Die Proliferation ist ein wichtiges Maß für die Zellfunktion. Dieses Protokoll ermöglicht es den Ermittlern, einen empfindlichen Proliferationstest in ihren Laboren zu entwickeln, ohne die hohen Kosten für kommerziell erhältliche Kits. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine harte Behandlung von Zellen und/oder die Verwendung von Radioaktivität vermeidet.
Diese Technik demonstriert Vicky Wong, die Leiterin meines Labors. Um die Proliferation zu assay, entfernen Sie vaskuläre glatte Muskelzellen aus einem Kolben mit glatten Muskelzellmedien in 2% fetalem Rinderserum und Platte bei 20.000 Zellen pro Milliliter in DMEM in einer 96-Well-Platte. Wachsen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius über Nacht.
Fügen Sie 30 Nanogramm pro Milliliter Thrombozyten abgeleiteten Wachstumsfaktor zu drei bis sechs Brunnen als positive Kontrolle, um die Proliferation zu stimulieren. Fügen Sie dann PBS der gleichen Anzahl von Bohren als Negativkontrolle hinzu. 72 Stunden inkubieren.
Verdünnen Sie zuvor vorbereitete fünf Millimolar EdU Lager auf einen Millimolar und fügen Sie zwei Mikroliter zu jedem Brunnen für die letzten 24 Stunden der 72 Stunden Kulturperiode. Bewahren Sie einen Satz von Replikationen ohne EdU auf, um die Fluoreszenz und Lumineszenz im Hintergrund zu bestimmen. 24 Stunden später, fixieren Sie die Zellen durch Entfernen von Medien, dann Hinzufügen von 150 Mikroliter pro Brunnen von 4%Paraformaldehyd und inkubieren 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie das Paraformaldehyd und fügen Sie 150 Mikroliter 1%TX-100 in Wasser pro Brunnen hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Waschen Sie dreimal mit PBS, um den TX-100 zu entfernen. Um eingebaute EdU mittels Fluoreszenz zu erkennen, machen Sie 10 Milliliter Etikettierlösung pro 96-Well-Platte kurz vor der Verwendung durch Zugabe von Reagenzien aus Lagerlösungen in der richtigen Reihenfolge: 20 Mikroliter THPTA, 20 Mikroliter Kupfersulfat, fünf Mikroliter Fluorescein-Picolyl-Azid und 100 Mikroliter Natriumascorbat in PBS für ein Gesamtvolumen von 10 Millilitern.
Der wichtigste Schritt besteht darin, die Etikettierungslösung kurz vor der Verwendung zu erstellen. ENTFERNEN Sie PBS aus Brunnen, fügen Sie 150 Mikroliter Etikettierlösung zu jedem Brunnen und inkubieren 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Um alle Kerne zu erkennen, fügen Sie DAPI zu jedem Brunnen hinzu und bilden Sie auf einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Bildplattenleser.
Um manuelles Zählen zu vermeiden und wenn kein bildgebender Plattenleser verfügbar ist, kann dieses Protokoll mit HRP-Azid und einem ELISA-Substrat in eine Lumineszenzauslesung geändert werden. Um EdU mit Luminscence zu erkennen, bereiten Sie zunächst tris-gepufferte Salin mit 0,1%Polysorbat 20 vor. Dann 150 Mikroliter Sperrpuffer zu jedem Brunnen hinzufügen und 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Nach dem Entfernen des Sperrpuffers die Zellen dreimal mit 200 MikroliterPBS waschen. Um eingebaute EdU zu erkennen, bereiten Sie zunächst 10 Milliliter Etikettierlösung pro 96-Well-Platte vor, indem Sie Reagenzien aus Lagerlösungen in der richtigen Reihenfolge hinzufügen. Zuerst 20 Mikroliter THPTA, dann 20 Mikroliter Kupfersulfat, fünf Mikroliter Biotin picolyl-azid, 100 Mikroliter Natriumascorbat in PBS für ein Gesamtvolumen von 10 Millilitern.
Waschen Sie Brunnen fünfmal drei Minuten mit 200 Mikroliter TBST mit Schütteln. Endogene Peroxidasen mit 150 Mikrolitern 0,3% Wasserstoffperoxid 20 Minuten bei Raumtemperatur ablöschen. Nach dem Entfernen von Wasserstoffperoxid fünfmal drei Minuten mit 200 Mikroliter TBST mit Schütteln waschen.
50 Mikroliter verdünnter Streptavidin-Meerrettichperoxidase in TBST zu jedem Brunnen geben und bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubieren. Waschen Sie fünf mal drei Minuten mit 200 Mikroliter TBST mit Schütteln. Fügen Sie 50 Mikroliter chemilumineszierendes ELISA-Substrat zu jedem Brunnen hinzu und lesen Sie sofort in einem Plattenleser, der in der Lage ist, Lumineszenz zu erkennen.
Obwohl fluoreszierende Kerne von einem Standard-Fluoreszenzplattenleser nachgewiesen werden können, wird der Fluoreszenzscan mit Hilfe des Lumineszenzprotokolls in eine homogene Flüssigkeitsauslesung umgewandelt, die mit Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase und einem Standard-ELISA-Substrat nachgewiesen wird. Der Vorteil dieser Methode im Vergleich zu einer fluoreszierenden Auslesung ist eine homogenere Auslesung und die Platte kann in Sekunden abgelesen werden, wie hier zu sehen, als die Proliferation von VSMC als Reaktion auf PDGF gemessen wurde. Der Nachteil ist, dass der Hintergrund höher ist als bei fluoreszenz, daher sind Negative Kontrollen tendenziell höher.
In dem Versuch, die Variabilität zu verringern, wurden die Ergebnisse auf die anfängliche Nzellenanzahl normalisiert. In einem separaten Satz von Experimenten wurde jedoch gezeigt, dass diese Methode nicht empfindlich genug ist, um kleine Unterschiede in den Zellzahlen zu erkennen. Die effizienteste und genaueste Methode zur Zählung von EdU-positiven und Gesamtzellen ist die Verwendung eines bildgebenden Plattenlesers.
Wenn dieser Plattenlesertyp nicht verfügbar ist, liefert die manuelle Zählung auch genaue Ergebnisse. Beim Vergleich dieser beiden Methoden war die positive manuelle Anzahl der EdU mit der automatisierten Anzahl identisch wie die Gesamtzahl der nicht stimulierten Werte. Der Vorteil dieser beiden Methoden ist die Sichtbarkeit der zu zählenden Zellen, eine verbesserte Genauigkeit und die Vermeidung unspezifischer Flecken von Schmutz.
Der Hauptnachteil bei der manuellen Zählmethode ist die Zeit. Denken Sie daran, die Etikettierlösung kurz vor der Verwendung frisch zu machen und fügen Sie die Zutaten in der Reihenfolge hinzu, die im schriftlichen Protokoll angegeben ist. Wenn die Intensität der Färbung dunkel ist, versuchen Sie, das Chelat-Zu-Kupfer-Verhältnis anzupassen.
Denken Sie daran, dass Paraformaldehyd giftig ist. Es sollte in einer Dunstabzugshaube verwendet werden, während Handschuhe tragen. Das Verfahren selbst ist nicht schwierig, muss aber möglicherweise optimiert werden, indem die Chelator- an die Kupferverhältnisse in der Etikettierlösung angepasst werden.
Darüber hinaus können Inkubationszeiten und Dauer der EdU-Behandlung je nach Zelltyp und der gestellten spezifischen Frage angepasst werden. Diese Technik ist mit zellulären Oberflächen- und intrazellulären Färbungen kompatibel, so dass die Eigenschaften von teilenden und nicht teilenden Zellen bestimmt werden können. Obwohl häufig verwendet, um die Proliferation zu messen, kann Klickchemie auch für die metabolische Kennzeichnung von RNA, Proteinen, Fettsäuren und Kohlenhydraten verwendet werden.
Wenn sich das metabolische Ziel auf der Zelloberfläche befindet, können lebende Zellen beschriftet werden.
