Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen geführt Mittel von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung Nr. 323267 erhalten, von der Electricité de France (EDF) und von l&#39;Agence Nationale de la Recherche - Santé-Environnement Santé et Travail-(ANR-SEST, Neurorad).

1. Tierverfahren Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der Richtlinie Europäischen Gemeinschaften Rates vom 24. November 1986 (86/609/EWG) entwickelt und ist von unseren institutionellen Ausschusses für Tierschutz (Cetea-CEA DSV IdF) genehmigt worden. <ol><li> Injektionen mit EdU / BrdU und Bestrahlung von E14.5 schwangeren Mäusen (Abbildung 2A). <ol><li> Eine Lösung aus EdU bei 1 mg / ml BrdU und bei 5 mg / ml in PBS. Ausführen einer intraperitonealen (ip) Injektion von 100 ul EdU Lösung unter Verwendung einer 25 G-Nadel in schwangeren Mäusen. 1,5 Stunden später, bestrahlen Mäusen (Ganzkörperbestrahlung) bei 0 Gy oder 2 Gy (0,6 Gy / min). Unmittelbar nach injizieren (IP) 200 ul BrdU-Lösung mit einer 25 G Nadel in den schwangeren Mäusen. </li></ol></li><li> Vorbereitung der koronalen Scheiben von embryonalen Gehirnen. <ol><li> Bei 1 h oder 4 Stunden nach der Bestrahlung, einschläfern die schwangeren Mäusen durch Kohlendioxid. </li><li> Öffnen Sie die Bauch cavity über drei Zentimeter mit einer Schere. Trennen der beiden Uterushörner von dem Rest des Uterus durch Schneiden beider Enden der Hörner. Übertragung der Uterushörner in eine Petrischale mit PBS 0,6% Glucose. Öffnen der Uterushörner mit der Zange, um die Embryonen zu isolieren. Entfernen Sie die Fruchtblase von jedem Embryo mit einer Pinzette. </li><li> Präparieren Sie embryonalen Köpfe mit einer Pinzette und befestigen Sie sie durch Eintauchen in 4% Paraformaldehyd (PFA, pH = 7,4) O / N bei 4 ° C </li><li> Spülen embryonalen Köpfe in PBS für mindestens eine Nacht bei 4 ° C. Heads in PBS für mehrere Tage aufbewahrt werden. </li><li> Einbettung in Paraffin Köpfe unter Verwendung einer Vakuuminfiltrationsprozessor wie in Tabelle 1 angegeben. Köpfe Einbettung kann auch unter einer chemischen Haube für Ethanol und Xylen Bäder in einem 65 ° C Ofen für die Paraffinbäder durchgeführt werden, und dann. </li><li> Bereiten 5 um dicke koronale Schnitte mit einem Mikrotom. </li><li> Montieren Sie auf Polylysin-beschichtete Objektträger. &lt;/ Li&gt; <li> Folien können bei Raumtemperatur (RT) für mehrere Monate aufbewahrt werden. </li></ol></li></ol> 2. EdU / BrdU-Färbung <ol><li> Entparaffinierung und Antigen-Demaskierung <ol><li> Entparaffinieren Paraffin eingebetteten Gehirnschnitte durch Eintauchen der Objektträger in 3 Bäder Toluol für 5 min. </li><li> Rehydrieren für 3 min in 2 Bäder mit jeweils Lösungen von Ethanolkonzentration abnimmt, wie folgend: Ethanol 100%, 95% Ethanol, 70% Ethanol und 5 min in H 2 O. Folien können in entionisiertem Wasser für mehrere Stunden gehalten werden. </li><li> Koche die Scheiben für 10 min in Citrat-Lösung (10 mM, pH 6) und dann in deionisiertem Wasser für 5 min inkubiert. </li></ol></li><li> EdU Färbung <ol><li> Führen EdU Erfassung gemäß dem Protokoll des Herstellers. Durchdringbar Zellen mit 0,5% Triton X-100 in PBS für 10 min. </li><li> Bereiten 1X EdU Puffer-Zusatz durch Verdünnen der 10X-Lösung in VE-Wasser. Diese Lösung sollte frisch hergestellt und am selben da verwendet werden,y. </li><li> Bereiten EdU Reaktion Cocktail, einschließlich EdU Alexa Fluor 488 Azid. Es ist wichtig, die folgenden Bestandteile, die in Tabelle 2 aufgeführten Reihenfolge hinzugefügt, andernfalls wird die Reaktion nicht optimal ablaufen. Verwenden Sie die EdU Reaktion Cocktail innerhalb von 15 Minuten der Vorbereitung. </li><li> Entfernen Sie die Permeabilisierung Puffer (Schritt 2.1.1), dann zweimal mit PBS waschen. </li><li> In 150 ul EdU Reaktion Cocktail, setzen Sie ein Deckglas, und Inkubation für 30 min im Dunkeln bei RT. </li><li> Entfernen Sie die EdU Reaktion Cocktail, dann einmal mit PBS waschen. </li></ol></li><li> BrdU-Färbung <ol><li> Vorbereitung Sättigungspuffer 7,5% Ziegenserum und 7,5% fötales Rinderserum in PBS. In 150 ul Sättigungspuffer auf Gehirnschnitten, setzen Sie ein Deckglas, und Inkubation für 1 h bei RT, um nicht-spezifische Antikörper blockieren verbindlich. </li><li> Entfernen Sie das Deckglas. In 150 ul Maus-Anti-BrdU primären Antikörper bei 1/300 Sättigungspuffer verdünnt, setzen Sie ein Deckglas und Inkubation O /N bei 4 ° C </li><li> Entfernen Sie das Deckglas, dann waschen Sie 3-mal in PBS. </li><li> In 150 ul Ziege-Anti-Maus-Alexa594 sekundären Antikörper bei 1/400, die in Sättigungspuffer verdünnt, setzen Sie ein Deckglas, und Inkubation für 1 h bei RT. </li><li> Entfernen Sie das Deckglas, dann einmal in PBS waschen. </li><li> Kernfärbung: add 150 ul 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) bei 1 ug / ml in PBS, setzen Sie ein Deckglas und Inkubation für 2 min bei RT. </li><li> Montieren Sie Folien in Montagemedium. </li></ol></li></ol> 3. Analyse <ol><li> Untersuchen Hirnschnitten unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 20x-Objektiv oder ein konfokales Mikroskop und Bilder zu erhalten in drei Kanäle (488 nm, 594 nm und UV) trennt als Dateien. </li><li> Stapeln Sie Bilder mit Photoshop-Software. </li><li> Analysieren Gehirnschnitte in einem Standard-Sektor der dorsomedial Hirn Wand. Dieser Bereich ist 100 um im medial-lateralen Abmessung und ist in 18 bins (oder mehr) von 10 μ geteiltm Höhe in ihrer radialen Abmessung mit einem Raster von Bildern überlagert (Fig. 1), wie zuvor beschrieben 31. <ol><li> Ausrichten des Gitters wie das erste Fach ist an der ventrikulären Oberfläche mit ihrer langen Achse parallel zu der ventrikuläre Grenze. Dann die Nummer des markierten EdU, BrdU-und / oder pyknotische Kerne (entspricht apoptotischen Kerne) in jedem Fach. Anzahl einen Kern an der Grenze der beiden Fächer in den Papierkorb, die seine größeren Teil oder im unteren Behälter enthält, wenn der Zellkern befindet sich gleich Bereiche innerhalb der zwei Behälter entfernt. </li></ol></li><li> Die statistische Analyse. </li></ol> Analysieren Sie mindestens zwei kortikalen Scheiben pro Embryo. Wiederholen Experimente an mindestens 3 Embryonen aus verschiedenen Würfen. Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben werden. Statistische Analysen sind mit Graphpad Prism mit Zwei-Wege-ANOVA und Bonferroni Post-hoc-Mehrfachvergleich Tests durchgeführt.

<ol>
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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Die hier auf der Grundlage Einbau von EdU 1,5 h beschriebenen Versuchsaufbau vor der Bestrahlung und der Einbau von BrdU unmittelbar nach der Bestrahlung erlaubt die Demonstration, die nach einer NSPC sind in der Lage, S und G2 / M Kontrollpunkte aktivieren, nicht aber die G1 / S Kontrollpunkt während der 1. Stunde genotoxischen Stress in der fetalen Gehirn der Maus. Wir führten weitere Experimente, in denen EdU hat zu verschiedenen Zeiten nach der Bestrahlung und BrdU injiziert worden, nur 1 Stunde vor Mä...

Während der embryonalen Entwicklung des Gehirns, werden Projektionsneuronen des zerebralen Kortex in der ventrikulären Zone erzeugt wird, ein mehrreihigen Epithel von verschiedenen Arten von neuralen Stamm-und Vorläuferzellen (NSPC) besteht, die Linien der lateralen Ventrikel. Unter NSPC die radialen Gliazellen (RGC), die als neuronale Stammzellen dienen, unterzogen interkinetic Kernwanderung (INM): sie Mitose führen an der Oberfläche der Herzkammer und der S-Phase an der Grundgrenze des ventrikulären Zone (VZ) 1, 2,3. Sie können entweder symmetrisch teilen, um zwei RGC erzeugen oder asymmetrisch um ein RGC und ein Neuron oder eine Zwischenvorläuferzelle (IPC) 4, 5 zu erzeugen. IPC wandern zu einer darüberliegenden Schicht wuchernden genannt Subventrikularzone (SVZ), wo nach einem letzten symmetrische Teilung sie zwei unreifen Projektionsneuronen 6-8 generieren. Im Gegensatz zu RGC, IPC nicht unterziehen INM (9 Bewertung). Neu erzeugte Neuronen MIGRaß radial entlang der radialen Fasern durch die Zwischenzone (IZ) an ihren Bestimmungsort in der kortikalen Platte (CP) 10, 8 zu erreichen. Das perfekte Timing aller dieser Ereignisse ist von wesentlicher Bedeutung für eine korrekte kortikalen Entwicklung. Zum Beispiel der Wechsel von Proliferation, die Differenzierung von neuronalen Vorläuferpopulationen wird durch die Dauer der G1-Phase 11, 12 gesteuert. Die Verlängerung der G1-Phase korreliert somit mit der Zelldifferenzierung. Genotoxische Stress, wie ionisierende Strahlung, stark beeinträchtigen die Entwicklung des Gehirns (in 13 überprüft). Wir und andere haben gezeigt, dass NSPC sind sehr anfällig für strahlungsinduzierte Apoptose 14, 15,16. Ionisierende Strahlung induziert DNA-Doppelstrangbrüche, die am meisten zu schweren Schäden an wuchernden Zellen sind. Eine wesentliche Komponente der DNA-Schadensantwort (DDR) in Rad-Zellen die Aktivierung von Zellzyklus-Checkpoints in der G1 / S oder G2 / M-Übergänge oder während SPhase (intra-S-Checkpoint) 17-21. Sie blockieren die Zellzyklus-Progression, um Zeit für DNA-Schäden zu reparieren oder Beseitigung von beschädigten Zellen zu liefern. Folglich kann Zelltod sowie verzögerte Progression des Zellzyklus die Entwicklung des Gehirns als Reaktion auf ionisierende Strahlung 22-24 verändern. Es war daher interessant, ein Verfahren, um die Aktivierung von Zellzyklus-Checkpoints in NSPC im bestrahlten Maus embryonale Gehirn beurteilen zu entwickeln. Das Fortschreiten des Zellzyklus wird routinemäßig mit dem Einbau eines Thymidin-Analogon, 5-Bromo-2&#39;-desoxyuridin (BrdU) gefolgt. BrdU während der S-Phase des Zellzyklus, wenn die DNA repliziert aufgenommen. Die Verwendung von einem Antikörper gegen BrdU ermöglicht danach die Detektion von Zellen, in die S-Phase während des Pulses von BrdU waren. Eine neuartige Thymidin-Analogon, 5-Ethinyl-2&#39;-Desoxyuridin (EDU) von einem fluoreszierenden Azid detektiert. Die verschiedenen Möglichkeiten, um EdU und B zu erkennen<html> RDU nicht kreuzreagieren, 25, die den gleichzeitigen Nachweis beider Thymidin-Analoga, die nützlich für das Studium der Zellzyklusprogression ist. Normalerweise Zellen werden zunächst mit EdU gepulst und dann mit BrdU, wo die Zeit zwischen den beiden Eingemeindungen dauert zwei Stunden 25, 26 gepulst. Zugabe von BrdU in Kulturmedien, die EdU führt vorzugsweise Einbau von BrdU in die DNA unter Ausschluss von Bildung, während gleichzeitiger Zugabe von 25 EdU mit äquimolare oder äquimolare BrdU Hälfte der Medien ergibt nur BrdU-Inkorporation 27. Dies erleichtert die doppelten Markierungsprotokoll durch die Beseitigung der Waschschritte, die normalerweise erforderlich sind, um die erste Markierung aus dem Kulturmedium vor der Zugabe des zweiten Etiketts zu entfernen. Dies ist auch von besonderem Interesse für die in-vivo-Studie, in der die Waschschritte sind nicht möglich, den genauen Zeitpunkt der S-Phase Eintritt oder Austritt von Zellpopulation zu bestimmen. t &quot;&gt; Kürzlich wurde ein Verfahren zur Zwei-Puls-Markierung in embryonalen Mäusehirn EdU und mit BrdU 23, 24,22 ist entwickelt worden, um die Zellzyklusprogression und INM der NSPC nach Bestrahlung in utero zu analysieren. Außerdem wurde nachgewiesen, dass bei S-Phase, Maus-Zellen replizieren zunächst die Euchromatin Regionen und dann die perizentrischen Heterochromatin 28,29,30. Interessanterweise perizentrischen Heterochromatin von verschiedenen Chromosomen in interphasic Kerne gruppiert, um heterochromatischen Herde auch als Chromozentren bekannt und leicht durch DAPI-Färbung als helle Herde nachweisbar bilden. Daher werden die Differenz EdU und BrdU-Färbungen von Euchromatin und Chromozentren half uns, genauer zu analysieren Fortschreiten der S-Phase NSPC. Diese Methode erlaubt die Demonstration der scheinbaren Mangel an G1 / S Kontrollpunkt in NSCP 22-24, die ganz überraschend ist, da diese Checkpoint soll entscheidend für die Genomstabilität sein. Mehrere experimental Designs basierend auf verschiedenen Kombinationen von Bildung und BrdU-Impulse werden verwendet, um die Zellzyklusprogression in der ventralen und dorsalen Telen analysieren. Hier geben wir ein Beispiel für die Protokolle, die die Untersuchung der akuten DNA-Schäden von NSPC innerhalb der ersten 4 Stunden nach der Bestrahlung in utero E14.5 Mausembryonen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:228px;">EdU</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">A10044</td>
			<td style="width:163px;">1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">BrdU</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">B5002</td>
			<td style="width:163px;">5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:228px;">IBL 637</td>
			<td style="width:212px;">CIS BIO International</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">Tissu Tek VIP</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Microtome</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;">RM 2125 RT</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:125px;">93443</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:228px;">Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">C10083</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:228px;">Anti-BrdU</td>
			<td style="width:212px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:125px;">RPN202</td>
			<td style="width:163px;">1/300</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:228px;">Goat anti mouse-Alex594</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">A11001</td>
			<td style="width:163px;">1/400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Fluoromount</td>
			<td style="width:212px;">SouthernBiotech</td>
			<td style="width:125px;">0100-01</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:228px;">Polysine slide</td>
			<td style="width:212px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:125px;">J2800AMNZ</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:228px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">P6148</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:228px;">PBS</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">20012-068</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:228px;">DAPI</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">D9542</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">Microscope BX51</td>
			<td style="width:212px;">Olympus</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:228px;">Confocal microscope SPE</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Prism software</td>
			<td style="width:212px;">Graphpad</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;">Version 5.0c</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:228px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:212px;">Adobe</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cell cycle progression of neural stem and progenitor cells in the mouse developing brain after genotoxic stress

Neuronen der Hirnrinde während der Gehirnentwicklung von verschiedenen Arten von neuralen Stamm-und Vorläuferzellen (NSPC), die einen mehrreihigen Epithel der lateralen Ventrikel des embryonalen Gehirn bilden erzeugt. Genotoxischen Stress, wie ionisierende Strahlung, haben hocheilige Wirkungen auf das sich entwickelnde Gehirn, um die hohe Empfindlichkeit NSPC bezogen. Aufklärung der zellulären und molekularen Mechanismen hängt von der Charakterisierung der DNA-Schadensantwort dieser bestimmten Arten von Zellen, die ein genaues Verfahren erfordert NSPC Progression durch den Zellzyklus in der beschädigten Gewebe zu bestimmen. Hier ist eine Methode, die auf aufeinanderfolgende intraperitoneale Injektionen von EdU und BrdU bei schwangeren Mäusen und weiteren Nachweis dieser zwei Thymidin-Analoga in koronalen Abschnitte des embryonalen Gehirns gezeigt. EdU und BrdU sowohl in DNA replizierender Zellen während der S-Phase eingearbeitet und werden von zwei verschiedenen Techniken (Azid oder detektiertein spezifischer Antikörper bezeichnet), die ihre gleichzeitige Detektion zu erleichtern. EdU und BrdU-Färbung werden dann für jedes NSPC Kern in Abhängigkeit von seinem Abstand von der ventrikulären Marge in einem Standardbereich der dorsalen Telen bestimmt. Damit diese doppelte Markierungstechnik ermöglicht die Unterscheidung Zellen durch den Zellzyklus von denen, die Zellzyklus-Kontrollpunkt, die zu Zellzyklusarrest in Reaktion auf DNA-Schäden aktiviert fortgeschritten. Ein Beispiel für ein Experiment vorgestellt, in dem EdU wurde vor der Bestrahlung und unmittelbar nach BrdU injiziert und Analysen innerhalb der 4 Stunden nach der Bestrahlung durchgeführt. Dieses Protokoll stellt eine genaue Analyse der DNA-Schadensantwort akuten NSPC der in Abhängigkeit von der Phase des Zellzyklus in der sie bestrahlt wurden. Dieses Verfahren ist leicht umstellbar auf viele andere Systeme, um die Wirkung einer bestimmten Behandlung auf die Zellzyklus-Progression in lebenden Geweben zu bestimmen.

In der in Fig. 2 beschriebenen Experiment wurde EdU 1,5 h vor der Bestrahlung verabreicht wird und BrdU nur nach Bestrahlung. Vier Arten von Zellen wurden dann in den kortikalen Scheiben auf 1 oder 4 h nach Bestrahlung zubereitet aus, nach dem Einbau von BrdU oder EdU entweder beide oder keines (2A und 2B). Wichtig ist, dass weder EdU noch BrdU-Einbau verändert die Höhe der Strahlung induzierte Apoptose (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus ermöglichen die Färbemet...

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Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress | Neuroscience | Video

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Verwaltung der beiden Analoga von Thymidin, EDU und BrdU, bei schwangeren Mäusen ermöglicht die Analyse des Zellzyklus in neuronalen und Vorläuferzellen im embryonalen Gehirn der Maus. Dieses Verfahren ist nützlich, um die Auswirkungen der genotoxischen Stress, einschließlich ionisierender Strahlung, während der Gehirnentwicklung zu bestimmen.

Beurteilung der Zellzyklus-Progression of Neural Stem-und Vorläuferzellen im sich entwickelnden Gehirn Maus nach genotoxischen Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

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15.2K Aufrufe.  CEA DSV iRCM SCSR.  Verwaltung der beiden Analoga von Thymidin, EDU und BrdU, bei schwangeren Mäusen ermöglicht die Analyse des Zellzyklus in neuronalen und Vorläuferzellen im embryonalen Gehirn der Maus. Dieses Verfahren ist nützlich, um die Auswirkungen der genotoxischen Stress, einschließlich ionisierender Strahlung, während der Gehirnentwicklung zu bestimmen. 

Serie: Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Forschung

Neurowissenschaften

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions in newborn infants. While mosquitos are the main route of viral transmission, it has also been shown to spread via sexual contact and vertical mother-to-fetus transmission. In this latter case of transmission, due to the unique viral tropism of ZIKV, the virus is believed to predominantly target the neural progenitor cells (NPCs) of the developing brain.
Here a method for modeling ZIKV infection, and the resulting microcephaly, that occur when human cerebral organoids are exposed to live ZIKV is described. The organoids display high levels of virus within their neural progenitor population, and exhibit severe cell death and microcephaly over time. This three-dimensional cerebral organoid model allows researchers to conduct species-matched experiments to observe and potentially intervene with ZIKV infection of the developing human brain. The model provides improved relevance over standard two-dimensional methods, and contains human-specific cellular architecture and protein expression that are not possible in animal models.

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

This protocol describes a technique used to model Zika virus infection of the developing human brain. Using wildtype or engineered stem cell lines, researchers may use this technique to uncover the various mechanisms or treatments that may affect early brain infection and resulting microcephaly in Zika virus-infected embryos.

Modellierung der Zika-Virus-Infektion des entwickelnden menschlichen Gehirns In Vitro mit Stammzellen abgeleitet zerebrale Organellen

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.