Diese Arbeit wurde durch eine Wellcome Trust zu gewähren LP unterstützt

1. Ausrüstung und Materialien <ol><li> Diese Experimente mit einem Standard-Elektrophysiologie Aufbau eines Stimulators, einen Stimulus Isolation Unit, zwei Mikroelektroden-Verstärker, ein Datenerfassungssystem und ein Computer mit Sammlung Software enthält. Zusätzliche Ausstattung gehören ein Faraday-Käfig, ein Stereomikroskop auf einem Galgen, eine Schwingungsisolation Tisch, eine Lichtquelle und eine Aufnahme-Plattform. </li><li> Fünf Mikromanipulatoren verwendet werden. Zwei Mikromanipulatoren erfordern feine Steuerungen für die Positionierung der Aufnahme Elektroden, während die anderen drei Mikromanipulatoren nur grobe Steuerung benötigen, um die beiden Stimulationselektroden und der Masseelektrode Position. Der Mikromanipulator für die DLM Aufnahme Elektrode ist am hinteren Ende der Vorbereitung gelegt (links Experimentator) und der Mikromanipulator für die TTM Aufnahme Elektrode wird zwischen dem Experimentator und der Seite der Zubereitung (leicht nach links von der Experimentator) platziert. Die beiden Mikromanipulatoren, dass die Simulation Elektroden halten werden, sind an der Spitze der Zubereitung (rechts Experimentator) platziert. Der Mikromanipulator für die Masse-Elektrode wird auf der anderen Seite der Zubereitung gelegt </li><li> Pull Glas Aufnahme Mikroelektroden mit Widerständen von 40-60 MOhm und speichern in einer Schale mit Wachs unterstützt flach. Zur Stimulation werden zwei elektrolytisch (NaOH) geschärft Wolframelektroden verwendet. Ein Wolfram-Draht, oder eine dritte elektrolytisch hergestellt Elektrode wird als Grund benutzt. Die anregende und Masseelektroden sind vorbereitet und an der Mikromanipulatoren vor Beginn der experimentellen Sitzung und müssen nicht für die Dauer der Sitzung ausgetauscht werden. </li></ol> 2. Vorbereiten des D. melanogaster <ol><li> Sobald Ihr Gerät eingerichtet ist, ist es Zeit, die Fliegen vorzubereiten. Anesthetize die Fliegen durch Kühlung auf ihnen Eis oder mit CO 2. Wenn CO 2 verwendet wird, dann genügend Zeit (ca. 20 Minuten) für die Auswirkungen des Gases zu tragen off vor Beginn des Experiments. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Fliegen leicht übertragen durch ihre Beine, um eine Schale mit einer Plattform von weichem Wachs geneigt in einem Winkel von etwa 45 °. Die nächsten vier Schritte werden unter einem Binokular entfernt (aber in der Nähe) das Kontrollgerät erfolgt. </li><li> Der nächste Schritt ist die Fliege in Wachs zu sichern. Orient-the-fly Bauchseite nach unten, mit seiner vorderen Seite nach oben auf die Piste. Mit einer feinen Pinzette, verlängern die Beine nach außen, in Paaren, und schieben Sie sie in das Wachs. </li><li> Machen Sie sich mit der Lage der Muskeln aus erfasst werden: die dorsale Längsmuskulatur oder DLM und der tergotrochanteral Muskeln oder TTM. Die subkutanen Bindungsstellen des DLMs mit der Region zwischen Brust-Mittellinie und der vorderen Rückenflosse Borsten (oder Borsten) entsprechen. Die TTM Bindungsstellen sind dorsal der hinteren und vorderen supra-alar Borsten entfernt. Sicherzustellen, dass die Flügel nicht behindern den Zugang zu den DLM oder TTM Fasern halten die Flügel nach außen und &quot;Leim&quot; sie, um das Wachs. </li><li> Mit einem feinen Pinzette, ziehen Sie den Rüssel nach außen sorgfältig, und sichern Sie sie durch Eintauchen in das Wachs. Dies ist ein entscheidender Schritt, der einige Übung erfordert, da der Rüssel ist weich und lässt sich leicht vom Rest des Kopfes getrennt. Wenn das passiert, werfen Sie die fliegen und von vorn beginnen. Die Nichtbeachtung der Kopf auf diese Weise sichere führt zu Problemen beim Einlegen der stimulierenden Elektroden durch die Augen. </li></ol> 3. Platzierung der Elektroden <ol><li> Sobald die fliegen, um das Wachs verankert ist, übertragen Sie die Schüssel mit dem beigefügten fliegen unter dem Stereomikroskop, dass im Inneren des Faradayschen Käfigs befindet. Orient-the-fly im Querformat mit dem Kopf der Fliege auf der rechten Seite des Experimentators. </li><li> Der nächste Schritt ist es, die Elektroden legen. Grund-und Stimulationselektroden können, ohne sich durch das Mikroskop eingesetzt werden. Gute Aufnahmen verlassen sich auf präzise impalement, so ist es eine gute Idee zur Praxis der Handhabung des Mikromanipulatoren. Bringen Sie die Elektroden in der Nähe der Standorte der Insertion mit Hilfe von Mikromanipulatoren, um ihre richtige Platzierung und die anschließende Aufnahmen zu erleichtern. </li><li> Senken Sie die Masse-Elektrode in das hintere Ende des Bauches mit der Anpassung Räder auf dem Mikromanipulator. So platzieren Sie den geschärften Wolfram stimulierenden Elektroden im Gehirn, die Mikromanipulator an der Spitze einer der Elektroden so zu positionieren, es berührt nur eine Fliege in die Augen. Machen Sie dasselbe mit den anderen, so dass beide Elektroden nur berühren der Außenseite jedes Auge. Dann drücken Sie die Elektroden, die wiederum durch jedes Auge, so dass die Spitzen der Elektroden erreichen das Gehirn an der Rückseite des Kopfes Kapsel (ca. 2-3mm) gelegen. </li><li> Richtig platziert Elektroden aktiviert die Riesen-Fiber System. Um zu testen, dass die stimulierenden Elektroden richtig platziert sind, tragen Sie eine kurze (0,03 ms) Reiz von 30-60 V über die stimulierenden Elektroden, und suchen Sie nach Bewegung der Flügel und Zuckungen des Fluges / Beinmuskel &quot; </li><li> Der nächste Schritt ist die Back-füllen das Glas-Mikroelektroden mit 3M KCl mit einer Hamilton-oder Wärme-gezogen Plastikspritze, und legen Sie sie in die feine Kontrolle Mikromanipulatoren. Richtig eingesetzt Mikroelektroden können für mehrere Runden von Experimenten verwendet werden. </li><li> Die erste Aufnahme-Elektrode wird in eine DLM-Faser eingesetzt werden. Es gibt zwei bilateral symmetrische DLMs, jeder besteht aus sechs einzelnen Muskelfasern zusammen. Die Aufnahmen können von jedem der sechs Fasern gemacht werden, aber die am häufigsten verwendeten sind DLM Fasern 45a und 45b aufgrund ihrer guten Erreichbarkeit über die Rückenseite des Thorax Kutikula, und die Tatsache, dass beide Fasern, die durch die gleiche Motoneuron innerviert . </li><li> Mit dem Mikromanipulator auf der Seite von Ihnen am weitesten, legen Sie eine Aufzeichnung Elektrode in DLM-Faser 45a oder b. Die Steigung der Plattform ermöglicht die DLM Elektrode an der dorsalen Kutikula bei ~ 60-90 ° Winkel, die das Eindringen Hilfen geben. Verwenden Sie die Software im Oszilloskop-Modus und Blick auf den Computermonitor beim Einsetzen der Aufnahme Elektroden in den Brustkorb. Wenn die Elektrode hat ein Muskel in die Baseline wird auf nahe Null oder einen negativen Wert sinken. Testen Sie mit einem einzigen Reiz zu sehen, wenn Sie die Reaktion des Muskels beobachten können. </li><li> Stecken Sie das andere Aufnahme-Elektrode in die TTM in Ihrer Nähe. Diese Elektrode ist seitlich, vor Ihnen eingefügt, aufgrund der Lage des Muskels Anheftungsstelle. Wieder beobachten Sie den Monitor, während Sie diese und testen Sie mit einem einzigen Reiz, wenn die Spur zeigt die Elektrode in den Muskel. </li></ol> 4. Stimulation und Recording <ol><li> Sie sind nun bereit zu beginnen Stimulation des Gehirns und Aufzeichnung Antworten aus dem Bein und Flugmuskulatur. Tragen Sie eine kurze (0,03 ms) Stimulus über die stimulierenden Elektroden ab 30 V und die Erhöhung auf 60 V, bis Sie eine Antwort zu beobachten (dh ein Muskel zucken, und einer Muskelzelle Depolarisation wie auf dem Computer-Monitor beobachtet). Für den Rest des Experiments, stellen Sie die Spannung 5-10 V oberhalb der Ansprechschwelle. </li><li> Zur Messung Reaktionslatenz, geben mindestens 5 einzelne Reize mit einem 5 Sekunden Pause zwischen jedem Reiz. </li><li> Bestimmen Sie die &quot;Häufigkeit der folgenden&quot; durch Züge von Reizen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten. In der Regel 10 Züge von 10 Stimuli bei 100Hz (10ms zwischen jedem Reiz) gegeben, 200Hz (5ms zwischen den einzelnen Reiz) und 300Hz (3 ms zwischen den einzelnen Stimulus). Lassen Sie eine Ruhezeit von 2 Sekunden zwischen jedem Zug von Reizen. </li></ol> 5. Ergebnisse: Response Latenzen und Häufigkeit der Nach in the Giant Fiber Pathway <ol><li> Die Antwort Latenz ist die Zeitspanne zwischen Stimulation des Gehirns und Depolarisation des Muskels. Diese Zahl vergleicht die Reaktion Latenzen für DLM und TTM auf einen einzigen Reiz. Latenzen zwischen 0,7 und 1,2 ms für die GF-TTM Weg und zwischen 1,3 und 1,7 ms für die GF-DLM Weg weisen auf eine gesunde Zubereitung und richtige Aufnahmetechnik. Die Latenzen können mit Genotyp, genetischem Hintergrund, Temperatur und Alter variieren. Abbildung 1 (A und B). Representative Spuren, Antworten aus dem TTMS und DLMs nach einer einmaligen Reiz Einwirkung auf das Gehirn aufgezeichnet. </li><li> Wie hier gezeigt, zeigen Aufnahmen von der TTM mehr Variabilität in Bezug auf die Amplitude und die Form des postsynaptischen Potentials (PSP) im Vergleich zu denen von den großen DLM Fasern; diese erhöhte Variabilität ist aufgrund der geringen Größe des TTM Muskelfasern. Diese Variabilität ist jedoch nicht auf die Reaktionslatenz Werte für die Riesen-Fiber-to-TTM Weg. Abbildung 1 (C und D). Weitere &#39;Reaktionslatenz &quot;Spuren aus 4 einzelnen fliegt sowohl für die TTM und DLM. Hinweis TTM Spuren weisen Variabilität in PSP Form, sondern Reaktionslatenz bleibt davon unberührt. Für DLM gibt es weniger Variabilität in PSP Form. <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig1.jpg" alt="Abbildung 1 A-D" /> </li><li> Vergleichen Sie die &quot;Häufigkeit der folgenden&quot; bei 100 Hz, 200 Hz und 300 Hz durch die Berechnung des Anteils der erfolgreiche Antworten (von 10) für beide DLM und TTM Wege an jedem Stimulationsfrequenz. Bei 100 Hz, folgen beide TTM und DLM die Reize 1:1. Bei Anregung Frequenzen oberhalb von 100 Hz, starten Sie das DLM Reaktionen auf Störungen zeigen, weil der Vermittler chemischen Synapse zwischen zwei Interneuronen nicht genügend Zeit, um zwischen Reizen zu erholen. Die TTM Antworten, aber 1:1 mit Reizen auch über 300Hz bleiben. Abbildung 2. Representative Spuren, die &quot;Häufigkeit der folgenden&quot;-Aufnahmen. Bei 100Hz, beide TTMS und DLMs, um alle 10 Stimuli (links) zu reagieren. Bei 200Hz, starten Sie das DLM Antworten zu scheitern (Stern). <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig2.jpg" alt="Abbildung 2"> </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Wildtyp kurzer Latenz Antworten (stimulierten Elektroden sind in den Augen, unter Umgehung sensorischen Rezeptoren und die Auslösung der GF-Schaltung direkt) auf Genotyp, genetischem Hintergrund, Temperatur und Alter, und Bereich sind abhängig zwischen 0,7 und 1,2 ms für die GF-TTM-Weg und 1,3 and1.7 ms für die GF-DLM-Weg (Tanouye und Wyman, 1980; Thomas und Wyman, 1984; Engel und Wu, 1992; Allen und Murphey, 2007; Phelan et al, 2008;. Augustin et al, unveröffentlicht.) . Diese sehr kurze Latenzzeit TTM ist aufgrund der robusten GF-TTMn elektrochemische Synapse der monosynaptische Weg und je länger DLM Latenz tritt auf, weil der disynaptic Natur des Weges sowie das Vorhandensein einer chemischen Synapse (PSI-DLMn). Intermediate-und lang-Latenz Reaktionen (&gt; 3 ms) ergeben sich aus der Aktivierung des GF Afferenzen und sind entweder mit einer geringeren Intensität Stimulation oder eine visuelle (&quot;light-off&quot;-Signal) erzielt. Bei 100Hz sowohl TTM und DLM sollten folgen die Reize 1:1. Oberhalb 100Hz DLM Reaktionen beginnen zu Ausfällen zeigen, wie die chemischen Synapse zwischen PSI und der DLMns nicht genügend Zeit, um zwischen Reizen weniger als 10ms auseinander zu erholen. TTM Antworten, jedoch wird 1:1 mit Stimuli sogar darüber hinaus 300Hz (; Engel und Wu, 1992;. Allen et al, 2007;. Martinez et al, 2007 Tanouye und Wyman, 1980) bleiben. Mutationen im Gen shakB, codierend ein Drosophila Gap Junction-Kanal (&quot;innexin&quot;), erhöhen die Response-Latenz des GF-TTM Weg (~ 1,5 ms), während die GF-DLM Zweig ist nicht mehr reagiert (Allen und Murphey, 2007; Phelan et al., 2008). Die Mutante Antwort kann durch die Stimulierung Brustganglien direkt wiederhergestellt werden, die zeigen, dass der verzögerte Effekt nicht durch eine gestörte neuromuskuläre Übertragung. Die Fähigkeit, hochfrequente Stimulation folgen ist auch in diesen Mutanten im Vergleich zum Wildtyp fliegt, wo die GF-DLM und GF-TTM Wege sind in der Regel in der Lage bis 10 Reize mit Verhältnis 1:1 folgen bis zu 100 Hz und 300 Hz, bzw. beeinträchtigt wird. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Frequenzen deutlich über dem normalen Stimulation Frequenzen, die durch die Kontraktion von Muskeln während der anhaltenden Flucht (3-10 Hz) (Hummon und Costello, 1989) empfangen werden. Ein weiterer Parameter verwendet werden, um die Stabilität des GFS-Ausgänge beschreiben, ist das &quot;Refraktärzeit&quot;, oder die minimale Zeit zwischen twin Reizimpulse, die noch produziert zwei Antworten aus dem Muskel. Die feuerfeste variiert zwischen 1-4 ms für TTMS und 7-15 ms für DLMs. Die vergleichsweise lange Refraktärzeit für DLMs ist aufgrund der relativ labilen chemischen Synapsen an der PSI-DLMn Kreuzung (Tanouye und Wyman, 1980; Gorczyca und Hall, 1984; Engel und Wu, 1992; Banerjee et al, 2004;. Allen und Godenschwege, 2010).

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	<li>Allen, M. J., Godenschwege, T., Zhang, B., Freeman, M. R., Wadde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Recordings+from+the+Drosophila+Giant+Fiber+System.">Electrophysiological Recordings from the Drosophila Giant Fiber System.</a> Drosophila Neurobiology: A Laboratory Manual. , (2010).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+an+escape:+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system.">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17, 31-41 (2006).</li><li>Allen, M. J., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+component+of+the+mixed+GF-TTMn+synapse+in+Drosophila+melanogaster+uses+acetylcholine+as+its+neurotransmitter.">The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter.</a> Eur J Neurosci. 26, 439-445 (2007).</li><li>Banerjee, S., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+flight+and+associated+neuronal+rhythmicity+in+inositol+1,4,5-trisphosphate+receptor+mutants+of+Drosophila.">Loss of flight and associated neuronal rhythmicity in inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mutants of Drosophila.</a> J Neurosci. 24, 7869-7878 (2004).</li><li>Engel, J. E., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+membrane+excitability+mutations+affecting+potassium+and+sodium+currents+in+the+flight+and+giant+fiber+escape+systems+of+Drosophila.">Interactions of membrane excitability mutations affecting potassium and sodium currents in the flight and giant fiber escape systems of Drosophila.</a> J Comp Physiol A. 171, 93-104 (1992).</li><li>Gorczyca, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cholinergic+synapse+in+the+giant+fiber+pathway+of+Drosophila+using+conditional+mutations+of+acetylcholine+synthesis.">Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis.</a> J Neurogenet. 1, 289-313 (1984).</li><li>Hummon, M. R., Costello, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+fiber+activation+of+flight+muscles+in+Drosophila:+asynchrony+in+latency+of+wing+depressor+fibers.">Giant fiber activation of flight muscles in Drosophila: asynchrony in latency of wing depressor fibers.</a> J Neurobiol. 20, 593-602 (1989).</li><li>Jacobs, K., Todman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+in+the+giant-fibre+system+of+Drosophila:+interaction+of+the+giant+fibre+and+its+major+motorneuronal+target.">Synaptogenesis in the giant-fibre system of Drosophila: interaction of the giant fibre and its major motorneuronal target.</a> Development. 127, 5203-5212 (2000).</li><li>King, D. G., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+giant+fibre+pathway+in+Drosophila.+I.+Three+thoracic+components+of+the+pathway.">Anatomy of the giant fibre pathway in Drosophila. I. Three thoracic components of the pathway.</a> J Neurocytol. 9, 753-770 (1980).</li><li>Martinez, V. G., Javadi, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+climbing+behavior+and+neural+circuit+physiology+in+Drosophila.">Age-related changes in climbing behavior and neural circuit physiology in Drosophila.</a> Dev Neurobiol. 67, 778-791 (2007).</li><li>Miller, A., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> Biology of Drosophila. , 502-503 (1965).</li><li>Phelan, P., Goulding, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+rectification+at+identified+electrical+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system.">Molecular mechanism of rectification at identified electrical synapses in the Drosophila giant fiber system.</a> Curr Biol. 18, 1955-1960 (2008).</li><li>Power, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thoracico-abdominal+nervous+system+of+an+adult+insect,+Drosophila+melanogaster.">The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect, Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 88, 347-409 (1948).</li><li>Tanouye, M. A., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+outputs+of+giant+nerve+fiber+in+Drosophila.">Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila.</a> J Neurophysiol. 44, 405-421 (1980).</li><li>Thomas, J. B., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+altering+synaptic+connectivity+between+identified+neurons+in+Drosophila.">Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila.</a> J Neurosci. 4, 530-538 (1984).</li></ol>

Eines der wichtigsten Dinge muss man achten, wenn sie versuchen, um qualitativ hochwertige Aufnahmen zu erhalten, ist die korrekte Ausrichtung und die Gesundheit der Vorbereitung. Idealerweise sollte die Fliege noch am Ende der Aufnahme-Session lebendig und reagiert auf elektrische Reize. Für die Aufnahme Elektroden möglichst effizient zu durchdringen der Brust-Exoskelett, sollte die Fliege an der Oberfläche so verklebt werden, um einen rechten Winkel mit den Elektroden bilden, falls erforderlich, das Einsetzen von Elektroden kann durch Entfernen eines Teils des erleichtert werden dorsalen Thorax Nagelhaut mit einem Wolfram-Skalpell damit Freilegung der DLM Flugmuskel (dieser Schritt bietet einen zusätzlichen Vorteil, dass es schwieriger für die Spitzen der Glaselektroden zu brechen). Außerdem muss die Sorgfalt zu vermeiden, schob die Elektroden durch die subcuticularly befindet DLMs und TTMS werden. Der Kopf der Fliege sollte gut gesichert werden, um für die stimulierenden Elektroden richtig in das Gehirn eingesetzt werden, zu ermöglichen und verhindern, dass sie zog während der Aufzeichnung. Aufgrund seiner Größe und gut beschrieben Morphologie, stellt die GFS eine der am besten zugänglichen Nervenbahnen in Drosophila. Die Durchlässigkeit von elektrischen Synapsen zu kleinen Molekulargewicht Tracer Farbstoffe ermöglicht die Visualisierung von elektrisch gekoppelt Neuronen und mehreren verfügbaren GAL4 Linien machen es möglich, die unterschiedliche Expression in einer Untergruppe von Zellen oder Zellverbänden (Jacobs et al, 2000 zu manipulieren;. Allen et al., 2006) Zusätzlich zu den oben genannten Vorteile, sowohl afferente und Thorax-Komponenten der Schaltung Display Eigenschaften wie Gewöhnung, spontane Erholung und Dishabituation, so dass die Drosophila GFS eine bequeme Modellsystem für die Erforschung der neuronalen Plastizität (Engel und Wu, 1996).

<table border="1"><tbody><tr><td> NAMEN </td><td> UNTERNEHMEN </td><td> CAT. # </td><td> KOMMENTARE </td></tr><tr><td> S48 Rechteckimpuls Stimulator </td><td> Grass Instruments </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> Stimulation Einheit </td><td> Grass Instruments </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> SIU5 RF Transformer Isolation Unit </td><td> Grass Instruments </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> 5A Zwei-Kanal-Verstärker intrazelluläre Mikroelektroden </td><td> Erste Instruments </td><td></td><td> http://www.gettinginstruments.com/ </td></tr><tr><td> Digidata 1440A Datenerfassungssystem </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> Analog-Digital-Digidata 1320 und Axoscope 9.0 Software </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> Recording-Plattform mit manueller Mikromanipulatoren </td><td> Narishige, Sutter Ins., World Precision Ins. </td><td></td><td> http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Lichtquelle </td><td> Fostec </td><td></td><td> http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm </td></tr><tr><td> Wilde M5 Stereomikroskop </td><td> Wild Heerbrugg </td><td></td><td> http://www.wild-heerbrugg.com/ </td></tr><tr><td> Schwingungsisolierung Tabelle </td><td> TMC </td><td></td><td> http://www.techmfg.com/ </td></tr><tr><td> Borosilikat-Schlauch für Mikroelektroden </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> P-95 Micropipette puller </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> Microfil 34 Gauge, 67 mm (Elektrode Füllstoff) </td><td> World Precision Instruments </td><td> MF34G-5 </td><td> http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Mikrodissektion Werkzeuge (Zange, ...) </td><td> Feine Science Tools </td><td></td><td> www.finescience.com </td></tr><tr><td> Dissecting (Stereo)-Mikroskop </td><td> Leica </td><td></td><td> http://www.leica-microsystems.com/ </td></tr><tr><td> Faraday-Käfig </td><td> Unbekannter Hersteller </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Sonstiges: Kunststoffspritzen, Wolfram Schutzleiter und NaOH-geschärft Wolframelektroden, KCl, Wachs-Plattform, ein PC mit Monitor ...

electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. melanogaster

Wenn erschrocken erwachsenen D. melanogaster reagieren durch einen Sprung in der Luft und fliegen weg. In vielen wirbellosen Arten, darunter D. melanogaster, Reaktion der &quot;Flucht&quot; (oder &quot;erschrecken&quot;) während der erwachsenen Stadium wird durch die Multi-Komponenten neuronalen Schaltkreis namens the Giant Fiber System (GFS) vermittelt. Die vergleichende Größe der Neuronen, ihre markante Morphologie und einfache Connectivity machen die GFS ein attraktives Modell für die Erforschung von neuronalen Schaltkreisen. Die GFS-Weg besteht aus zwei bilateral symmetrisch Riesen Fiber (GF) Interneurone, deren Axone steigen aus dem Gehirn entlang der Mittellinie in der Brust-Ganglion über den zervikalen Bindegewebe zusammen. In der mesothoracic Neuromer (T2) der ventralen Ganglien der GF Form elektro-chemischen Synapsen mit 1) der großen medialen Dendriten der ipsilateralen Motoneuron (TTMn), die die tergotrochanteral Muskel-Laufwerke (TTM), die wichtigsten extensor für die mesothoracic Femur / Bein und 2) der kontralateralen peripher Synapsen Interneuron (PSI), die wiederum bildet chemische (cholinerge) Synapsen mit den Motoneuronen (DLMns) der dorsalen Längsmuskeln (DLMS), die Flügel Senker. Sie sind nicht direkt an den Flügeln befestigt, sondern bewegen Sie den - Die Nervenbahn (s) zum dorsovental Muskeln (DVMs), die Flügel Aufzüge, wurde noch nicht durchgeführt (die DLMs und DVMs werden gemeinsam als indirekte Flugmuskeln bekannt war Flügel indirekt durch eine Verzerrung der Nähe Thorax Kutikula) (König und Wyman, 1980;. Allen et al, 2006). Die di-synaptischen Aktivierung des DLMs (via PSI) führt zu einer kleinen, aber wichtigen Verzögerung in der Zeitpunkt der Kontraktion dieser Muskeln gegenüber dem monosynaptische Aktivierung von TTM (~ 0,5 ms), wodurch die TTMS zum ersten Verlängerung des Oberschenkelknochens und treiben den Fliege aus dem Boden. Die TTMS gleichzeitig Stretch-Aktivierung der DLMs die wiederum gegenseitig Stretch-Aktivierung der DVMs für die Dauer des Fluges. Die GF-Weg kann entweder indirekt durch die Anwendung einer sensorischen (z. B. &quot;air-puff&quot; oder &quot;Lichter-off&quot;) Stimulus aktiviert werden, oder direkt durch eine supra-Schwelle elektrische Impulse an das Gehirn (hier beschrieben). In beiden Fällen erreicht ein Aktionspotential das TTMS und DLMs ausschließlich über die GFS, PSI und TTM / DLM Motoneuronen, obwohl die TTMns und DLMns haben andere, bisher nicht identifizierten, sensorische Eingänge. Messen &quot;Latenzzeit&quot; (die Zeit zwischen der Stimulation und Muskelschmerzen Depolarisation) und die &quot;folgenden hochfrequente Stimulation&quot; (die Zahl der erfolgreichen Reaktionen auf eine bestimmte Anzahl von Hochfrequenz-Stimuli) bietet eine Möglichkeit, reproduzierbar und quantitativ beurteilen den funktionellen Status der GFS-Komponenten, einschließlich zentraler Synapsen (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) und der chemischen Industrie (glutamatergen) neuromuskulären Synapsen (TTMn-TTM und DLMn-DLM). Es wurde verwendet, um Gene in zentralen Synapsenbildung beteiligt zu identifizieren und ZNS-Funktion zu beurteilen.

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Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System ist eine einfache neuronale Schaltkreis der Erwachsenenbildung<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Mit dem größten Neuronen in-the-fly. Wir beschreiben das Protokoll für die Überwachung der synaptischen Übertragung über diesen Weg durch die Aufnahme postsynaptischen Potentiale in dorsalen Längs-(DLM) und tergotrochanteral (TTM) Muskeln folgende direkte Stimulation des Riesengebirges Fiber Interneuronen.

Elektrophysiologischen Ableitungen aus dem Riesen-Fiber Pathway der D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

14.4K Aufrufe.  University College London - UCL. The Giant Fiber System ist eine einfache neuronale Schaltkreis der Erwachsenenbildung Drosophila melanogaster Mit dem größten Neuronen in-the-fly. Wir beschreiben das Protokoll für die Überwachung der synaptischen Übertragung über diesen Weg durch die Aufnahme postsynaptischen Potentiale in dorsalen Längs-(DLM) und tergotrochanteral (TTM) Muskeln folgende direkte Stimulation des Riesengebirges Fiber Interneuronen.

Serie: Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Einzel Sensillum Recordings in der Insekten Drosophila melanogaster Und Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Forschung

Neurowissenschaften

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Ganze Berge Vorbereitung des Adult Drosophila Bauchmark für Giant Fiber Injection Dye

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

Gepaart Nanoinjection und Elektrophysiologie-Test zum Screening auf Bioaktivität der Verbindungen unter Verwendung des Drosophila melanogaster Riesen-Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Design and Fabrication of Ultralight Weight, Adjustable Multi-electrode Probes for Electrophysiological Recordings in Mice

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic targeting for microcircuit dissection and disease modeling. The introduction of optogenetics, for example, has allowed for bidirectional manipulation of genetically-identified neurons, at an unprecedented temporal resolution. To capitalize on these tools and gain insight into dynamic interactions among brain microcircuits, it is essential that one has the ability to record from ensembles of neurons deep within the brain of this small rodent, in both head-fixed and freely behaving preparations. To record from deep structures and distinct cell layers requires a preparation that allows precise advancement of electrodes towards desired brain regions. To record neural ensembles, it is necessary that each electrode be independently movable, allowing the experimenter to resolve individual cells while leaving neighboring electrodes undisturbed. To do both in a freely behaving mouse requires an electrode drive that is lightweight, resilient, and highly customizable for targeting specific brain structures.
A technique for designing and fabricating miniature, ultralight weight, microdrive electrode arrays that are individually customizable and easily assembled from commercially available parts is presented. These devices are easily scalable and can be customized to the structure being targeted; it has been used successfully to record from thalamic and cortical regions in a freely behaving animal during natural behavior.

Understanding the neural substrates of behavior requires brain circuit ensemble recording. Because of its genetic tractability, the mouse offers a model for circuit dissection and disease mimicry. Here, a method of designing and fabricating miniaturized probes is described that is suitable for targeting deep brain structure in the mouse.

Design und Fertigung von Ultraleichtgewicht, verstellbare Multi-Elektroden-Sonden für elektrophysiologischen Ableitungen in Mäuse

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular recording has historically been a common technique used to study sensitivities of individual photoreceptor cells to different light stimuli that is still being used today. However, there remains a dearth of detailed methodology in the literature for researchers wishing to replicate intracellular recording experiments in the eye. Here we present the insect as a model for examining eye physiology more generally. Insect photoreceptor cells are located near the surface of the eye and are therefore easy to reach, and many of the mechanisms involved in vision are conserved across animal phyla. We describe the basic procedure for in vivo intracellular recording of photoreceptor cells in the eye of a butterfly, with the goal of making this technique more accessible to researchers with little prior experience in electrophysiology. We introduce the basic equipment needed, how to prepare a live butterfly for recording, how to insert a glass microelectrode into a single cell, and finally the recording procedure itself. We also explain the basic analysis of raw response data for determining spectral sensitivity of individual cell types. Although our protocol focuses on determining spectral sensitivity, other stimuli (e.g., polarized light) and variations of the method are applicable to this setup.

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

The electrophysiological technique of intracellular recording is demonstrated and used to determine spectral sensitivities of single photoreceptor cells in the compound eye of a butterfly.

Bestimmung der Sehzellen Spektrale Empfindlichkeit in einem Insekt Modell aus<em&gt; In Vivo</em&gt; Intrazellulärer Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

A Visual Guide to Sorting Electrophysiological Recordings Using 'SpikeSorter'

Few stand-alone software applications are available for sorting spikes from recordings made with multi-electrode arrays. Ideally, an application should be user friendly with a graphical user interface, able to read data files in a variety of formats, and provide users with a flexible set of tools giving them the ability to detect and sort extracellular voltage waveforms from different units with some degree of reliability. Previously published spike sorting methods are now available in a software program, SpikeSorter, intended to provide electrophysiologists with a complete set of tools for sorting, starting from raw recorded data file and ending with the export of sorted spikes times. Procedures are automated to the extent this is currently possible. The article explains and illustrates the use of the program. A representative data file is opened, extracellular traces are filtered, events are detected and then clustered. A number of problems that commonly occur during sorting are illustrated, including the artefactual over-splitting of units due to the tendency of some units to fire spikes in pairs where the second spike is significantly smaller than the first, and over-splitting caused by slow variation in spike height over time encountered in some units. The accuracy of SpikeSorter's performance has been tested with surrogate ground truth data and found to be comparable to that of other algorithms in current development.

A Visual Guide to Sorting Electrophysiological Recordings Using &#039;SpikeSorter&#039;

The article shows how to use the program SpikeSorter to detect and sort spikes in extracellular recordings made with multi-electrode arrays.

Ein Visual Guide to Sortierung elektrophysiologischen Ableitungen Mit &#39;SpikeSorter&#39;

Few stand-alone software applications are available for sorting spikes from recordings made with multi-electrode arrays. Ideally, an application should be ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen zur elektrophysiologischen Bestimmung der Ionenselektivität in Channelrhodopsinen

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...