Erhöhte Cholesterinwerte sind ein wichtiger Risikofaktor für herz-kreislauf- und neurodegenerative Erkrankungen. Unsere Protokolle bieten wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung sowohl physiologischer als auch mechanistischer Folgen von Hypercholesterinämie. Diese Verfahren können mit grundlegenden Laborgeräten durchgeführt werden und gelten für Zellen, Gewebe und Xenopus-Oozyten.
Cholesterin ist ein wichtiger Bestandteil der Zellmembranen im ganzen Körper. Diese Techniken können verwendet werden, um die Auswirkungen von erhöhten Cholesterinspiegel in jedem Zelltyp zu studieren. Die Arterien zu sezieren ist der schwierigste Schritt.
Entfernen Sie vorsichtig die Arterie aus dem Gehirn, ohne das Gefäßgewebe zu dehnen oder zu beschädigen. Lipide sind sehr empfindlich, und die Arbeit mit ihnen ist mehr eine Kunst als eine Wissenschaft. Video-Demonstration bietet eine Anleitung für das Lernen, wie man mit Lipiden vorsichtig umgeht.
Um die cholesteringesättigte Methyl-Beta-Cyclodextrin-Lösung vorzubereiten, fügen Sie zunächst 064 Gramm Methyl-Beta-Cyclodextrin zu 10 Milliliter PBS hinzu, wobei die Lösung mit einem Rührstab gerührt wird, um sicherzustellen, dass sich das Methyl-Beta-Cyclodextrin vollständig auflöst. Als nächstes fügen Sie 0024 Gramm Cholesterinpulver in den Kolben, und rühren Sie die Lösung kräftig, mit einem Spachtel, um so viele Cholesterin-Stücke wie möglich zu brechen. Wenn fast das gesamte Cholesterin gelöst ist, versiegeln Sie den Kolben mit mindestens zwei Schichten Paraffinfolie.
Und schütteln Sie den Kolben bei etwa 30 Schwingungen pro Minute in einem 37 Grad Celsius Wasserbad über Nacht. Nach acht bis 16 Stunden die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie die Mischung durch einen 22-Mikrometer-Polyethersulfon-Spritzenfilter in eine Klasseflasche filtern. Für die Anreicherung der Hirnarterie naschen Ernten Sie das Gehirn von einer 250 bis 300 Gramm schweren Sprague Dawley Ratte in ein Becherglas von PBS auf Eis, bevor Sie das Gehirn in eine gewachste Sezierschüssel unter einem Seziermikroskop überführen, das gerade genug PBS enthält, um das Gewebe zu versenken.
Sichern Sie das Gehirn mit zwei bis drei Pins, stellen Sie sicher, dass sie nicht in die Blutgefäße eindringen. Und verwenden Sie scharfe Zangen und kleine chirurgische Schere, um die Hirnarterien und ihre Zweige, die den Kreis von Willis an der Basis des Gehirns bilden, sanft zu sezieren. Als nächstes spülen Sie kurz bis zu einem Zentimeter lange Arteriensegmente in PBS ab, bevor Sie die abspülten Segmente in genügend Cholesterinanreicherungslösung eintauchen, um das Gewebe abzudecken.
Um Veränderungen des Cholesterinspiegels zu bestimmen, verwenden Sie eine frische Flasche filipin Pulver, um eine 10 Milligramm pro Milliliter Stocklösung des Farbstoffs in Dimethylsulfoxid vorzubereiten, und waschen Sie das cholesterinangereicherte Gewebe mit drei fünfminütigen Wäschen in frischem PBS. Nach der letzten Wäsche die Arteriensegmente in 4% Paraformaldehyd für 15 Minuten auf Eis, vor Licht geschützt, vor der Durchlässigung der Proben in 5%Triton in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Gewebe mit drei fünfminütigen Wälzungen in PBS auf einem Shaker waschen, bevor Sie die Proben zu einer 25-Mikrogramm pro Milliliter Endkonzentration der filipin farbstoffen Lösung hinzufügen, für eine Stunde bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt.
Am Ende der Inkubation die Arterienstücke dreimal waschen, wie gezeigt, gefolgt von einer kurzen Spülung mit destilliertem Wasser. Verwenden Sie nach der letzten Wäsche ein Laborgewebe, um überschüssige Flüssigkeit aufzunehmen, und montieren Sie die Arterien mit einem geeigneten Montagemedium auf einen Schlitten. Bedecken Sie die Arterien vorsichtig mit einem Deckelschlupf, achten Sie darauf, das Rollen oder Verdrehen des Gewebes zu vermeiden, und lassen Sie das Dia 24 Stunden bei Raumtemperatur trocknen, geschützt vor Licht.
Wenn das Montagemedium trocken ist, versiegeln Sie die Deckelschlupfkanten mit klarem Nagellack und lassen Sie den Politur 10 bis 15 Minuten trocknen. Dann bilde das Gewebe mit einer Anregung von 340 bis 380 Nanometern und einer Emission von 385 bis 470 Nanometern. Zur Herstellung der phospholipidbasierten Dispersion 200 Mikroliter 10 Milligramm pro Milliliter Chloroform gelöste Lipidlösung, L-alpha-Phosphatidylethanolamin, 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin und Cholesterin in einem 12 Milliliter Glasrohr kombinieren.
Verdampfen Sie die Chloroform in der Haube unter einem Stickstoffstrom, bevor Sie die Lipide in 800 Mikroliter gepuffertem 150 Millimolar Kaliumchlorid und 10 Millimolar Tris HEPES-Lösung aufhängen. Dann versiegeln Sie das Rohr mit Paraffinfolie und beschallen Sie den Rohrinhalt bei 80 Kilohertz 10 Minuten lang, bis sich eine milchige Mischung bildet. Für die Cholesterinanreicherung von Xenopus Oozyten verwenden Sie scharfe Zangen, um den Eierstocksack eines weiblichen Xenopus laevis Froschs in mehreren Regionen zu stören, und legen Sie die Eierstockbrocken in eine 60-Millimeter-Platte mit fünf Millilitern kalziumfreier ND96, ergänzt mit 5 Milligramm pro Milliliter Kollagenase.
Schütteln Sie das Gewebe auf einem Orbital-Shaker bei 60 Schwingungen pro Minute für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation verwenden Sie eine Transferpipette mit einer breiten Spitze, um die Eizelle, die die Lösung enthält, fünf- bis zehnmal kräftig zu pipetten, um die einzelnen Eizellen zu isolieren, und spülen Sie die dunkle Eizellenlösung schnell mit frischem kalziumfreiem ND96 ab, bis die Lösung transparent wird. Als nächstes übertragen Sie 90 Mikroliter der cholesterinangereicherten Phospholipid-basierten Dispersion in einen Brunnen einer 96-Well-Platte und addieren bis zu sechs Eizellen mit möglichst wenig Medium in den Brunnen.
Legen Sie die 96-Wellplatte fünf bis zehn Minuten lang auf einen dreidimensionalen Plattformrotator. Dann fügen Sie einen Tropfen ND96 in den Brunnen, und übertragen Sie die Cholesterin angereicherten Eizellen auf eine 35-Millimeter-Platte mit ND96 für ihre sofortige Analyse. Hier zeigt ein Beispiel einer abgebildeten zerebralen Arterie glatte Muskelschicht die konzentrationsabhängige Zunahme der filipinassoziierten Fluoreszenz, die bei Gewebeanreicherung mit zunehmenden Cholesterinkonzentrationen erzielt wird.
Vor allem drei Stunden nach der Behandlung mit dem Methyl-Beta-Cyclodextrin-Cholesterin-Komplex sank der Cholesterinspiegel im Vergleich zu ihrem Niveau unmittelbar nach der Anreicherung um ca. 50%. Während eine einstündige Inkubationszeit häufig verwendet wird, um die Gewebe und Zellen mit Cholesterin während dieses Ansatzes zu bereichern, sind fünf Minuten Inkubation in der Regel ausreichend, um eine statistisch signifikante Erhöhung des zerebralen arteriellen Cholesteringehalts zu erreichen, der durch biochemischen Cholesterintest auf Cholesterinoxidase-Basiert bestimmt wird. Während keine signifikante Veränderung des Cholesterinspiegels in Xenopus Oozyten beobachtet wird, die mit Kontroll-Phospholipid-basierten Dispersionen angereichert sind, die nicht auf Cholesterin fehlen, steigt der Cholesterinspiegel nach nur fünf Minuten Behandlung mit den Phospholipid-basierten Dispersionen, die Cholesterin enthalten, und bleiben auf diesem Niveau, wenn die Inkubationszeit auf 60 Minuten erhöht wird.
Die Wirksamkeit des Cyclodextrin-basierten Ansatzes zur Anreicherung von Zellen wird auch in Neuronen demonstriert, die frisch aus der CA1-Region des Hippocampus isoliert sind. Tatsächlich führt die Inkubation der Neuronen in Methyl-Beta-Cyclodextrin, das 60 Minuten lang mit Cholesterin gesättigt ist, zu einem mehr als zweifachen Anstieg des Cholesterinspiegels, wie die mit Filipin assoziierte Fluoreszenz beurteilt. Insgesamt sind die beiden wichtigsten Schritte für diese Verfahren die Herstellung der Cholesterinanreicherungsmischung und die Gewährleistung der Integrität des arteriellen Gewebes.
Nach der Cholesterinanreicherung kann man die Funktion der Proteine untersuchen, die von Hypercholesterinämie betroffen sind. Die Fähigkeit, Zellen mit Cholesterin anzureichern, erleichterte die Untersuchung erhöhter Cholesterinwerte in Kardiomyozyten und Neuronen. Die Verwendung von Eizellen ermöglichte es uns zu untersuchen, wie Cholesterin an Ionenkanäle bindet.
Ein Labormantel und Handschuhe werden sie immer für dieses Protokoll getragen. Chloroform und Paraformaldehyd sollten unter einer Dunstabzugshaube verwendet und als sonderwerter Abfall entsorgt werden.
