds of Garden Balsam (Impatiens balsamina), Mizuna (Brassica rapa var. japonica), Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis), and Mescluns (Lepidium sativum). We applied magnets under the culture dish. During the 4 days of application, we observed that the stem and root length increased. The group subjected to magnetic field treatment (n = 10) showed a 1.4 times faster rate of growth compared with the control group (n = 11) in a total of 8 days (p &#60;0.0005). This rate is 20% higher than that reported in previous studies. The tubulin complex lines did not have connecting points, but connecting points occur upon the application of magnets. This shows complete difference from the control, which means abnormal arrangements. However, the exact cause remains unclear. These results of growth enhancement of applying magnets suggest that it is possible to enhance the growth rate, increase productivity, or control the speed of germination of plants by applying static magnetic fields. Also, magnetic fields can cause physiological changes in plant cells and can induce growth. Therefore, stimulation with a magnetic field can have possible effects that are similar to those of chemical fertilizers, which means that the use of fertilizers can be avoided.

The goal of this protocol is to demonstrate the acceleration of the initial growth rate of plants by applying static magnetic fields with no external energy.

Verbesserung des Anfangswachstumsrate von landwirtschaftlichen Pflanzen durch statische Magnetfelder

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing ...

Assessment of Methane and Nitrous Oxide Fluxes from Paddy Field by Means of Static Closed Chambers Maintaining Plants Within Headspace

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based on the diffusion theory. A known volume of air overlaying a defined soil area is enclosed within a parallelepiped cover (named &#34;chamber&#34;), for a defined period of time. During this enclosure period, gases (methane (CH4) and nitrous oxide (N2O)) move from soil pore air near their microbial source (i.e., methanogens, nitrifiers, denitrifiers) to the chamber headspace, following a natural concentration gradient. Fluxes are then estimated from chamber headspace concentration variations sampled at regular intervals throughout the enclosure and then analyzed with gas chromatography. Among the techniques available for GHG measurement, the static closed chamber method is suitable for plot experiments, as it does not require large homogenously treated soil areas. Furthermore, it is manageable with limited resources and can identify relationships among ecosystem properties, processes, and fluxes, especially when combined with GHG driving force measurements. Nevertheless, with respect to the micrometeorological method, it causes a minimal but still unavoidable soil disturbance, and allows a minor temporal resolution. Several phases are key to the method implementation: i) chamber design and deployment, ii) sample handling and analyses, and iii) flux estimation. Technique implementation success in paddy fields demands adjustments for field flooding during much of the cropping cycle, and for rice plant maintenance within the chamber headspace during measurements. Therefore, the additional elements to be considered with respect to the usual application of non-flooded agricultural soils consist of devices for: i) avoiding any unintended water disturbance that could overestimate fluxes, and ii) including rice plants within the chamber headspace to fully consider gases emitted through aerenchyma transportation.

The overall goal of this protocol is to measure greenhouse gas emissions from paddy fields using the static closed chamber technique. The measurement system needs specific adjustments due to the presence of both a permanent water layer in the field and of the plants within the chamber headspace.

Bewertung von Methan und Lachgas Wärmeflüsse vom Reisfeld mittels statischer geschlossen Kammern, die Pflege der Pflanzen im Gasraum

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based ...

Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast make 2-dimensions (2D) infrared images somewhat difficult to interpret. Viewing an IR image or the video of plants freezing in 3 dimensions (3D) would allow a more accurate identification of sites for ice nucleation as well as the progression of freezing. In this paper, we demonstrate a relatively simple means to produce a 3D infrared video of a strawberry plant freezing. Strawberry is an economically important crop that is subjected to unexpected spring freeze events in many areas of the world. An accurate understanding of the freezing in strawberry will provide both breeders and growers with more economical ways to prevent any damage to plants during freezing conditions.
The technique involves a positioning of two IR cameras at slightly different angles to film the strawberry freezing. The two video streams will be precisely synchronized using a screen capture software that records both cameras simultaneously. The recordings will then be imported into the imaging software and processed using an anaglyph technique. Using red-blue glasses, the 3D video will make it easier to determine the precise site of ice nucleation on leaf surfaces.

Here, we present a protocol to image a strawberry plant freezing in 3 dimensions. Two infrared cameras positioned at slightly different angles are used to produce a red-blue anaglyph video to observe the freezing of the plant in 3 dimensions.

Protokoll zur Herstellung von dreidimensionalen Infrarot-Video des Einfrierens in Pflanzen

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many countries around the world. Severe yield losses are caused by direct feeding, and even more importantly, also by the transmission of more than 100 harmful plant pathogenic viruses. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspections of plant import products at points of entry such as seaports and airports are, therefore, seen as an important prevention measure. However, this last line of defense against pest invasions is only effective if rapid identification methods for suspicious insect specimens are readily available. Because the morphological differentiation between the regulated B. tabaci and close relatives without quarantine status is difficult for non-taxonomists, a rapid molecular identification assay based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology has been developed. This publication reports the detailed protocol of the novel assay describing rapid DNA extraction, set-up of the LAMP reaction, as well as interpretation of its read-out, which allows identifying B. tabaci specimens within one hour. Compared to existing protocols for the detection of specific B. tabaci biotypes, the developed method targets the whole B. tabaci species complex in one assay. Moreover the assay is designed to be applied on-site by plant health inspectors with minimal laboratory training directly at points of entry. Thorough validation performed under laboratory and on-site conditions demonstrates that the reported LAMP assay is a rapid and reliable identification tool, improving the management of B. tabaci.

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

This paper reports the protocol for a rapid identification assay for Bemisia tabaci based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology. The protocol requires minimal laboratory training and can, therefore, be implemented on-site at points of entry for plant imports such as seaports and airports.

Ein Loop-vermittelten isothermen Verstärkung (Lampe) Assay für schnelle Identifizierung von Tabak tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

Freistehende Leaf Assays zur Vereinfachung der Genexpressionsstudien in Kartoffeln während des Befalls durch Kauen Voninsekt Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...