이 방법은 세포 생물학 및 면역학의 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있는 어떻게 다른 자극 또는 약에 의해 영향을 받는 신호 통로는 어떻게? 이 기술의 주요 장점은 중간에서 높은 처리량 방식으로 단일 세포 신호 분석을 수행할 수 있다는 것입니다. 보충 된 RPMI 16/40 배지에서 세포를 다시 중단 한 후 필요한 양의 셀 서스펜션을 96 웰 V-바닥 플레이트의 우물로 전송합니다.
접시를 예열된 섭씨 37도의 수조로 옮기고 10분 동안 휴식을 취하십시오. 그런 다음 고정 버퍼 60 마이크로리터를 새로운 96 웰 플레이트의 각 웰에 추가하여 수정 판을 설정합니다. 이 접시를 섭씨 37도 의 수조에 놓습니다.
50 마이크로리터 제어 샘플을 플레이트로 옮기고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 선택적으로, 셀에 밀리리터 안티 IgM당 10 마이크로리터를 추가하여 시뮬레이션 시간 과정을 시작하고 위아래로 파이펫팅하여 혼합합니다. 50 마이크로리터 샘플을 각 시점에서 수정 플레이트에 옮기고 각 샘플을 첨가할 때 혼합합니다.
마지막 샘플을 추가 한 후, 10 분 동안 수조에 픽스 플레이트를 둡니다. 먼저 PBS로 셀을 세 번 씻으시다. 5분 동안 500회 G로 플레이트를 원심분리하고 상판을 폐기합니다.
다음으로, 각 바코딩 시약의 5개의 마이크로리터를 각 음료로 파이프하여 각 시료를 염색하는 데 필요한 우물수를 채우는 바코딩 시약으로 새로운 96개의 V-bottom 플레이트를 준비합니다. 고정 된 세포 판에서, PBS의 190 마이크로 리터와 각 잘 세포를 다시 중단. 그런 다음 각 셀웰을 바코딩 플레이트에 상응하는 우물로 옮기고 각각을 잘 혼합합니다.
접시를 실온에서 20 분 동안 어둠 속에서 쉬게하십시오. 5분 동안 500회 G로 플레이트를 원심분리하고 상판을 폐기합니다. 그 후, 유동 세척으로 각각 두 번 잘 셀을 씻으라.
그런 다음 190 마이크로리터의 유량 세척을 각 셀 웰에 추가합니다. 바코드된 모든 샘플을 15밀리리터 튜브에 결합하고 각 보상 제어를 별도의 1.7 밀리리터 튜브로 전송합니다. 5분간 500회 G의 원심분리기와 상부전을 폐기합니다.
시작하려면 파마 버퍼 3의 밀리리터 2밀리리터를 15 밀리리터 튜브로 옮긴다. 영하 20도에 보관하므로 사용하면 얼음이 차가워집니다. 준비가 되면, 세포 응집을 피하기 위해 소용돌이를 치면서 바코드 세포 인구를 포함하는 15 밀리리터 튜브에 1.5 밀리리터의 얼음 차가운 파마 버퍼를 넣습니다.
각 보상 컨트롤에 100 마이크로리터의 얼음 냉파 파마 버퍼를 동일한 방식으로 추가합니다. 최소 30분 동안 셀을 영하 80도의 냉동고로 즉시 옮춥시다. 항원 염색을 시작할 준비가 되면 냉동고에서 세포를 제거하고 얼음 상자로 옮긴다.
흐르는 세척을 초과하여 셀을 세 번 씻으시면 됩니다. 세포를 500배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다. 상체를 버리고 바코드 세포 집단을 유량 세척의 부피에 다시 일시 중단하는 등 인-항체 얼룩당 세포 현탁액의 25 마이크로리터가 존재한다.
200 마이크로리터의 플로우 워시에서 보상 제어를 다시 일시 중단합니다. 염색을 위한 항체 준비를 시작하려면, 신선한 96 웰 V-바닥 플레이트의 각 웰에, 유동 세척에서 희석된 인 특정 항체의 10 마이크로리터를 추가하십시오. 표면 마커 15 마이크로리터를 추가하여 유동 세척으로 희석되고 25 마이크로리터의 셀 서스펜션을 각 웰에 추가하여 웰당 50 마이크로리터의 최종 부피를 허용합니다.
어두운 실온에서 세포가 30 분 동안 쉬게하십시오. 그 후, 스테인드 셀을 유동 세척으로 두 번 씻으시다. 5분 동안 500배 G의 원심분리기.
상체를 버리고 150 마이크로리터의 유량 세척에서 세포를 다시 중단하십시오. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 흐름 세포 분석작업을 수행합니다. 제시된 프로토콜에서 3차원 바코딩은 3개의 바코딩 염료를 결합하여 수행됩니다.
개별 샘플은 각 바코딩 시약과 측면 분산 영역에 대한 후속 게이팅에 의해 컨볼러우트됩니다. 기저 및 자극 유도 된 인산화 수준 20 B 세포 수용체의 하류 신호 분자는 다음 CLL 환자및 다양한 조건하에서 정상적인 제어에서 B 세포에서 특징지어집니다. stat3 인 티로신 705는 크게 규제된 것으로 보입니다.
세포는 B 세포 수용체 통로를 통해 유도된 신호 수차를 확인하기 위해 최대 30분 동안 항-IgM으로 자극된다. 돌연변이되지 않은 IGVH를 가진 환자로부터 CLL 세포가 항IgM 자극에 대한 민감도를 증가시키면서, AKT 인스포어 세린(473)에 대해서만 통계적으로 유의하다. 세포는 그 때 PI 3-키나제 델타 억제제 idelalisib에 노출되어 비정상적인 AKT pS473 신호가 반전될 수 있는지 테스트한다.
여기에 나타난 바와 같이, 비정상적인 수준은 CLL 세포에서 비정상적인 신호를 정상화하기 위해 키나아제 억제제가 적용될 수 있음을 보여주는 농도 의존적 방식으로 치료 시 현저히 감소된다. 이 절차를 시도하기 전에 바코딩 시약 및 항체를 적재하고 선택한 표면 마커가 고정 및 투과성 시약과 호환되는지 확인하는 것이 중요합니다. 세포는 인광 분석을 위한 현탁액에 있어야 하며, 여전히 프로토콜은 전체 트립치네이션과 같은 단일 세포 현탁액을 얻기 위한 절차 에 따라 비정상적인 세포 또는 조직에 적응될 수 있다.
