Wir möchten Dr. Garry Nolan danken der Stanford University für die Bereitstellung der Phoenix GP Verpackungszelllinie für die Herstellung von retroviralen Partikeln. Wir danken Herrn Dr. Roger Tsien an der University of California in San Diego für die Bereitstellung von td Tomaten. Wir möchten auch die San Diego State University Durchflusszytometrie Core Facility für ihre Dienste und Hilfe danken.

1. Herstellung von Säugerzellen, virale Produktion und Transduction für Genetische Barcoding <ol><li> Tafel 2.5 x 10 6 adhärenten Zellen in einer 10 cm-Platte (oder ungefähr 50-60% Konfluenz) einen Tag vor der Transfektion in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS). Für den produktiven Einsatz retroviralen Verpackungszelllinie der Wahl wie Phoenix-GP (eine Art Geschenk von Gary Nolan, der Stanford University). HINWEIS: Die Verpackungszelllinie stabil exprimiert Gag- und Pol-Proteine, die für retrovirale Teilchenbildung in trans. Vergewissern Sie Zellen gesund sind und an der Platte in einer Monoschicht anhaftet, vor der Transfektion. </li><li> 24 Stunden später, bereiten Sie die DNA-Transfektion Mischung. <ol><li> Bis 125 &amp; mgr; l serumfreiem DMEM hinzuzufügen 3 ug Vesicular Stomatitis Virus-Hüllglykoprotein Vektor (pCI-VSVg) und 3 ug des Transfervektor, der die Fluoreszenz-Protein-Gen von Interesse. Mischen Sie und fügen Sie 15 ul Polyethylimin (2 mg / ml). </li><li> Inkubieren Mischung bei Raumtemperatur für 15 Minuten und in den Zellen tropfenweise. HINWEIS: Polyethylimin wird die homogene DNA-Gemisch als Transfektionsreagenz zur Bildung von Polyplexen zugegeben. Um virale Partikel zu erhalten, die unterschiedliche fluoreszierende Protein-Marker, führen Sie jede Transfektion unabhängig mit dem Marker der Wahl. Denken Sie daran, dass die retroviralen Transfervektors liegt bei etwa 7 kb Länge und kann nicht, wenn oberhalb von 10 kb verpackt werden. </li></ol></li><li> Inkubiere Platten bei 37 ° C. Um Virusproduktion statt Platten bei 30 ° C oder 32 ° C, statt zu erhöhen. HINWEIS: 24 h nach der Transfektion Medien können mit 7 ml frisches Medium ersetzt, und obwohl dies die Zellgesundheit zu verbessern, kann die Viruslast in den Überstand zu verringern. </li><li> 48 Stunden nach der Transfektion sammeln die Überstand-haltigen Viruspartikeln und Filter mit 0,45 uM Polytetrafluorethylenfilter. Verwenden Sie frisch gesammelten Virusüberstand für die Weiterleitung. OthDERNFALLS halten Stand in Aliquots bei -80 ° C und vermeiden Frost-Tau. Beachten Sie, dass Virustiter wird wahrscheinlich bis zu 50% bei jedem Gefrier-Tau-Zyklus zu verringern. </li><li> Plattenzelllinie der Wahl, 24 Stunden vor der Transduktion wenn adhärenten oder unmittelbar vor der Transduktion wenn nicht adhärenten. Seed 2,0 x 10 5 bis 3,0 x 10 5 anhaftenden Zellen (hier Huh 7.5.1 und HEK 293T) oder 5,0 x 10 5 bis 1 x 10 6 nicht-adhärenten Zellen (hier SupT1) pro Napf in einer 6-Well-Platte. HINWEIS: Achten Sie darauf, für die Kalibrierung die Anzahl der Zellen vor der Weiterleitung an ausgesät werden, insbesondere also für adhärente Zellen, also Zellen erreichen eine Konfluenz von etwa 60% zum Zeitpunkt der Weiterleitung. </li><li> Plus 5 ug / ml Polybrene (hexadimethrene Bromid) an ausgesäten Zellen und fügen zuvor gesammelten viralen Überstand auf etwa 20-40% Befall (hier 2 ml) zu erhalten. HINWEIS: Die MOI oder der Prozentsatz der Infektion ist meist willkürlich, da Sortierung ermöglicht, jede subpopulat verstärkenIonen von Zellen. Offensichtlich kann eine höhere Rate der Infektion erleichtert und beschleunigt den Prozess der Amplifikation. </li><li> Transduzieren Zellen durch Zentrifugieren in einer hängenden Schaufelrotor bei 1.500 × g für 120 min bei 32 ° C. Resuspendieren nicht adhärente Zellen mit frischem Medium vor der Inkubation. Für adhärente Zellen, ersetzen Sie sie durch frische Medien 24 Stunden nach der Transduktion. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Platten vor der Zentrifugation mit Parafilm versiegeln, damit kein Ende. Genetisch Barcode-Zellvielfalt zu erhöhen, transduzieren Zellen mit Viruspartikeln, die unterschiedliche Fluoreszenzproteine ​​(aus Schritt 1.4 erhalten). Bei der Auswahl von Fluoreszenzmarkern, sicherzustellen, dass sie mit der Instrumentierung kompatibel sind und diese unterscheiden sich fluoreszierende Parameter. </li></ol> 2. Auswahl und Verstärkung von genetisch mit Strichcode Cells <ol><li> Analysieren transduzierten Säugerzellen mittels Durchflusszytometrie mindestens 72 Stunden nach der Transduktion die Zinses Transduktion quantifizieren. Verwenden Sie einen vergleichbaren nicht-transduzierten Zelllinie als negative Kontrolle. HINWEIS: Sortierung wird verwendet, um einzelne Barcode-Zellpopulationen, einen hohen Prozentsatz der Anfangsübertragung zu reinigen, werden zwar nicht erforderlich, sollte den Prozess der Verstärkung. </li><li> Nutzen Sie die Zell-Sorter der Wahl, um die Zellen, die das Protein von Interesse zum Ausdruck zu erhalten. <ol><li> Zu diesem Zweck sorgen die Tore richtig in die richtigen Kanäle eingestellt. <ol><li> Verwenden Sie dazu die gleiche naive Zelllinie als negative Kontrolle und den Parameter / Kanal-Spannung, so dass die negativen Bevölkerung ist unter den Wert von 10 3 auf jeder Fluoreszenzachse. Bestimmen Sie Gating für positive Fluoreszenz als Ereignisse, die über der von der Negativkontrolle für jede Leuchtstoffkanal angezeigt. </li></ol></li><li> Seien Sie sich bewusst, dass jedes Instrument kann variieren und die richtige Spannung für die Bestimmung Gating entsprechend angepasst werden, so dass positive und negative Kontrollen unerlässlich in jeder experimental Setup. <ol><li> Für Fluoreszenzdetektion in diesem Versuchsaufbau mit dem FITC-Kanal (530/30 Bandpassfilter mit einer 502 Langpassfilter vorgegangen) für eGFP, den PE-Kanal (585/42 Bandpassfilter mit einer 556 Langpassfilter vorgegangen) für td Tomato und die APC-Kanal (660/20 Bandpassfilter) für E2 Hochrot. HINWEIS: Die 488-nm-Laser regt eGFP und td Tomate, während E2 Hochrote wird von der 633 nm Laser angeregt. </li></ol></li></ol></li><li> Sortieren in 15 ml konischen Röhrchen mit 1 ml 100% FCS. HINWEIS: Der Prozess des Sortierens fluoreszierenden Zellpopulationen ist nicht zwingend als eine direkt mit der Art von individuellen Klonen (siehe unten) zu gelangen. Sortieren engen Populationen basierend auf ausgewählten Fluoreszenz sorgt für eine Backup-Bevölkerung für die zukünftige Auswahl von Einzelklonen. Beachten Sie, dass einzelne Zellen sind manchmal schwierig zu wachsen, während eine große Population von Zellen kann leicht eingefroren werden und dann aufgetaut und in einer späteren Phase verstärkt. </li><li> Spin unten sortierten Populationen in einem hängenden Becherrotor Zentrifuge bei 524 g bei 32 ° C für 5 min Zellen zu pelletieren. Re-suspendieren in 1 ml frischem Medium und Wiederplatte Zellen, so dass Zellkonfluenz unter 60% liegt, um das Wachstum und Teilung für mindestens zwei Tage beträgt. <ol><li> Beispielsweise Platte anhaftenden Zellen bei etwa 3 x 10 5 Zellen in 2 ml Medium pro Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen und 2 x 10 6 Zellen in 2 ml Medium in einer 6 cm Platte. Verwenden DMEM für adhärente Zellen und RPMI für nicht-adhärente Zellen (oder einem festgelegten Medium falls erforderlich). Platzieren plattierten Zellen in einem Brutschrank bei 37 ° C über mehrere Tage, um die Amplifikation zu ermöglichen. </li></ol></li></ol> 3. Beschaffen Klonpopulationen gentechnisch mit Strichcode-Zellen bei unterschiedlichen Intensitäten <ol><li> Erhalten klonalen Populationen von Zellen, die ursprünglich transduziert (Schritt 1.7) oder aus der sortierten Population (Schritt 2.3). Hinweis: das wird gleich oder ähnlich Niveau der Fluoreszenz-Protein-Expression unter all der Zelle zu gewährleistens innerhalb der Population (a dichten Population mit einem kleinen CV der mittleren Fluoreszenzintensität von bis zu 40%). <ol><li> Zu diesem Zweck sortiert einzelnen Zellen in 96-Well-Platten mit einer automatischen Zellablagerungseinheit (ACDU). Stellen Tore für die Sortierung nach Populationen von Interesse. Stellen Sie sicher, Tore sind mindestens eine log-Skala abheben, um unterscheidbare Populationen bei der Auswahl von Zellen mit unterschiedlichen Fluoreszenzintensitäten zu erhalten. Bei dem hier dargestellten Vorgehensweise die gleiche Durchflusszytometrie experimentellen up wie die in Schritt 2.2 beschrieben, eingestellt. </li></ol></li><li> Amplifizieren einzelnen Klone in einem Brutschrank bei 37 ° C für mindestens 2 Wochen. Durch den Prozess der Amplifikation analysiert die Zellen unter dem Mikroskop, um zu gewährleisten, dass die wachsende Bevölkerung ergeben sich aus Einzelzellen und nicht aus mehr als einer. HINWEIS: Denken Sie daran, dass der Sorter wird eine Zelle pro Vertiefung im Durchschnitt platzieren, und während einige Brunnen darf keine Zelle überhaupt, andere können mehr als eine haben. <ol><li> Um dies zu gewährleisten, ein povölkerung ergibt sich aus einer Zelle nur, extrem sanft mit der Platte und nicht stören die Brunnen durch Pipettieren. Beachten Sie die Platte gut gut, unter dem Mikroskop. HINWEIS: Während der einzelnen Zellen kann manchmal schwierig sein, zu erkennen, sobald sie anfangen Division sie leicht erkennbar sein. </li><li> Beachten Sie, dass oft Zellen Klumpen &quot;an den Rändern. Entsorgen Sie diese Brunnen, in denen mehrere klonalen Populationen beobachtet werden kann und so alle, die einen engen Bevölkerung haben. HINWEIS: Es ist ratsam, die zu größeren Platten zur Verstärkung übertragen. </li></ol></li><li> Bildschirm des vermeintlichen klonalen Populationen von mittels Durchflusszytometrie analysiert sie. Vergleichen Sie sie mit einer negativen Kontrolle unter Verwendung der gleichen Durchflusszytometrie Versuchsaufbau. <ol><li> Analysieren Sie nur einen Prozentsatz der Probe und den Rest als Backup. Wählen Sie die am deutlichsten getrennte Populationen nach durchschnittlichen Intensität und Engegefühl in der Bevölkerung. Verstärken sie nach Bedarf oder Gefrier Aktien inGefriermedien mit 20% Glycerin bei -80 ° C für kurze Zeit oder flüssigem Stickstoff für längere. HINWEIS: Denken Sie daran, dass eine &quot;wahre&quot; klonalen Population sollte einen sehr engen Fluoreszenzmuster haben. </li></ol></li></ol> 4. Stellen Sie sicher Multiplexing-Funktionen für High Throughput Screening (HTS) <ol><li> Zu kombinieren, wie viele verschiedene klonale Populationen wie benötigt, das in einem gemultiplexten Format weiter genutzt werden kann. Wählen Klone mit unterscheidbaren Absorptions- / Emissionsspektren und / oder unterschiedlicher Intensitäten. Wenn eine 96-Well-Platten-Format verwendet wird, welches geeignet für HTS, Samen 50.000 Zellen in 200 ul pro Vertiefung. HINWEIS: Beachten Sie, dass die Anzahl der Zellen ist nur eine Schätzung und kann auf Zelltyp noch ändern und ob es adhärenten ist oder nicht. </li><li> Analysieren der Probe unter Verwendung von Durchflußzytometrie, um sicherzustellen, daß jeder der unabhängigen fest fluoreszierenden Zelllinien können voneinander unterschieden werden. Vor der Analyse vorzubereiten negativenund einfarbige Controller zu Parametern und Korrekturwerte eingestellt. HINWEIS: Parameter einstellen, um die Mischpopulationen deutlich unterscheiden werden, damit sie weiter in einem Multiplexformat genutzt werden. </li></ol> 5. Passen Genetisch Barcode-Zelllinien auf die biologische Anwendung der Wahl <ol><li> Transduzieren fest genetisch barcodiert Zellinien mit Viruspartikeln, die die Analysenelemente der Wahl enthalten, wie sie hier in Stolp et al. 2013 59 beschrieben. Denken Sie daran, dass der Test der Wahl sollte eine zusätzliche und unterscheidbare Fluoreszenzkanal zu besetzen und so ist es bis zur entsprechenden Barcode-Zelllinie übertragen werden sollen. HINWEIS: Jeder Barcode-Zelllinie können einen anderen Test zu tragen. </li><li> Sortieren genetisch fluoreszierende Barcode-Zellen, die für die, die Testelemente enthalten. HINWEIS: Assay Elemente können an eine Markierung oder fluoreszierende Protein gekoppelt (als Fusion oder durch eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle) konstruiert werden, foder einfache Erkennung durch Western-Blot, Durchflusszytometrie oder Mikroskopie. Der in diesem Protokoll verwendete System beruht auf HA-Epitop Oberflächenexpression alleine oder mit zusätzlichen FLAG-Epitop Ausdruck. <ol><li> Färben die klonalen Populationen, die den Test mit HA und APC-Fluoreszenz-gekoppelten Antikörpern. Dann analysieren die klonalen Populationen mit anti-FLAG und FITC-konjugierten Antikörperfärbung. </li><li> Auf die Spur wieder den Test, Analyse oder &quot;decodieren&quot; die Bevölkerung in den entsprechenden Kanal, wo die verschiedenen gentechnisch Barcode versehen Zelllinien unterschieden werden können. Hier dekodieren die Art des Substrats durch Analysieren von in dem PE-Kanal für td Tomato Detektion. </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier zwei etablierte Verfahren kombiniert wurden; Gentechnik durch retrovirale Technologie und Detektion von fluoreszierenden Proteinen unter Verwendung der Durchflusszytometrie. Fluorescent Protein basierenden genetischen Barcodes für die Herstellung von einzigartigen Zellinien stellt eine robuste und einfache Weise für Verbundanwendungen. Erzeugung gentechnisch barcodierte Zellen durch Retrovirus-Technologie ist zunächst ein langwieriger Prozess, sondern erlaubt es, zu erhalten, einmal etabliert, eine zuverlässige...

Technologien wie Fluoreszenz-Spektroskopie, Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie, alle auf Fluoreszenz, eine Eigenschaft, die weithin in biochemischen, biomedizinischen und chemischen Anwendungen genutzt. Fluoreszenz, ob intrinsische oder durch eine entsprechende Kennzeichnung, wurde für die Analyse von Protein-Expressionsmuster und Profile des Zellschicksals, Protein-Interaktionen und biologischen Funktionen 1-9 ausgeschöpft und durch Fluoreszenz / Förster-Resonanzenergietransfer zur Detektion von Biomolekül-Wechselwirkungen und Konformationsänderungen 10-13. Seit der Isolierung des Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) 14, die Entdeckung weiterer natürlich vorkommende fluoreszierende Proteine ​​aus anderen Cnidaria, insbesondere Korallen, weitgehend die Anzahl der vorhandenen fluoreszierenden Proteinen mit unterscheidbaren Anregungs / Emissionsspektren erhöht. Dies, zusammen mit der Einführung von Mutationen in den Genen 15-19 HAVe die Möglichkeiten weiter ausgebaut, wodurch eine wahre Palette von fluoreszierenden Proteinen den Wissenschaftlern, die Mikroskopie nutzen, Durchflusszytometrie und andere Fluoreszenz-basierten Technologien für ihre Forschung. Parallel zwar unabhängig, die Entwicklung von Retrovirus-Technologie drastisch die stabile Expression des ektopischen genetische Information in Säugerzellen 20-23 erleichtert. Es ist daher nicht überraschend, dass diese Technik verwendet worden, um Gene von fluoreszierenden Proteinen in einer breiten Anzahl von Zelltypen und Geweben 24-28 oder zur Herstellung von transgenen Tieren 29-31 übertragen. Nach der Art der Retroviren wird die genetische Information der ektopischen fluoreszierenden Proteins in das Genom der Zelle 32 eingeführt, und die Zelle wird fluoreszierenden `für ever&#39;. Diese Eigenschaft wurde Tracking der Zellschicksal erlaubt, oder einer einzelnen Zelle innerhalb einer Population von Zellen. Die jetzt fluoreszierende Zelle so acqui hatrot sein eigenes Biosignatur und definiert als Barcode versehen werden. Seine einzigartige Biosignatur identifiziert sie von anderen Zellen, und wichtiger ist, unterscheidet sie von Zellen, die genetisch manipuliert, um verschiedene fluoreszierende Proteine ​​mit unterscheidbaren Absorptions- / Emissionsspektren zum Ausdruck bringen. Biologische Anwendungen wie die Verfolgung von Pluripotenz Reprogrammierungsfaktoren Richtung 33, die Analyse subnuclear Faktoren für die Aufklärung der nukleoläres Lokalisierungs 34, der Aufbau der fluoreszierenden Reporter-Plasmide für die Transkriptionsstudien 35 oder dem genetischen Markierung von Neuronen für die Untersuchung der neuronalen Netzwerkarchitektur 36 sind nur vier Beispiele der vielen, unterschiedlichen Fluoreszenzprotein-Gene für die gleiche Versuchsanordnung ausgenutzt haben. Durchflusszytometrie wurde allgemein zur Analyse der biologischen Prozesse in der Ebene einer einzelnen Zelle, wie beispielsweise die Genexpression, Zellzyklus, Apoptose verwendet und Signalisierung durch Phosphorylation 37-43 .Die stabile Expression von fluoreszierenden Protein Gene in Säugerzellen wurde weiter verbessert den Nutzen der Durchflusszytometrie zur Zellanalyse 38,44 und Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen 45. Erweiterte Möglichkeiten haben Fluss erlaubt Zytometrie auf eine weit verwendete Methode für die Hochdurchsatz-und High-Content-Screening-46 geworden. Trotz der nun erweiterten Anzahl von Fluorometer und Robotik-Technologien, die paar Plattenleser Systeme, Bildgebung und fließen Cytometry, scheint es einen Mangel in der experimentellen Design, das zu nutzen und passen diese erweiterten technologischen Möglichkeiten können. Schnell, zuverlässig, einfach und robust zellbasierten Methoden drastisch für Multiplex-Anwendungen, die weiter zu verbessern Hochdurchsatz-Kapazität benötigt. Dies gilt insbesondere auf dem Gebiet der Wirkstoffentdeckung, wo technische Tests auf Zellbasis in einem gemultiplexten Format kann die Kraft des Hochdurchsatz-Screening-39,47-50 erweitern </sup&gt;. Multiplexing, denn sie ermöglicht die gleichzeitige Analyse in einer Probe, weiterhin verbessert Hochdurchsatzfähigkeiten 51-54. Fluorescent genetischen Barcodes ermöglicht nicht nur elegant Multiplexing, sondern auch, einmal entwickelt, umgeht die Notwendigkeit der zeitaufwendig Protokollen, senkt die Kosten einher mit Antikörpern, Perlen und Flecken 39,52,55 und können die Anzahl der Bildschirme für Hoch zu reduzieren Durchsatz-Anwendungen. Vor kurzem haben wir beschrieben, wie retrovirale Technologie Multiplexing durch fluoreszierende genetischen Barcodes für biologische Anwendungen, durch eine zuvor entwickelte, um HIV-1-Protease-Aktivität 56,57 mit verschiedenen klinisch gängigen Varianten 58 überwachen Test zum Ausdruck zu verbessern. Die Methodik wird in einem aussagekräftigeren Weise erklärt sich auf die Auswahl und verstärken genetisch fluoreszierende Barcode-Zellen und, wie man Platten von klonalen Populationen Ausdruck unterschiedlichen fluoreszierenden Proteinen und / oder unterschiedliche Fluoreszenz intensit produzierener Jahren. Panels von Zellpopulationen zu unterscheiden, basierend auf ihren Fluoreszenzeigenschaften zu verbessern multiplexierten Funktionen, die weiter in Kombination mit zellbasierten Assays, die verschiedene biologische Fragen anzugehen nutzt werden können. Das Protokoll beschreibt auch, wie man eine Gruppe von Barcode-Zellen, die einen der zuvor im Labor entwickelt die zellbasierte Assays zu konstruieren, wie beispielsweise 59. Dieses Protokoll wird damit nicht beabsichtigt, den etablierten retroviralen / lentiviralen Technik des Gentransfers, den Wert von fluoreszierenden Proteinen oder die Anwendungen der Durchflusszytometrie 60,48 zeigen, sondern die Verbesserung der Leistung der Kombination der drei für die Multiplex-Anwendungen zeigen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:515px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10mL syringes</td>
			<td style="width:160px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45&#181;m plytetrafluoroethylen filter</td>
			<td style="width:160px;">pall corporation</td>
			<td>4219</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">45000-304</td>
			<td>cell growth media for HEK 293T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI (Polyethylenimine)</td>
			<td style="width:160px;">poly sciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>&#160;2mg/mL concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Hanging bucket centrifuge (refrigerated)</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5805 000.017</td>
			<td>used for spin infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>used for washing of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polybrene (hexadimethreen bromide)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td>Used to increase viral infection efficiency.&#160; Used at a 5&#181;g/mL concentration.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSAria</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for sorting cell populations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSCanto</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for cell analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phoenix-GP</td>
			<td style="width:160px;">Gift from Gary Nolan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cell line used to produced retroviral particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:160px;">Mediatech</td>
			<td>MT35015CV&#160;</td>
			<td>used for cell growth and sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#160;SupT1 cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1942</td>
			<td>Human T lymphoblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>cell growth media for SupT1 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic barcoding with fluorescent proteins for multiplexed applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Multiplexing Fluoreszenz genetisch barcodiert Zellen zum Zwecke der biologischen Anwendungen kann nur erreicht werden, wenn individuelle klonale Populationen wurden erzeugt. Multiplexing ist am effektivsten, wenn mit Barcode Populationen deutlich unterschiedlichen fluoreszierenden Eigenschaften mit minimalen spektralen Überlappung. Die in Figur 1 mit klonalen Populationen von Säugerzellen SupT1 gezeigte Beispiel zeigt, dass Zellen, die mit Strichcode versehene mCherry und Cyano fluoreszierendes Protei...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications at JoVE.com

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine ​​für Multiplex-Anwendungen

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

genetic-barcoding-with-fluorescent-proteins-for-multiplexed

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K Aufrufe.  San Diego State University. Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications. 

Serie: Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Forschung

Biologie

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Fluoreszenzmarkierung von COS-7 mit dem Ausdruck SNAP-tag-Fusionsproteinen für das Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

Closed System Cell Culture Protocol Mit HyperStack Schiffe mit gasdurchlässigen Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Absolute Quantenausbeute Messung von Pulverproben

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine ​​für Multiplex-Anwendungen

Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine für Multiplex-Anwendungen