Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in den Bereichen Zellbiologie und Immunologie zu beantworten, wie sind Signalwege von verschiedenen Reizen oder Medikamenten beeinflusst? Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es Ihnen ermöglicht, einzellige Signalanalyse in der mittleren bis hohen Durchsatz-Mode durchzuführen. Nach der erneuten Aussetzung der Zellen in ergänztem RPMI 16/40 Medium, übertragen Sie die erforderliche Menge an Zellsuspension auf die Brunnen einer 96 well V-Bodenplatte.
Übertragen Sie die Platte in ein vorgeheiztes 37 Grad Celsius Wasserbad und lassen Sie es dort für 10 Minuten ruhen. Dann fügen Sie 60 Mikroliter festen Puffer eins zu jedem Brunnen einer neuen 96 Well Platte, um die fixe Platte einzurichten. Legen Sie diese Platte in das 37 Grad Celsius Wasserbad.
Übertragen Sie eine 50-Mikroliter-Steuerprobe auf die Platte und mischen Sie sie durch Pipettieren nach oben und unten. Optional fügen Sie den Zellen 10 Mikroliter pro Milliliter Anti-IgM hinzu, um den Simulationszeitkurs zu starten und durch Pipettieren nach oben und unten zu mischen. Übertragen Sie eine 50-Mikroliter-Probe zu jedem Zeitpunkt auf die Fixplatte, wobei Sie jede Probe so mischen, wie sie hinzugefügt wird.
Nachdem die letzte Probe hinzugefügt wurde, lassen Sie die Fixplatte im Wasserbad für 10 Minuten. Waschen Sie zunächst die Zellen dreimal mit PBS. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 mal G für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand.
Als nächstes bereiten Sie eine frische 96 Gut V-Bodenplatte mit Barkodierung Reagenzien, durch Pipettier von fünf Mikroliter jedes Barcoding Reagenz in jedem Brunnen Füllung die Anzahl der Brunnen erforderlich, um jede der Proben zu färben. In der festen Zellplatte die Zellen in jedem Brunnen mit 190 Mikroliter PBS wieder aufsetzen. Dann übertragen Sie jeden Brunnen der Zellen auf den entsprechenden Brunnen in der Barkodierungsplatte, wobei sie jeden brunnen gründlich mischen.
Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 20 Minuten im Dunkeln ruhen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 mal G für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Danach die Zellen in jedem Brunnen zweimal mit der Strömungswäsche waschen.
Dann fügen Sie 190 Mikroliter Strömungswäsche zu jedem Brunnen der Zellen hinzu. Kombinieren Sie alle Barcode-Proben in einem 15-Milliliter-Rohr und übertragen Sie jede Kompensationssteuerung auf ein separates 1,7-Milliliter-Rohr. Zentrifuge bei 500 mal G für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand.
Um zu beginnen, übertragen Sie zwei Milliliter Perm Puffer drei auf eine 15 Milliliter Tube. Bei minus 20 Grad Celsius aufbewahren, damit es eiskalt wird, wenn es benutzt wird. Wenn Sie bereit sind, fügen Sie 1,5 Milliliter eiskalten Permpuffer in das 15-Milliliter-Rohr, das die Barcode-Zellpopulation tropfenweise enthält, während sie sich vorwirbeln, um Zellverklumpungen zu vermeiden.
Fügen Sie 100 Mikroliter eiskalten Permpuffer zu jeder der Kompensationskontrollen auf die gleiche Weise hinzu. Die Zellen bei minus 80 Grad Celsius für mindestens 30 Minuten sofort in einen Gefrierschrank geben. Wenn Sie bereit sind, mit der Antigenfärbung zu beginnen, entfernen Sie die Zellen aus dem Gefrierschrank und übertragen Sie sie in eine Eisbox.
Waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Überschuss an Strömungswäsche. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 mal G und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Barcode-Zellpopulation in einem Volumen der Durchflusswäsche wieder auf, so dass es 25 Mikroliter Zellsuspension pro Phospho-Antikörper-Färbung gibt.
Setzen Sie die Kompensationskontrollen in 200 Mikroliter Nließwäsche wieder aus. Um Antikörper für die Färbung vorzubereiten, fügen Sie 10 Mikroliter phosphospezifischer Antikörper, verdünnt in Flow Wash, zu jedem Brunnen einer frischen 96-Gut-V-Bodenplatte hinzu. Fügen Sie 15 Mikroliter Oberflächenmarker, verdünnt in Flow Wash und 25 Mikroliter Zellsuspension zu jedem Brunnen für ein endgültiges Volumen von 50 Mikroliter pro Brunnen.
Lassen Sie die Zellen 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln ruhen. Danach die gebeizten Zellen zweimal mit Flow Wash waschen. Zentrifuge bei 500 mal G für fünf Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 150 Mikroliter Nließwäsche wieder auf. Führen Sie dann eine Flusszytometrieanalyse durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Im vorgestellten Protokoll wird die dreidimensionale Taktierung durch die Kombination von drei Taktkodiern durchgeführt.
Einzelne Proben werden dann durch nachfolgendes Gating auf jedem Barkodierungsreagenz im Vergleich zur seitlichen Streufläche entwirren. Die basalen und stimulationinduzierten Phosphorylierungswerte von 20 Signalmolekülen nach dem B-Zellrezeptor werden dann in B-Zellen von CLL-Patienten und normalen Kontrollen unter verschiedenen Bedingungen charakterisiert. Das stat3 Phospho-Tyrosin 705 ist deutlich nach oben reguliert.
Zellen werden mit Anti-IgM für bis zu 30 Minuten stimuliert, um Signalaberrationen zu identifizieren, die durch den B-Zell-Rezeptor-Weg induziert werden. Während CLL-Zellen von Patienten mit unmutiertem IGVH eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Anti-IgM-Stimulation aufweisen, ist sie für AKT-Phosphor-Serin 473 nur statistisch signifikant. Die Zellen werden dann dem PI 3-Kinase-Delta-Inhibitor Idelalisib ausgesetzt, um zu testen, ob das abnorme AKT pS473-Signal umgekehrt werden kann.
Wie hier gezeigt, werden die aberranten Werte bei der Behandlung in einer konzentrationsabhängigen Weise signifikant reduziert, was zeigt, dass Kinase-Inhibitoren angewendet werden können, um abnorme Signalisierung in CLL-Zellen zu normalisieren. Bevor Sie dieses Verfahren versuchen, sollten Sie daran denken, Barkodierungsreagenzien und Antikörper zu titrieren und zu überprüfen, ob ausgewählte Oberflächenmarker mit Fixierungs- und Permeabilisierungsreagenzien kompatibel sind. Die Zellen müssen für die Phosphoranalyse in Suspension gehalten werden, dennoch kann das Protokoll nach Verfahren an abnorme Zellen oder Gewebe angepasst werden, um eine einzellige Suspension zu erhalten, wie z. B. die gesamte Trypzination.
