Dies ist eine Demonstration einer einfachen Methode zur Expression, Extraktion und Reinigung von rekombinantem menschlichen IgG, das in tabakbezogenen Nicotiana Benthamiana-Pflanzen mit GFP verschmolzen ist. Dieses Protokoll kann zur Reinigung und Visualisierung von pflanzenproduzierten Antikörpern, Antikörperfusionen und den meisten Proteinen verwendet werden, die durch Säulenchromatographie gereinigt werden können. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern und Studenten in universitären Arbeitslabors, GFP-markierte Proteine bei den meisten Schritten des Proteinproduktionsprozesses zu visualisieren.
Bodentorfpellets auf eine Schale legen und zuvor gekochtes, noch heißes Wasser über die Torfpellets gießen, um die volle Ausdehnung zu beschaffen. Pellets wird ein paar Minuten dauern, um vollständig zu erweitern. Nachdem die Paletten vollständig erweitert sind, legen Sie zwei bis drei Nicotiana Benthamiana Samen auf jedem Torfpellet mit einer Pinzette.
Nachdem dies geschehen ist, müssen Sie etwa 0,5 Zoll Wasser gießen, um den Boden des Tabletts zu bedecken. Vergessen Sie nicht, das Tablett mit dem Aussaatdatum zu beschriften. Die Sämlinge täglich mit entsprechenden Mengen Dünger weiter gießen.
Das Tablett sollte mit einem Humidome-Oberteil bedeckt und in eine Wachstumskammer gelegt werden. Das gesäte Torfpellet sollte in der Wachstumskammer bei 23 bis 25 Grad Celsius mit einer Fotoperiode von 16 Stunden und 60% relativer Luftfeuchtigkeit aufbewahrt werden. Nach einer Woche eine zusätzliche Pflanze aus dem Pellet entfernen und jede Torfpalette mit nur einem Sämling verlassen.
Wenn die Pflanzen zwei bis drei Wochen alt sind, übertragen Sie jedes Torfpellet in einen einzelnen Topf, der feuchtigkeitsgeregelten Boden enthält. Weiter zu wässern Sämlinge täglich mit einem Gramm pro Liter Dünger, nie den Boden vollständig trocken lassen. Pflanzen sind bereit für die Infiltration, wenn sie fünf bis sechs Wochen alt sind.
Die folgenden Schritte müssen neben einem Bunsenbrenner durchgeführt werden, und es sollten grundlegende aseptische Techniken angewendet werden, um eine Kontamination zu vermeiden. Sie benötigen eine Lb Kanamycin Platte. Ein Mikrogramm pro Milliliter Kanamycinkonzentration.
streng mit zwei Mutationen EHA105, die Ihr gewünschtes Kanamycin-resistentes Konstrukt beherbergen und über Nacht wachsen. EHA105 ist eine der am häufigsten verwendeten Stämme von Agrobacterium zwei Mutationen. Um die Kultur zu beginnen, füllen Konische Röhre mit 10 Milliliter lb Medien, als nächstes, bei 10 Mikroliter von 100 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin, können Sie auch 10 Mikroliter von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Rifampicin hinzufügen, um E-coli-Kontamination zu verhindern.
Von der Platte aus verwenden Sie eine einzelne isolierte Kolonie, die von PCR verifiziert wurde, um Ihre neue Kultur zu erweitern. Wählen Sie Ihre isolierte Kolonie und impfen Sie sie in die LB. Legen Sie die Impfung auf den Shaker.
bei 30 Grad Celsius und 120 bis 150 Umdrehungen von 150 RPM über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag, wenn die Agrobacterium-Kultur auf OD600 in Höhe von 0,6 bis 0,9 gezogen wird, kann sie für die Infiltration verwendet werden. Wenn es überwuchert IST, sollte OD600 über ein bis zwei Milliliter auf eine frische LB mit Antibiotika übertragen und auf den erforderlichen OD600 angebaut werden.
Einmal bei entsprechendem OD600 die Kulturen in eine Zentrifuge geben, um sicherzustellen, dass die Zentrifuge ausbalanciert ist. Die Bakterien durch Zentrifugieren bei 4, 500G 20 Minuten bei Raumtemperatur anbringen. Sie können nicht aus beiden Proben übernonen.
Setzen Sie dann jedes Pellet und einen X-Infiltrationspuffer wieder aus, um die endgültige OD auf 0,4 zu bringen. Kombinieren Sie die gleichen Volumina jedes IgG-Fusionskonstrukts mit dem Lichtkettenkonstrukt, um die endgültige OD von 0,2 pro Konstrukt in jedem Rohr zu erhalten. Nehmen Sie eine Büroklammer und eine fünf bis sechs Wochen alte und benthamiana Pflanze von Schritt eins.
Mit der scharfen Kante der Büroklammer entfaltet machen eine kleine Punktion in der ersten epidermalen Schicht des Blattes. Vermeiden Sie es, das Blatt den ganzen Weg durch zu punktieren. Füllen Sie eine Milliliterspritze ohne Nadel, die mit der vorbereiteten Agrobacterium-Lösung aus Schritt zwei befestigt ist.
Bedecken Sie das im vorherigen Schritt gemachte Loch mit dem Ende der Spritze. Und schieben Sie langsam, um die Bakterien in das Blatt zu injizieren, während Sie sanften Gegendruck von hinter dem Blatt. Versuchen Sie, den größten Teil des Blattes zu infiltrieren und das Blatt maximal drei- bis viermal zu stechen, übermäßige Blattschäden können die Proteinausbeute behindern.
Beobachten Sie, wie sich das Blatt verdunkelt, während die Lösung injiziert wird, ohne zu viel Druck auf die Spritze auszuüben. Das infiltrierte Pflanzenblatt erscheint von der unteren Ansicht meist dunkel. Beachten Sie, dass diese bakterielle Lösung für mindestens drei bis vier Pflanzen pro Konstrukt ausreichen sollte.
Autoklavjede verbleibende bakterielle Lösung vor dem Verwerfen. Nachdem Sie die nadellose Infiltration beendet haben, legen Sie die Pflanzen wieder in die Wachstumskammer und wässern Sie täglich weiter. Beobachtet die Blätter für Chlorose, Nekrose sowie für GFP Fluoreszenz, Winter lang und Kurzwelle UV-Lampe.
Normalerweise zeigen Blätter an den Tagen vier und fünf die höchste GFP-Fluoreszenz. Ernten Sie alle Blätter nach der Infiltration vier bis fünf Tage und wiegen Sie die Gesamtmenge des Blattmaterials. Sie können das Blattmaterial sofort für die Nachverarbeitung verwenden, oder Sie können es in negativen 80 Grad Celsius einfrieren, bis es bereit ist, die infiltrierten Pflanzen wieder in die Wachstumskammer zu stellen und täglich weiter zu wässern.
beobachtet enden die Blätter für Chlorose, Nekrose, Veränderungen der Farbe und BlattgewebeTod in infiltrierten Bereichen. Beobachtete Pflanzen zur GFP-Fluoreszenz. Wenn GFP unter einer Lang- und Kurzwellen-UV-Lampe vorhanden ist.
Die Proteinexpression nimmt im Laufe der Zeit zu, wobei die höchste Fluoreszenz beider GFP-Konstrukte im Allgemeinen zwischen den Tagen vier und fünf auftritt. Ernten Sie alle Blätter nach der Infiltration vier bis fünf Tage und wiegen Sie das gesamte Blattmaterial. Verwenden Sie es sofort für nachgeschaltete Prozesse oder frieren Sie bei negativen 80 Grad Celsius ein, bis sie einsatzbereit sind.
Achten Sie während des Mischvorgangs darauf, Puffer und Mixerbecher vor dem Gebrauch auf Eis oder bei vier Grad Celsius zu halten. Pflanzengewebe aus Schritt vier in den vorgerichtlichen Mixerbecher legen. Bei gekühltem Extraktionspuffer, der die jeweiligen PMSF- und Natriumascorbatkonzentrationen zum Mixerbecher enthält.
Legen Sie den Mixerbecher auf den Mixer, nehmen Sie ein vorgeschnittenes Blatt Parafolie und dehnen Sie ihn über die Oberseite des Mixerbechers. Mischen Sie das Blattgewebe mit Extraktionspuffer, um sich 80 mit 22. Intervallen vorzustellen. Sie müssen gut zwischen Mischungszyklen nach Bedarf rühren.
Die Mischung sollte homogen erscheinen, ohne Blattstücke. Übertragen Sie Mischmaterial auf einen Becher. An einer Rührstange rühren und für vier Grad Celsius für 30 Minuten rühren, um die Proteinlöslichkeit zu verbessern und die Ausfällung von Feststoffen zu ermöglichen.
Legen Sie zwei Schichten von nacktem Tuch über einen sauberen Becher auf Eis und gießen Sie den Extrakt durch sie, um große Blattablagerungen zu entfernen. Schließlich wird der Extrakt durch das Spiegeltuch gegossen falten Sie das Spiegeltuch, um den Restblattextrakt zu drücken. Der Extrakt sollte dunkelgrün ohne sichtbare Partikel erscheinen.
Übertragen Sie den Extrakt in Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den Extrakt bei 16.000G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Dadurch wird das verbleibende unlösliche Material in die Pellet.
Stellen Sie sicher, dass beide Rohre ausbalanciert sind und dass der Rotordeckel sicher angezogen ist. Nach der Zentrifugation sollte das Pellet sichtbar sein, sagen wir überstand und das Pellet entsorgen. Filtern Sie den Überstand mit einer 50-Milliliter-Spritze und einem Glasfaserfilter.
Sammeln Sie 50 Mikroliter einer Probe und etikettieren Sie Rohextrakt für die spätere Analyse. Richten Sie eine Polypropylensäule ein, die 20 Milliliter Probe fasst. Schätzen Sie die benötigte Güllemenge in Abhängigkeit vom Zielimmunglobulintyp und seiner Affinität zum Harz.
In dieser Demonstration verwenden wir drei Milliliter Gülle. In der Regel sind drei Milliliter Gesamtgülle mit 1,5 Milliliter Bettvolumen effizient für die Reinigung von mehreren Milligramm Antikörper. Die erforderliche Menge an resuspendierter Gülle vorsichtig in die gekappte Säule einfließen lassen.
Öffnen Sie den Spaltenausgang vom unteren Rand der Spalte, und lassen Sie ihn abfließen, bis der größte Teil des Puffers weg ist. Sofort 10 Milliliter Waschpuffer ein Mal PBS auf die Oberseite gießen. Lassen Sie es abtropfen und wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.
Wenden Sie das gefilterte Beispiel aus Schritt 5 auf die Spalte an, und erfassen Sie den Durchfluss. Aliquot 50 Mikroliter Durchfluss für spätere Analysen. Speichern Sie den Rest des Durchflusses, falls sich der Antikörper nicht in das Harz bindet.
Waschen Sie das Harz zweimal mit 10 Millilitern von einem Mal PBS, um unspezifische Bindung zu reduzieren. Wenn gewünscht, aliquot 50 Mikroliter Waschen, wenn der Puffer durch die Säule abfließt, um sicherzustellen, dass der Zielantikörper nicht mit einem Waschpuffer angespielt wird. Während der Waschpuffer durch das Harz läuft, richten Sie fünf Mikrozentrifugenrohre mit 125 Mikrolitersteril, einem Molarentris-HCL bei pH-Wert acht zur Neutralisierung des Elutionspuffers ein und beschriften Sie sie.
Alternativ fügen Sie 30 Mikroliter von zwei Molaren Tris Basis, um mehr konzentriertee Eluat zu erhalten. Während der Elution kann UV-Licht zur Visualisierung verwendet werden. Dies muss nicht für die Dauer der Elution erfolgen.
Wenn Sie UV verwendet werden, achten Sie darauf, geeignete persönliche Schutzausrüstung zu tragen, um Schäden an Augen und Haut zu vermeiden. Ein UV-Licht muss während des Elutionsschritts nicht verwendet werden. Elute die Antikörper, indem sie fünf Milliliter Elutionspuffer auf die Säule auftragen und eine Milliliter-Fraktion auf jedes vorgesehene Rohr aus dem vorherigen Schritt sammeln.
Regenerieren Sie die Säule sofort, indem Sie 20 Milliliter gefolgt von 10 Milliliter Waschpuffer aufbringen. Stellen Sie sicher, dass das Harz nicht über einen längeren Zeitraum in einer sauren Umgebung zurückgelassen wird. Elution sollte fluoreszierend erscheinen.
Oft ist die höchste Fluoreszenz in der zweiten Elution zu sehen, kann aber von Extraktion zu Extraktion variieren. Zur Lagerung das Harz mit 10 Millilitern 20% Ethanol und PBS waschen und halbabtropfen lassen. Recap the top, then the bottom of the column and keep upright at four degrees C.Bestimmen Sie die Antikörperkonzentration mit einem Fotospektrometer, indem Sie die Absorption bei 280 Nanometern messen.
Bewahren Sie die Eluate in negativen 80 Grad Celsius und aliquot 50 Mikroliter jeder Fraktion in einem separaten Rohr für die weitere Analyse auf. In der Regel können Proteindauern bis zu 10 Mal ohne signifikanten Effizienzverlust wiederverwendet werden. Beziehen Sie sich auf die Herstellerrichtlinien für spezifische Details bestimmen Die Antikörperkonzentration, indem sie ein Spektralphotometer verwenden, indem sie die Absorption bei 280 Nanometern messen.
Bewahren Sie die Eluate bei minus 80 Grad Celsius und aliquot 50 Mikroliter jeder Fraktion in einem separaten Rohr für die weitere Analyse auf. Die Analyse des gereinigten Proteins durch die Zs-Seite kann durch die folgenden Standardprotokolle erfolgen. Beobachtete Fluoreszenz als Ergebnis, das auf den Erfolg des Klonens, der Infiltration und der Expression eines GFP-haltigen Konstrukts hindeutet.
Im Laufe von ein paar Tagen sollten Die Leuchtstoffröhren mit hoher Fluoreszenz an den Tagen vier und fünf schrittweise zunehmen. Wenn Protein G verwendet wird, zeigt die fluoreszierende Proteinbindung und die anschließende Elution aus der Kolonne die Reinigung einer IgG-Fusion an, die als stabiles GFP enthalten ist. Und das UV-exponierte Gel, sie können nur die 25KDa und 75KDa Bänder der Leiter zu sehen.
Sie können auch sehen, die nicht reduzierte Elution 2 Probe. Die nicht reduzierte Elution behält ihre Fluoreszenz als relative Größe, die man von einem intakten IgG als stabile GFP-Fusion erwarten würde. In der Coomassie werden sowohl reduzierte als auch nicht reduzierte Proben visualisiert.
Alle Leiterkomponenten sind sichtbar, native Proteine und IgG-Fusionen sind im Gesamtextrakt Überstand zu sehen und fließen durch Proben. Die Wäsche enthält eine kleine Menge IgG-Fusion. Elution eins und vier enthielten weniger konzentriertes Protein, wie erwartet wird, da die meisten Proteine im Allgemeinen aus dem zweiten und dritten Elutionsschritt entweicht enden.
Elution 2 nicht reduzierend kann auch gesehen werden, dass mehrere Bänder in allen reduzierenden Elutionsproben vorhanden sind. 75KDa zeigt eine schwere Kettensicherung zu GFP an. 50KDa zeigt allein eine schwere Kette an, 25KDa zeigt allein eine leichte Kette an, und 10 KDA deutet wahrscheinlich auf eine Degradation hin, die durch die Zugabe von Proteasehemmern verhindert werden kann.
Dieses Protokoll kann zur Reinigung jedes Antikörpers verwendet werden, der mit jedem gewünschten Zielprotein verschmolzen wird. Der Prozess kann so bearbeitet werden, dass es verschiedene Mengen an Blattmaterial aufnehmen kann, und ermöglicht auch die visuelle Bestimmung der Proteinpräsenz vor, während und nach Abschluss der Proteinextraktions- und -reinigungsprozesse. Diese Methoden können als Kontrollen nützlich sein und können zweckdienlich für Unterrichtstechniken sein.
