Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der RNA-Biologie über den Mechanismus und die Funktion der polarisierten RNA-Lokalisierung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Echtzeit-Visualisierung des endogenen RNA-Handels mit lebenden Geweben ermöglicht. Die Implikationen dieser Technik reichen auf die Therapie von RNA-bedingten Krankheiten, da sie das Potenzial hat, neue therapeutische Ziele aufzudecken.
Obwohl diese Methode Einblicke in RNA-Prozesse in der Fruchtfliegeneikammer geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Zebrafische oder Kulturzellen angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, wegen der Herausforderungen kämpfen, die mit dem Design und der Lieferung der molekularen Leuchtfeuerrequisiten verbunden sind. Wählen Sie für die molekulare Baken-Mikroinjektion das 40X-Ölobjektiv aus und montieren Sie einen Deckelschlupf mit der sezierten Eikammer auf die Mikroskopstufe.
Suchen Sie eine Eikammer in der mittleren bis späten Entwicklungsphase, die richtig für die Mikroinjektion ausgerichtet ist. Dann einen Mikroinjektor mit den entsprechenden Injektions- und Kompensationsdrücken einrichten. Mit dem Mikromanipulator-Joystick senken Sie vorsichtig eine Nadel, die mit einem Mikroliter molekularer Leuchtmittel in den Öltropfen geladen ist.
Bringen Sie die Spitze in den Fokus zur Peripherie des Sichtfeldes. Führen Sie eine saubere Funktion aus, um die Luft von der Nadelspitze zu entfernen und sicherzustellen, dass es Einen Fluss von der Nadel gibt und bringen Sie die Nadel in die Heimatposition. Konzentrieren Sie sich auf die zu mikroinjizierende Eikammer und bringen Sie die Nadel in der Nähe des Rands der Eikammer wieder in den Fokus.
Führen Sie eine Feineinstellung der Z-Position des Objektivs durch, so dass die Membran, die die Follikelzellen von den Pflegezellen trennt, im Fokus steht. Setzen Sie die Nadel für die Injektion der molekularen Leuchttürme über einen Zeitraum von zwei bis fünf Sekunden in eine Ammenzelle ein. Um einen reproduzierbaren Mikroinjektionserfolg zu gewährleisten, konzentrieren Sie sich sorgfältig auf die Membran, die die Follikelzellen und die Pflegezellen trennt, die injiziert werden, während die Spitze der Nadel mit dem Mikromanipulator in den Fokus gerückt wird.
Wenn alle molekularen Baken injiziert wurden, entfernen Sie vorsichtig die Nadel und ziehen Sie sie in die Heimatposition zurück. Ändern Sie das Ziel in die gewünschte Vergrößerung für die Bildaufnahme. Dann konzentrieren Sie sich auf die Eikammer unter dem neuen Ziel und beginnen Sie mit der Bildaufnahme.
Zur Punkterkennung der molekularen Baken öffnen Sie die Bilder in Bild J.Verwenden Sie das Werkzeug Konvertieren in ICY, um die Bilder zurück in ICY zu konvertieren. Eine Maßstabsleiste wird automatisch auf den Stapel gelegt. Bearbeiten Sie die Skalenleiste nach Bedarf über das Inspektorfenster.
Deaktivieren Sie dann das Augensymbol für die Maßstabsleiste unter der Ebenenregisterkarte, um die Maßstabsleiste aus dem ursprünglichen Stapel zu entfernen. Wählen Sie Erkennung und Nachverfolgung, Erkennung und Spotdetektor aus, und bestätigen Sie, dass die aktuelle Sequenzeingangserkennung und der Kanal Null für die Eingabe- und Vorverarbeitungsparameter ausgewählt sind. Für Detektor, wählen Sie hellen Fleck über dunklen Hintergrund mit Kraft Verwendung von 2D-Wellenlängen für 3D nur, wenn es nicht genügend Z-Slices in den Stapeln, um die Analyse durchzuführen.
Wählen Sie Skalen und Empfindlichkeit für jede Skala aus, die weitere Skalen für größere Spots hinzufügt, und bestätigen Sie, dass der Bereich von Interesse aus der Sequenz für den Bereich von Interesse festgelegt ist. Bestätigen Sie zum Filtern, dass keine Filterung festgelegt wurde, und wählen Sie das entsprechende Dateiformat unter Ausgabe aus. Wenn die Ergebnisse des Spotdetektors für die Tracking-Analyse verwendet werden sollen, wählen Sie Export ins Schwimmbad aus.
Wiederholen Sie für die Analyse der Kolokalisierung die Spoterkennung für den anderen Kanal. Um die molekularen Leuchtfeuer zu verfolgen, wählen Sie Erkennung und Verfolgung, Tracking, Spot-Tracking und führen Sie den Spotdetektor mit den gleichen Parametern wie für die Spot-Erkennung aus. Klicken Sie auf Schätzen der Parameter und wählen Sie die gewünschte Zielbewegung im Parameter-Schätz-Popup-Fenster aus.
Klicken Sie dann auf "Run Tracking". Um die Spuren zu visualisieren, wählen Sie Erkennung und Verfolgung, Tracking und Spur-Manager aus. Wählen Sie für den Farbspurprozessor aktivieren aus, und wählen Sie eine Farbe für die Spuren aus.
Wählen Sie unter Spurprozessor den Zeitclip des Spurprozessors aus. Geben Sie im Fenster "Check Clipper" die Anzahl der Erkennungen ein, die vor und nach dem aktuellen Zeitpunkt angezeigt werden sollen. Speichern Sie die Track-Informationen als XML-Spurdatei und verwenden Sie das Kamerasymbol, um einen Screenshot der Ergebnisse zu erhalten.
Um den Stapel entlang der Z-Richtung zu projizieren, verwenden Sie die Suchleiste, um das Plugin zu finden und die maximale Projektion aus dem Dropdown-Menü auszuwählen. Wählen Sie im Inspektorfenster die Sequenzregisterkarte, den Canvas und die Drehung aus, um das Bild an die gewünschte Ausrichtung anzupassen und einen Screenshot des gedrehten Bildes zu erhalten. Wählen Sie dann Region von Interesse, 2D-Interessenbereich, wählen Sie Region von Interesse Form, und wählen Sie die Region von Interesse auf dem Bild für das Zuschneiden.
Installieren Sie das Timestamp-Overlay-Plugin und fügen Sie einen Zeitstempel hinzu, der den Anweisungen im Popup-Fenster folgt, um Anweisungen zum Platzieren und Formatieren des Zeitstempels zu erhalten. Um das Zeitintervall zu ändern oder hinzuzufügen, klicken Sie im Fenster Sequenzeigenschaften auf Bearbeiten. Aktivieren Sie das Augensymbol, um die Maßstabsleiste unter der Ebenenregisterkarte im Inspektorfenster wieder hinzuzufügen.
Dann erhalten Sie einen Screenshot der Zeitstempel-Ergebnisse und speichern Sie das Bild in TIFF- und AVI-Formaten. Mit dieser Methode, wie gezeigt, ist es möglich, die Transport- und Lokalisierungsmuster von endogenen mRNAs über molekulare Baken in verschiedenen Stadien der Oogenese und insbesondere bei und nach der mittleren Oogenese zu visualisieren. Bei einzeln in die gleichen Stadium Eikammern injiziert, verschiedene Oskar spezifische molekulare Leuchttürme präsentieren das gleiche Muster der Lokalisation.
Molekulare Leuchttürme, die in das Zytoplasma einer Ammenzelle injiziert werden, diffundieren frei in benachbarte Pflegezellen sowie in die Eizelle. So sind die Beacons in der Lage, mit ihren Zielen zu hybridisieren und Fluoreszenzsignale an anderen Standorten als der Mikroinjektionsstelle zu erzeugen. In oskar GFP transgene Eikammern bei der mittleren Oogenese zeigt die Analyse der Erfassungsdaten eine umfangreiche Kolokalisierung des Fluoreszenzsignals gentechnisch veränderter GFP-getaggter Oskar mRNA mit dem fluoreszenzsignal, das mit molekularen Baken nachgewiesen wurde.
Darüber hinaus können 5D-Stacks weiter analysiert werden, um Oskar mRNA-Trajektorien für den Ferntransport sowohl in der Krankenschwester natund-Zytoplasma zu bestimmen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der RNA-Biologie, um den endogene mütterliche mRNA-Transport und die Lokalisierung in der Drosophila-Eikammer zu erforschen.
