Diese Arbeit wurde von Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology, iBio, Inc. und der Defense Advanced Research Projects Agency (Zuschuss # HDTRA1-07-C-0054) unterstützt. Die Autoren erkennen die großzügige Geschenke von Drs.. Stanton Gelvin von Biological Science Dept, Purdue University (Agrobacterium tumefaciens-Stämme) und Wayne Fitzmaurice von Large Scale Biology Corporation (N. excelsiana Samen) sowie Jennifer Nicholson US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. excelsior Samen ). Die Autoren danken Margaret Shillingford und Christopher Hull zur Versorgung von Pflanzen und ausgezeichnete technische Hilfe. Die Autoren bedanken sich auch DRS. Stephen Streatfield und Natasha Kushnir für die redaktionelle Unterstützung.

1. Plant Growing Für die Folgeagroinfiltration werteten wir zwei Wildtyp Nicotiana-Arten (N. benthamiana und N. excelsior) und ein Hybrid (N. excelsiana) hydroponically auf Steinwolle in Indoor-Anlagen gewachsen. <ol><li> Genießen Steinwolle-Platten in einer Anlage Düngerlösung. </li><li> Aussaat der Samen von Wildtyp N. benthamiana, N. Holzwolle und N. excelsiana (Hybrid von N. benthamiana × N. excelsior) auf die Nährstoffe getränkten Steinwolle Oberfläche. </li><li> Wachsen Pflanzen aus den Samen unter kontrollierten Bedingungen (24 ° C und 40-65% relativer Luftfeuchtigkeit) und eine langfris Tag Photoperiode (14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit, mit Beleuchtung von 130-150 uE m -2 s -1) für 4-5 Wochen für N. benthamiana und N. excelsiana und 5-6 Wochen für N. Excelsior. </li></ol> 2. Konstruktion von Vektoren für AgroinfiltratIon <ol><li> Setzen Sie einen synthetischen Reporter-Gen (green fluorescent protein [GFP]), in voller Länge Hämagglutinin (HA) aus dem A/California/04/2009 Stamm von Influenza-Virus (HAC1) und re-engineered Lichenase Enzym (LicKM) 18 getrennt in die Einführung Vektor pBID4 18 (TMV-basierten Vektor) zu pBID4-GFP, pBID4-HAC1 und pBID4-LicKM bzw. 18,32,41,47 erhalten. </li><li> Führen 10-50 ng pBID4 Durchführung GFP oder HAC1 in elektro Zellen von A. GV3101 und LicKM in elektro Zellen von A. tumefaciens-Stämme GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, AT77 und A4 mit dem Gen MicroPulser Elektroporator. </li><li> Verwenden Sie die transformierte Agrobakterien zur Infiltration Experimente sofern nicht anders angegeben. </li></ol> 3. Vakuum-Infiltration von Agrobacterium in Nicotiana Pflanzen <ol><li> Wachsen A. tumefaciens-Stämme über Nacht (O / N) in LB-Medium, YEB med.ium-oder AB-Medium mit 50 mg / l Kanamycin bei 28 ° C mit 200 bis 250 Umdrehungen pro Minute zittern. </li><li> Verdünnen Agrobakterien in Milli-Q-Wasser auf eine optische Dichte bei 600 nm (A 600) von 0,5 oder Zentrifuge Agrobacterium-Zellen in LB oder YEB oder AB bei 4.000 × gezüchtet g für 10 min bei 4 ° C, Resuspendieren in Induktionsmedium (1 x MS-Salz, 10 mM MES, 200 &amp;mgr; M Acetosyringon, 2% Saccharose [MMA]), um eine 600 von 0,5, gegeben und bei Raumtemperatur für 1-3 h, sofern nicht anders angegeben. </li><li> Infiltrieren Pflanzen in einer Vakuumkammer durch Eintauchen Pflanze Nicotiana Luft Gewebe in Agrobacterium-Suspension und Auftragen einer 50-400 mbar Vakuum für 30 oder 60 Sekunden. Die optimale Infiltration wird routinemäßig bei 50-100 mbar für 60 Sekunden aufgebracht. </li><li> Sobald das Vakuum gebrochen ist, entfernen Sie Pflanzen aus der Vakuumkammer, in Wasser abspülen, und wachsen für 5-7 Tage unter den für Pre-Infiltration Wachstum verwendet gleichen Wachstumsbedingungen. </li><li> Um die Wirksamkeit zu testenChemikalien induzieren Agrobacterium vir-Gen, verschiedene Konzentrationen von Acetosyringon (0, 100, 200 oder 400 &amp;mgr; M) zu der Agroinfiltration in Puffer (1x MS, 10 mM MES, 2% Glucose) zugegeben. Um den Effekt der Induktion von Monosaccharid zu vir-Gen verschiedenen Prozentsätzen von Glucose (0, 1, 2 oder 4%) wurden in Agrobakterien zugesetzt N. in der Infiltrationspuffer (1x MS, 10 mM MES, 200 &amp;mgr; M Acetosyringon) suspendiert. benthamiana Pflanzen wurden infiltriert, wie oben in den Schritten 3.3 und 3.4) erwähnt. </li><li> Agrobacterium-Stämme GV3101 Labor, C58C1 und LBA4404 und Wildtyp-Stämme A4, AT06, AT10 und AT77 beherbergen die pBID4 LicKM-Vektor wurden in Milli-Q-Wasser auf A 600 von 0,5. N. verdünnt benthamiana Pflanzen wurden mit jedem einzelnen Stamm, wie oben in den Schritten 3.3 und 3.4 genannten infiltriert. </li></ol> 4. Co-Agroinfiltration Verfahren für die Viral Silencing Suppressor <ol><li> Mix die Milli-Q-Wasser verdünnt Agrobacterium GV3101 Kulturen trägt das GFP-Gen und den viralen Silencing-Suppressor p19 Tomaten buschigen Stunt-Virus (TBSV) 1:1, 2:1, 3:1 und 4:1-Verhältnisse. Infiltrieren N. benthamiana-Pflanzen, wie oben beschrieben. </li><li> Infiltrieren N. benthamiana Pflanzen mit einer Mischung von zwei Milli-Q-Wasser verdünnt Agrobacterium GV3101 Kulturen: Die erste Durchführung der pBID4 HAC1-Plasmid und die zweite Durchführung einer der Silencing-Unterdrücker - p19 oder p23 der TBSV von Citrus-Tristeza-Virus, in der pCassp Plasmid ( pCassp19) und PGR binäre Plasmid unter der 35S-Promotor (PGR-P23) verbunden sind, im Verhältnis 4:1 ist. </li></ol> 5. Western-Blot-Analyse <ol><li> Sammeln Zufallsblattproben von N. benthamiana, N. Holzwolle oder N. excelsiana Pflanzen bei 4-7 dpi pulverisieren und in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver. </li><li> In drei Bänden 1x PBS-Puffer, 0,5% TritonX-100 zu jeder Probe. </li><li> Schütteln Sie die extrahierten Proben für 15 min bei 4 ° C </li><li> Drehen Sie das Extrakt für 5 min und sammeln gesamten löslichen Proteins in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Verdünnen Sie die Extrakte einer geeigneten Verdünnung (1:50 1:100) in 1x PBS Extraktionspuffer, und mit 5 × Probenpuffer (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10% SDS, 0,5% Bromphenolblau, 50% Glycerin v / v, und 500 mM DTT) bis zu einer endgültigen Konzentration 1 ×. </li><li> Kochen Sie die Proben für 5 min. </li><li> Separate Proteine ​​durch 10% SDS-PAGE, Transfer auf Immobilon-P Transfermembran und der Block mit 0,5% I-Block. </li><li> Erkennen GFP unter Verwendung von Kaninchen polyklonalen Anti-GFP-Antiserum bei 1:5.000 und HAC1 mit Maus-Anti-Poly-Histidin monoklonalen Antikörper bei 1:1000 in Blockierungslösung für 1 Stunde. </li><li> Nach der primären Antikörpermarkierung, waschen Sie die Membranen dreimal für 10 min mit jeweils 1 × PBST-20 und Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Anti-Kaninchen-Antikörper bei 1:5000 oder eine HRP-Konjugatd-Anti-Maus-Antikörper bei 1:10.000 1 h, für GFP und HAC1 Erfassungs sind. </li><li> Prozess Western-Blots mit dem Supersignal West-Pico Chemilumineszenz Substrat. </li><li> Verwenden Sie die Genetools Software der Bandenintensität des Proteins zu analysieren und zu erhalten, die Band kalibriert Menge. </li></ol> Proteinproduktion: (kalibrierte Menge x Verdünnung der Probe) / Probenmenge geladen) x 4 = mg / kg. Gleichung: Protein-Produktion (P), kalibrierte Menge (C), Verdünnung der Probe (D) und die Menge der Probe geladen (S). 6. Zymogramm Assay <ol><li> Sammeln pBID4-LicKM-infiltriert N. benthamiana Zufallsgewebeproben. </li><li> Extrahieren von Proteinen unter Verwendung der gleichen oben für Western Blot-Analyse beschriebenen Verfahren und dann durch 10% SDS-PAGE-Analyse mit 0,1% Lichenan in den Gelen enthalten. </li><li> Nach der Elektrophorese, waschen Sie die Gele zweimal für jeweils 10 Minuten in Waschpuffer (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] und 0,1% Triton X-100) Und dann inkubiert in Waschpuffer bei 65 ° C für 1 Stunde. </li><li> Nach der Inkubation der Waschpuffer verworfen und färben die Gele mit 0,5% Kongorot für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Dreimal Spülen der Gele in Milli-Q-Wasser für jeweils 10 min, und fügen Sie 1 M NaCl auf Lichenase Aktivität visualisieren. Die gereinigte bakterielle Lichenase Protein wurde als positive Kontrolle für die Enzymaktivität verwendet. </li></ol> 7. GFP Imaging <ol><li> Führen visuellen Nachweis von GFP-Fluoreszenz ganz transient transformierten Pflanzen mit einer Handlangwelligen UV-Lampe. </li><li> Foto transient transformierten Pflanzen mit einer Digitalkamera über einen Yellow 8, ES 52 Filter (Belichtungszeit 15 s). </li><li> Erhalten Sie Bilder von Western-Blot-Analysen unter Verwendung der Software auf einem GeneSnap GeneGnome und zu quantifizieren, die Ergebnisse mit Hilfe der Genetools-Software, mit einer Eichkurve auf Basis gereinigt GFP-Standard. </li><li> Quantifizierung HAC1-Protein unter Verwendung einer Eichkurve basierend auf Abreinigunged HAC Proteinstandard aus der A/Indonesia/05/05 Stamm von Influenza-Virus. </li><li> Berechnen Mittelwerte 3-4 Wiederholungen für alle Experimente. </li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

In dieser Studie haben wir ein einfaches Protokoll für Agroinfiltration Routine transiente Proteinproduktion in ausgewählten Nicotiana-Arten mit Hilfe von Agrobacterium-Stämme, die die Markteinführung Vektor entwickelt. Darüber hinaus haben wir die optimalen Bedingungen ermittelt, die höchste Produktion rekombinanter Proteine ​​Ebene in unserem vorübergehenden Pflanzenexpressionssystem zu erreichen. Vakuum-Infiltration der verdünnten A. tumefaciens Stamm GV3101 beherbergen die Startvektor pBID4 in N. benthamiana, N. excelsiana und N. excelsior in höheren Ebenen der Zielproteinproduktion innerhalb 7 dpi im Vergleich zu anderen Pflanzenarten, wie Pisum sativum mit GV3101 beherbergen, Alfalfa-Mosaik-Virus infiltriert - oder Cucumber-Mosaik-Virus-basierte Vektoren, die das GFP-Reporter-Gen unter der 35S-Promotors 41, oder Lactuca sativa, Solanum lycopersicum und Arabidopsis thaliana mit dem C58C1 Stamm von A. infiltriert tumefaciens mit dem beta-Glucuronidase-Reportergens 57. N. benthamiana und N. excelsiana waren einfach zu infiltrieren Vakuum bei 50 mbar für 30-60 sec, mit 90-95% Infiltration Effizienz. Die verbleibenden 5-10% der Blattfläche nicht wegen irgend Floating der Blätter auf der Oberfläche des Agrobacterium-Suspension während des Aufbringens des Vakuums infiltriert. Seit der Einführung Vektor hat die Fähigkeit für Zell-zu-Zell-Bewegung 18, tritt transiente Proteinakkumulation in ganze Blätter sowie Blattstiele bei 7 dpi. Bei 10 dpi, war die geschätzte GFP Produktion etwas niedriger, weil die pBID4 Expressionsvektor ist in der Lage, von Zelle zu Zelle bewegen, aber nicht systemisch 18 zu bewegen; daher neu gewachsene Blätter enthalten den Vektor nicht und nicht um die Produktion von Ziel beitragen. Zusätzlich Abbau des rekombinanten Proteins mit der Zeit may reduziert Proteinebene beitragen bei 10 dpi. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Infiltration des A. tumefaciens Stamm GV3101 vermittelte hohe transiente Proteinproduktion in N. benthamiana. Ferner können Zielprotein als N-terminale, C-terminale oder interne Fusionen Lichenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-Glucanase, welche ein thermostabiles Enzym aus Clostridium thermocellum ist und Thermostabilität verleiht vielen Ziel konstruiert werden, Protein-Fusion 18. Die Infiltration von N. benthamiana mit A. tumefaciens-Wildtyp-Stämme (AT6, AT10 und AT77) beherbergt das Gen von Interesse hervorgerufen milde oder schwere Symptome: Blatteisstockschießen, Blattstiel Dehnung und Eisstockschießen. Keine pathologischen Symptome wurden in N. beobachtet benthamiana infiltriert mit dem Laborstamm GV3101 beherbergen leer pBID4 Vektor, während einige Gene in pBID4 eingeführt und in Labor-Stämme GV3101, C58C1 oder LBA4404 ausgelöst milden nekrotischen Antworten und BlattChlorose / Vergilbung Symptome bei infiltriert Regionen der Blätter. Necrotic Symptome, die durch Wildtyp-Stämmen Agrobacterium oder unscharf in Nachtschattengewächse verursacht haben bisher 56,57 berichtet. Die nekrotische Reaktion konnte von Virulenzfaktoren des Sekretionssystem vom Typ III, bakteriellen Proteinen in die Pflanzenzelle durch die Typ IV-Sekretionssystem übertragen und / oder Empfindlichkeit für Flagellin 58-60 führen. Wir haben festgestellt, dass transiente Produktion von heterologen Proteine ​​können auch entlocken Pathogenität und eine hypersensible Reaktion in infiltriert Anlage verlässt. Viele Forscher berichtet, dass die Agroinfiltration von verschiedenen Pflanzenarten mit Pflanzen binären Vektoren bis zu 5-20 mal höhere transiente Proteinproduktion im Vergleich zu stabil transformierten Pflanzen 28,57 hergestellt. Unsere Daten zeigen, dass N. benthamiana infiltriert mit GV3101 beherbergen pBID4-GFP transient exprimierten hohe Niveaus von GFP, die ähnlich der GFP Ausbeute für gemeldeteN. benthamiana mit Agrobakterien Durchführung der Pich-GFPSYS viralen Vektor (bis zu 80% des gesamten löslichen Proteins) 44 infiltriert. Agroinfiltration mit unserem Start-Vektor führte zu hohen Produktion von thermostabilen Protein LicKM, 50-fach höher als die Verwendung eines binären Standard-Plasmid-18 beobachtet. Um die Infektiosität von A. Test tumefaciens und die Stabilität der Markteinführung Vektor, ein Flach von N. infiltriert wir benthamiana jede Stunde für bis zu 8 Stunden mit dem gleichen Milli-Q-Wasser verdünnten Kultur der GV3101 beherbergen die pBID4-GFP-Plasmid. Unsere Daten zeigten, dass der Stamm GV3101 effizient für mindestens 8 h und pBID4 (die Einführung Vektor) infektiös ist während der 8 Stunden lang Infiltration sehr stabil. Glycerin Lager von GV3101 Stamm, der den Start-Vektor pBID4 HAC1 (Zellbank) bei -80 ° C gelagert wurde gezeigt, dass für drei Jahre als sehr stabil, ohne die Änderungen in transienten protein der Produktion in Pflanzen infiltriert. N. benthamiana Pflanzen unter optimalen Bedingungen und zwischen 35 und 42 Tage nach der Aussaat gewachsen waren optimal für Vakuuminfiltrations-vermittelte transiente Genexpression 40. Jungpflanzen (3-4 Wochen alt) nicht vollständig, weil der schwimmenden Blätter auf der Zellsuspensionsoberfläche und Gewebeschäden von der mechanischen Wirkung des Anlegens eines Vakuums infiltriert werden. In Anlagen, die älter als 45 Tage, N. benthamiana Verschrauben der Bühne, unter den verwendeten optimalen Lichtverhältnissen, ist das Niveau der transiente Expression gering. Niedermolekulare phenolische Verbindungen (Acetosyringon) und monosaccharaides (Glukose) sind dafür bekannt, vir-Gene in A. tumefaciens 55,61 induzieren. Außerdem Infiltration von N. benthamiana mit dem binären Vektor pCAMBIA (GFP) in Anwesenheit von Acetosyringon bei Konzentrationen von 50-600 &amp;mgr; M gezeigt, geringfügig vorübergehende ZunahmeGenexpression 40. Wir untersuchten die Wirkung von verschiedenen Konzentrationen von Acetosyringon und Glucose in unserem System durch Zugabe dieser Verbindungen zu GV3101 Kulturen beherbergen pBID4-GFP in MMA für 3 h, und fand keinen Unterschied in der GFP-Expression. Interessanterweise GV3101 Kulturen beherbergen pBID4-GFP und in Milli-Q-Wasser auf eine A 600 von 0,5 verdünnt und infiltriert ohne die vir-Gen Induktion exprimiert die gleichen Mengen an GFP als diejenigen mit induzierten Kulturen infiltriert. Die A. tumefaciens vir-Gen (n) könnte möglicherweise durch Pflanzen phenolische Verbindungen (Acetosyringon und Sinapinsäure) und Pflanzen monosaccharaides (Glucose und Fructose) in Blattgewebe vorhanden induziert werden. Daher spekulieren wir, dass ähnliche Niveaus der GFP-Expression in Gegenwart oder Abwesenheit von exogenen Induktoren vir-Gen kann ein Ergebnis der Wirkung der zytoplasmatischen vir-Gen Induktoren während der Replikation der GFP-exprimierenden Vektor Einführung in Pflanzenzellen vorliegen. N. benthamiana als Modell-Host für transiente Proteinproduktion 49 verwendet worden. Jedoch relativ niedrigen Biomasseertrag N. benthamiana &#39;s behindert seine Anwendung für die Großproduktion von rekombinanten Proteinen. Die optimale Host sollte eine hohe transiente Expression, einfach Wachstum im Gewächshaus zu kombinieren und anfällig sein Agrobacterium Infiltration 2. Um eine alternative Host auswählen, infiltriert wir zwei verschiedene Arten Wildtyp von Nicotiana (N. benthamiana und N. excelsior) und ein Hybrid N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) mit der A. GV3101 beherbergen die pBID4-GFP-Plasmid. Unter diesen drei Arten, die Höhe der GFP-Expression in N. geringfügig höheren benthamiana. N. excelsior Pflanzen zeigten Schwierigkeiten im Vakuum Agroinfiltration aufgrund ihrer ledrigen Blättern, und N. excelsianaproduziert etwa zwei-mal Biomasse unter den gleichen Wachstumsbedingungen. Die transiente Produktion von GFP bei 7 dpi in N. relativ ähnlich ist benthamiana und N. excelsiana. Daher N. excelsiana kann ein geeigneter Wirt für die Produktion rekombinanter Proteine ​​sein. Agrobacterium-vermittelte transiente Proteinproduktion durch PTGS 26, die durch Co-Expression von Gen-Silencing-Suppressoren des Pflanzenvirus Ursprungs 62 überwunden werden kann, begrenzt. Transiente Proteinproduktion wurde zuvor gezeigt, um das 50-fache in Gegenwart der p19-Protein von TBSV, die PTGS in infiltrierten Geweben hemmt 34 verbessert werden. In unserer Studie untersuchten wir die Wirkung von zwei viralen Silencing Unterdrücker (p19 und p23) mit der Einführung pBID4 Vektor-HAC1 separat Zusammenarbeit infiltriert. Der Co-Infiltration dieser Silencing-Suppressoren schien wenig Einfluss auf transiente Expression HAC1 haben, mit nur einer leichten Erhöhung der HAC1Protein-Akkumulation (15-25%) in Gegenwart von Co-infiltrierten p23 oder p19. Um positiv auf die Proteinproduktion, muss zum Schweigen Drücker gezielt ausgewählt, um effektiv für die gezielten Pflanzenarten und viralen Vektor 63 sein werden. TMV Helikase hat einen Suppressor der RNA-Silencing-Aktivität 64,65. Unsere Daten bestätigen diese Beobachtung als Co-Infiltration von p23 oder p19 mit pBID4-HAC1 führte zu keiner Erhöhung der GFP oder einem leichten Anstieg in der Übergangs HAC1 Proteinproduktion. Zusammenfassend haben wir geändert und optimiert Anlagen und Agrobacterium Wachstumsbedingungen und verbessert die Effizienz der Vakuum-Infiltration. Diese Technologie ermöglicht es uns, in ein paar Stunden zu wachsen und zu infiltrieren Hunderte von Kilogramm Pflanzenmaterial. Wir die Anlage transiente Expression Technik für die Hochdurchsatz-Impfstoff-Produktion im industriellen Maßstab unter current Good Manufacturing Practices (cGMP) Bedingungen erfolgreich automatisiert. Für weitere Informationen about Automatisierung und Auslastung der Anlage transiente Protein-Produktionsanlage für die Produktion von rekombinanten Proteinen, einschließlich Subunit-Impfstoff-Kandidaten, unter cGMP-Bedingungen werden die Leser auf die Website verwiesen <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

Die Pflanzen werden nun als eine sichere, zuverlässige, skalierbare und kostengünstige Plattform für die Herstellung von heterologen rekombinanten Biopharmazeutika und industrielle Proteine ​​3.1 erkannt und haben wichtige Vorteile gegenüber mikrobiellen und tierischen Zellexpressionssysteme 4. Pflanzen sind in der Lage, korrekt gefalteten Proteinen mit posttranslationalen Modifikationen, einschließlich montiert multimeren Antikörper 5-7 auszudrücken. Mehrere Pflanzen gewonnene rekombinante pharmazeutische Proteine ​​werden in der klinischen Evaluation 8. Dazu gehören Patienten-spezifischen rekombinanten Impfstoffe Idiotyp (scFv) für die Behandlung des Non-Hodgkin-Lymphom 9, Hämagglutinin-Basis-Pandemie und die saisonale Grippe-Impfstoff-Kandidaten 10,11 (Cummings et al., Um Impfstoff eingereicht), Anti-Streptococcus-Oberflächenantigen I / II-Antikörpers zur Behandlung von Zahnkaries 12 und Human-Insulin zur Behandlung von Diabetes 13. Außerdem menschlichen recombinant Glukozerebrosidase für die Enzymersatztherapie bei Patienten mit Gaucher-Krankheit hat in Israel und in den USA zugelassen und wird unter dem Expanded-Access-Programm außerhalb der USA 14,15 vorgesehen. Heterologe Proteine ​​können in stabil transformierten (transgene oder transplastomischer) oder transient transformierte Pflanzen produziert werden. Transient Proteinherstellung bietet mehrere Vorteile gegenüber der Produktion in transgenen Pflanzen, einschließlich kurzer Zeit, um die Expression und Akkumulation 16 zu erreichen, und kann durch die Einführung von bakteriellen binären Vektoren oder rekombinanten Pflanzenvirusvektoren in Pflanzengewebe 4 erreicht werden. Das am weitesten fortgeschrittene transienten Expressionssystem beruht auf der Verwendung von &quot;Start-Vektoren&quot;, die Komponenten von Pflanzenviren und binären Plasmide kombinieren und durch Agroinfiltration 17,18 geliefert basiert. Agroinfiltration von einem Startvektor auf Basis von Tabakmosaikvirus (TMV) wurde erfolgreich am Labor angewendetskalieren, um Impfstoffantigene gegen Krankheitserreger wie Human Papilloma Virus 19, Yersinia pestis 20 produzieren, Viren Influenza A 21,22, Bacillus anthracis 23 und Pocken-Virus 24 in N. benthamiana Blättern. Agrobacterium-vermittelte transiente Expression ist auch ein vielversprechendes Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von mehreren Proteinen 2,25-27. Zum Beispiel haben Pflanzen vorübergehende Expressionssysteme verwendet worden, um Tumor-spezifische rekombinante Antikörper 28,29, ein glycosyliertes rekombinantes Antikörpers gegen den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 30 und einen monoklonalen Antikörper, der für Anthrax-Schutzantigen 31,32 erzeugen. Co-Infiltration von Nicotiana benthamiana Pflanzen mit einer Ziel-Gen und Suppressor der Gen-Silencing führt zu einer erhöhten Expression des Zielproteins 33,34. Agroinfiltration ist eine gängige Methode zur gleichmäßigen introduCING Bakterien beherbergen, ein Gen von Interesse in pflanzlichen Geweben 35-37. Vakuum-Infiltration von Agrobacterium für transiente Genexpression in intakten Pflanzenblättern ist eine schnelle, skalierbare und nützliche Methode für die Produktion von Fremdproteinen, ohne dass transgene Pflanzen 38-41 generieren. Während Vakuum Agroinfiltration werden die Pflanzen auf den Kopf gestellt und oberirdischen Teile in Agrobacterium-Suspension getaucht. Dann Vakuum angelegt, wodurch Gase aus Blattinterzellulären Räumen durch Spaltöffnungen zu evakuieren. Schnelle Wieder Druckbeaufschlagung nach Freigabe des Vakuums führt die Infusion von Agrobacterium-Suspension in das Blatt. Nach Vakuuminfiltration von Agrobakterien werden die Pflanzen weiter kultiviert und Zielausdruck wird überwacht. Die höchsten Zielausdruck werden in der Regel 2-3 Tage nach beobachtet Infiltration (dpi) mit einer binären Vektor und 4-7 dpi bei einer Einführung Vektor, nach der das Expressionsniveau in der Regel abnehses 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens ist der am häufigsten verwendete Träger für die Abgabe eines Gens von Interesse in eine Anlage zur Herstellung von Proteinen. Agroinfiltration funktioniert außerordentlich gut in N. benthamiana aber relativ schlecht in den meisten anderen Pflanzen, darunter 46 Arabidopsis thaliana. In dieser Studie wurde ein einfaches, effizientes und wirtschaftliches Verfahren für die transiente Proteinproduktion in 5-6 Wochen alten N. entwickelten wir benthamiana mit A. tumefaciens Infiltration. Der Hauptnachteil von Industrie Skalierung der Agroinfiltration Technik ist die Zentrifugation der geernteten Bakterien und Resuspension des Bakterienpellets in einem Medium, 4&#39;-Hydroxy-3 &#39;, 5&#39;-Dimethoxyacetophenon (Acetosyringon) Monosaccharide, und 2 - (N-Morpholino) -ethansulfonsäure (MES)-Puffer für die Induktion der vir-Gene. Wir waren in der Lage, diese Probleme durch die Optimierung der Agrobacterium überwinden </em&gt; Wachstum in AB-Medium (Minimalmedium), gefolgt von Verdünnung direkt in Milli-Q-Wasser und durch Steuern der Infiltrationszeit und Bedingungen. Wir haben auch Zielprotein-Produktion im Vergleich zu dem Wildtyp-Tabakwirtsarten N. benthamiana und N. Holzwolle, als auch in Hybrid N. excelsiana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana benthamiana</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555478 TW16</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsior</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555685 TW47</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsiana</td>
			<td style="width:221px;">Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td>
			<td style="width:119px;">LSBC EBA 042304.02</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum skid</td>
			<td style="width:221px;">Abbas, Ashland, MA</td>
			<td style="width:119px;">Custom made</td>
			<td style="width:236px;">Plant infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rockwool</td>
			<td style="width:221px;">Grodan Inc., Ontario, Canada</td>
			<td style="width:119px;">AO 50/40</td>
			<td style="width:236px;">Hydroponic media for growing plant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid</td>
			<td style="width:221px;">Acros Organics, Thermo Fisher Scientific&#160; 
			NJ</td>
			<td style="width:119px;">172595000</td>
			<td style="width:236px;">Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog salt (MS salt)</td>
			<td style="width:221px;">Phyto Technology Lab</td>
			<td style="width:119px;">M524</td>
			<td style="width:236px;">Tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">D134406-5G</td>
			<td style="width:236px;">Agrobacterium induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immobilon-P transfer membrane</td>
			<td style="width:221px;">Millipore, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">I-block</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems, Foster City, CA</td>
			<td style="width:119px;">T2015</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Washington Biotechnology, Baltimore, MD&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti&#8211;poly-histidine monoclonal antibody</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen GmbH, Hilden</td>
			<td style="width:119px;">34670</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperSignal&#174; West Pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td>
			<td style="width:119px;">34078</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td>
			<td style="width:221px;">Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P-LICHN</td>
			<td style="width:236px;">Lichenase Activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Congo Red&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">C6277&#160;</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital camera&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Olympus, Center Valley, PA</td>
			<td style="width:119px;">C-8080</td>
			<td>Chemiluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneGnome</td>
			<td style="width:221px;">Syngene, Frederick, MD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP standard&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Made in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plant fertilizer solution</td>
			<td style="width:221px;">Griffin Greenhouse &#38; Nursery Supplies, Newark, DE</td>
			<td style="width:119px;">67-23-20</td>
			<td>Plant growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lichenase Standard</td>
			<td style="width:221px;">Purified in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BioRad, Hercules, CA&#160;</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>Agrobacterium transformation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana

Agrobacterium-vermittelte transiente Proteinproduktion in Pflanzen ist ein vielversprechender Ansatz zur Impfstoffantigene und therapeutische Proteine ​​in kurzer Zeit zu produzieren. Allerdings ist diese Technologie erst am Anfang, um die Großproduktion, wie viele technologische Hindernisse, Scale-up aufgetragen werden nun überwunden werden. Hier zeigen wir eine einfache und reproduzierbare Methode für die industrielle transiente Protein-Produktion auf Basis von Vakuum-Infiltration von Nicotiana Pflanzen mit Agrobakterien Bucheinführung Vektoren. Optimierung von Agrobacterium Anbau in AB-Medium ermöglicht die direkte Verdünnung der Bakterienkultur in Milli-Q-Wasser, die Vereinfachung der Infiltrationsprozess. Unter drei getesteten Arten von Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) wurde als der vielversprechendste Host aufgrund der Einfachheit der Infiltration ausgewählt, die hohe Reporterprotein Produktion, und etwa zwei-falt höhere Biomasseproduktion unter kontrollierten Umweltbedingungen. Induktion von Agrobacterium pBID4-GFP (Tabak-Mosaik-Virus-Basis) unter Verwendung von Chemikalien wie Acetosyringons Monosaccharid und hatte keine Auswirkungen auf die Produktionsebene Protein. Eindringen Pflanze unter 50 bis 100 mbar für 30 oder 60 Sekunden zu einer etwa 95% Infiltration von Pflanzenblattgewebe. Infiltration mit Agrobacterium Laborstamm GV3101 zeigten im Vergleich zu Agrobakterien LBA4404 Laborstämme und C58C1 und Wildtyp-Agrobakterien-Stämme AT6, AT10, AT77 und A4 die höchste Proteinproduktion. Co-Expression einer viralen RNA-Silencing-Suppressor, p23 oder p19, in N. benthamiana führte in früheren Akkumulation und erhöhte Produktion (15-25%) des Zielproteins (Influenza Virus Hämagglutinin).

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Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient Proteinproduktion in Pflanzen Nicotiana basierend auf Vakuum-Infiltration mit Agrobakterien Buchstart-Vektoren (Tabak-Mosaik-Virus-basierten) ist ein schneller und wirtschaftlicher Ansatz für Impfstoff-Antigene und therapeutische Proteine ​​zu produzieren. Wir vereinfacht das Verfahren und die verbesserte Ziel Akkumulation durch die Optimierung der Bedingungen von Bakterien Anbau, Auswahl Wirtsarten, und Co-Einführung von RNA-Silencing Unterdrücker.

Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

optimization-utilization-agrobacterium-mediated-transient-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

41.0K Aufrufe.  Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology.  Transient Proteinproduktion in Pflanzen Nicotiana basierend auf Vakuum-Infiltration mit Agrobakterien Buchstart-Vektoren (Tabak-Mosaik-Virus-basierten) ist ein schneller und wirtschaftlicher Ansatz für Impfstoff-Antigene und therapeutische Proteine ​​zu produzieren. Wir vereinfacht das Verfahren und die verbesserte Ziel Akkumulation durch die Optimierung der Bedingungen von Bakterien Anbau, Auswahl Wirtsarten, und Co-Einführung von RNA-Si...

Serie: Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

Produktion von replikationsdefekte Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T-Zellen

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Forschung

Biologie

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

Ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Protein in mCD1d Insektenzellen.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

Agroinfiltration und PVX Agroinfektion in Kartoffel und Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) and Wuschel2 (Wus2). Bbm is regulated by the maize phospholipid transferase gene (Pltp) promoter, and Wus2 is under the control of a maize auxin-inducible (Axig1) promoter. An Agrobacterium strain carrying these morphogenic genes on transfer DNA (T-DNA) and extra copies of Agrobacterium virulence (vir) genes are used to infect maize immature embryo explants. Somatic embryos form on the scutella of infected embryos and can be selected by herbicide resistance and germinated into plants. A heat-activated cre/loxP recombination system built into the DNA construct allows for removal of morphogenic genes from the maize genome during an early stage of the transformation process. Transformation frequencies of approximately 14%, 4%, and 4% (numbers of independent transgenic events per 100 infected embryos) can be achieved for W22, B73, and Mo17, respectively, using this protocol.

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Plant morphogenic genes can be used to improve genetic transformation of recalcitrant genotypes. Described here is an Agrobacterium-mediated genetic transformation (QuickCorn) protocol for three important public maize inbred lines.

Agrobacterium- Vermitteltune unreife Embryo-Transformation von widerspenstigen Mais Inzuchtlinien mit morphogenen Genen

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive organs/gametes. Recent advances in CRISPR-Cas9 genome editing technology allow for high editing efficacy and timesaving knockout mutations of endogenous candidate genes at specific sites. Additionally, Agrobacterium-mediated genetic transformation of rice is also a key method for gene modification, which has been widely adopted by many public and private laboratories. In this study, we applied CRISPR-Cas9 genome editing tools and successfully generated three male sterile mutant lines by targeted genome editing of OsABCG15 in a japonica cultivar. We used a modified Agrobacterium-mediated rice transformation method that could provide excellent means of genetic emasculation for hybrid seed production in rice. Transgenic plants can be obtained within 2&#8211;3 months and homozygous transformants were screened by genotyping using PCR amplification and Sanger sequencing. Basic phenotypic characterization of the male sterile homozygous line was performed by microscopic observation of the rice male reproductive organs, pollen viability analysis by iodine potassium iodide (I2-KI) staining semi-thin cross-sectioning of developing anthers.

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

This work describes the use of CRISPR-Cas9 genome editing technology to knockout endogenous gene OsABCG15 followed by a modified Agrobacterium-mediated transformation protocol to produce a stable male-sterile line in rice.

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

Produktion von IgG-Fusionsproteinen transient exprimiert in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...