Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über den Zellzyklus und Keimbahn Stammzellpopulationsdynamik in C.elegans zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie keine Transgene benötigt, sie ist mit immunfluoreszierender Färbung kompatibel und kann modifiziert werden, um Zellen unter vielen verschiedenen Bedingungen zu untersuchen. Ich war sehr aufgeregt, als ich zum ersten Mal sah, dass diese Methode im Scheda-Labor angewendet wurde.
Obwohl diese Methode Einblick in den C.elegans Zellzyklus bieten kann, Kann es auch auf breitere Fragen über Alterung, Ernährung, oder veränderte Genotypen angewendet werden. Im Allgemeinen Labore neu zu dieser Methode kann mit der anfänglichen Idiodisprepation oder C.elegans Hämatoxylin Färbung zu kämpfen. Beginnen Sie mit steriler Technik, um 200 Mikroliter von 10 Millimolar EdU in 100 Milliliter M9 Puffer und die entsprechenden Ergänzungen zu vier Milliliter frisch angebaut über Nacht MG 1693 E.coli-Kultur hinzuzufügen.
Idiodiscious erfordert ein empfindliches Gleichgewicht zwischen EdU und Thymidin-Supplementierung. Da die Menge an Thymidin ausreichen muss, damit der E coli gut wächst, muss die Menge an EdU für den robusten Schutz gegen Nivellierung ausreichen. Nach nicht mehr als 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 200 U/min, verwenden Sie sterile Technik, um die Kultur zwischen zwei bis vier sterilen 50 Milliliter konischen Röhren für die Zentrifugation aufzuteilen.
Setzen Sie die Pellatin vier Milliliter frischen M9 Puffer aus und verwenden Sie dieselbe Pipette, um etwa 8 Tropfen EdU mit edU-Beschriftung E Coli MG1693-Lösung in der Mitte der individuellen Raumtemperatur 60 Milliliter M9 A Wache Petrischalen aufzutragen. Um die EdU-gekennzeichneten Bakterien an die Nematoden zu füttern, verwenden Sie frische SPBS, um die C.Elegans von einer nematoden Wachstumsmediumschale in ein 1,5-Milliliter-Rohr zu waschen und die Tiere kurzzeitig durch Schwerkraft absetzen zu lassen. Waschen Sie die Tiere ein- bis zweimal mit einem Milliliter PBS und verwenden Sie eine Glaspasteurpipette, um die Nematoden in einem winzigen Tropfen PBS auf die Mitte des EdU-Rasens zu übertragen.
Warten Sie einige Minuten, bis die Flüssigkeit absorbiert wird, und brüten Sie die Kultur gemäß dem experimentellen Protokoll mindestens 30 Minuten bei 20 Grad Celsius. Verwenden Sie am Ende der Inkubation zwei Milliliter PBS, um die Würmer von der EdU-Kulturplatte in eine Glassezierschale zu spülen. Nach der Zerlegung und Fixierung der Nematodengonaden, wie zuvor beschrieben, spülen Sie ein kleines Einmilliliter Borosilikatglasrohr und eine lange Glaspasteurpipette mit PBS ergänzt mit 0,1%tween 20 und verwenden Sie die Pipette, um die festen Gonaden in einer kleinen Menge von PBS-Tween in das Rohr zu übertragen.
Sammeln Sie die Gonaden durch Zentrifugation und verwenden Sie eine lange, herausgezogene Glasweidepipette, um so viel Überstand wie möglich zu entfernen, ohne das Gonadenpellet zu stören. Für die EdU-Erkennung fügen Sie 100 MikroLiter EdU-Cocktail zu den Gonaden hinzu und bedecken Sie das Rohr mit Laborfolie für eine 30 bis 60 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Gonaden einmal mit 100 MikroLiter Reaktionsspülpuffer und viermal mit einem Milliliter PBS-Tween waschen.
Nach der letzten Wäsche 25 MikroLiter Anti-Fade-Montagemedium mit DAPI ergänzt in die Probe geben. Während sich das Medium über die Gonaden setzt, legen Sie ein großes 2,5%Agarose-Pad auf ein Standard-Glasmikroskop-Dia. Dann mit einer zweiten Rutsche abflachen.
Als nächstes verwenden Sie eine lange GlaspasteurPipette und halten Sie alle Flüssigkeiten und Gonaden in der schmalen Spitze der Pipette, um den Probenverlust zu minimieren, wenn sie die Gonaden auf das Pad übertragen. Mit einer auf einen Zahnstocher geklebten Wimper verteilen Sie die Gonaden über das Agarosepad und entfernen Sie Staubpartikel. Dann langsam senken Sie eine rechteckige Glasabdeckung rutschen auf die Gonaden, achten darauf, Luftblasen zu vermeiden, und entfernen Jede überschüssige Lösung mit einem Laborgewebe.
Das Zählen von Zellen in drei Dimensionen erfordert zuverlässig einige Übung. Die Verwendung des Zellzähler-Plug-Ins von Fidschi und eines Skripts wie Markierungen der Zellen zum Entfernen von Duplikaten trägt dazu bei, dass die Zählungen reproduzierbar sind. Nachdem der Deckel über Nacht abgelassen wurde, verwenden Sie das Zellzähler-Plug-in und Fidschi, um jeden Kern manuell zu zählen, wobei jeder einzelne Kern nach dem Vorhandensein oder Fehlen von Phosphohiston drei EdU- oder Prägenetorzonen-Etikettierung gekennzeichnet wird.
EdU-Signal kolokalisiert mit DAPI-Signal. In einigen Kernen deckt das EdU-Signal alle Chromosomen ab, während in anderen Kernen das EdU-Signal auf ein bis zwei helle Punkta lokalisiert, wahrscheinlich auf dem X-Chromosom, das sich spät in der S-Phase repliziert. EdU-Signal von einer erfolgreichen 30-Minuten-Etikettierung lokalisiert etwa die Hälfte der Kerne in der Pregenetor-Zone.
Während die Technik bei jungen erwachsenen Tieren des wilden Typs konsequent funktioniert, kann ein signifikanter Bruchteil der 5 Tage alten Hermaphroditen nicht in einem 30-minütigen EdU-Puls gekennzeichnet werden. Die Dauer von G2 kann geschätzt werden, indem der Prozentsatz der Kerne in der M-Phase analysiert wird, die im Laufe des Zeitraums EdU-positiv sind, was die Berechnung des Medians und der maximalen Dauer von G2 ermöglicht. Die Dauer von G2 und G1 kann anhand des Prozentsatzes aller E-Kerne der Prägenetorzone geschätzt werden, die EdU-positiv sind, was die Berechnung der maximalen Dauer der kombinierten Phasen ermöglicht. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dieselbe Charge edU-Gerichte zu verwenden, um die interexperimentelle Variabilität zu minimieren.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Färbung mit zusätzlichen Antikörpern durchgeführt werden oder zusätzliche Fragen über den Zellzyklus, das Zellschicksal oder Signalwege beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Nucleicide Analoga und Parafermeldahyd gefährlich sein kann, und dass Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Nitrolhandschuhen, immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.
