이 방법은 편광 RNA 국소화의 기계장치 그리고 기능에 관하여 RNA 생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 조직에서 내인성 RNA 인신 매매의 실시간 시각화를 허용한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 새로운 치료 표적을 밝히기 위하여 잠재력을 가지고 있기 때문에 RNA 관련 질병의 치료로 확장합니다.
이 방법은 과일 플라이 계란 챔버에서 RNA 프로세스에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 제브라피시 또는 배양 세포와 같은 다른 시스템에 적용 될 수있다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 개별은 분자 비콘 소품의 디자인 그리고 납품과 관련되었던 도전 때문에 투쟁할 것입니다. 분자 비콘 미세 주입의 경우 40X 오일 목표를 선택하고 해부된 계란 챔버가 있는 커버슬립을 현미경 단계에 장착합니다.
미세 주입을 위해 제대로 지향되는 발달 단계 중반에서 후반까지 계란 챔버를 찾습니다. 그런 다음 적절한 주입 및 보상 압력으로 마이크로 인젝터를 설정합니다. 마이크로 조작기 조이스틱을 사용하여 분자 비콘 용액 1 마이크로리터가 장착된 바늘을 오일 드롭에 부드럽게 낮춥니다.
팁이 시야 주변을 향해 초점을 맞춥니다. 바늘 끝에서 공기를 제거하고 바늘에서 흐르는 것을 확인하고 바늘을 홈 위치로 가져오는 깨끗한 기능을 수행하십시오. 계란 챔버에 초점을 미세 주입 하 고 계란 챔버의 가장자리 근처 초점에 다시 바늘을 가지고.
간호사 세포로부터 여포 세포를 분리하는 막이 초점을 맞출 수 있도록 목표의 z 위치의 미세 조정을 수행한다. 2~5초 동안 분자 비콘을 주입하기 위해 간호사 세포에 바늘을 삽입합니다. 재현 가능한 미세 주입 성공을 보장하기 위해, 마이크로 조작기로 바늘의 끝을 가져오는 동안 주입 될 여포 세포와 간호사 세포를 분리하는 막에 신중하게 초점을 맞춥니다.
모든 분자 비콘을 주입했을 때 바늘을 부드럽게 제거하고 홈 위치로 후퇴하십시오. 이미지 수집을 위해 원하는 배율로 목표를 변경합니다. 그런 다음 새로운 목표에 따라 계란 챔버에 초점을 맞추고 이미지 수집을 시작합니다.
분자 비콘의 스팟 감지를 위해 이미지 J.에서 이미지를 열어 ICY 도구로 변환하여 이미지를 ICY로 다시 변환합니다. 축척 막대가 스택에 자동으로 오버레이됩니다. 필요에 따라 경감 창을 통해 축척 막대를 편집합니다.
그런 다음 레이어 탭 아래의 축척 막대의 눈 아이콘을 비활성화하여 원래 스택에서 축척 막대를 제거합니다. 검출 및 추적, 탐지 및 스팟 검출기를 선택하고 입력 및 전처리 매개 변수에 대해 현재 시퀀스 입력 감지 및 채널 0이 선택됨을 확인합니다. 검출기의 경우 분석을 수행하기 위해 스택에 z 슬라이스가 충분하지 않은 경우에만 3D용 2D 파장의 힘 사용을 사용하여 어두운 배경에서 밝은 지점을 감지하십시오.
더 큰 반점에 대해 더 많은 저울을 추가하고 관심 영역에 대한 시퀀스의 관심 영역이 설정되어 있는지 확인합니다. 필터링의 경우 필터링이 설정되지 않은지 확인하고 출력 에서 적절한 파일 형식을 선택합니다. 스팟 검출기 결과를 추적 분석에 사용하려면 수영장으로 내보내기를 선택합니다.
공동 지역화 해석의 경우 다른 채널에 대한 스팟 검색을 반복합니다. 분자 비콘 반점을 추적하려면 탐지 및 추적, 추적, 스팟 추적을 선택하고 스팟 감지와 동일한 매개 변수를 사용하여 스팟 검출기를 실행합니다. 예상 매개 변수를 클릭하고 매개 변수 추정 팝업 창에서 원하는 대상 모션을 선택합니다.
그런 다음 실행 추적을 클릭합니다. 트랙을 시각화하려면 감지 및 추적, 추적 및 트랙 관리자를 선택합니다. 컬러 트랙 프로세서의 경우 트랙의 색상을 활성화하고 선택합니다.
트랙 프로세서 추가에서 트랙 프로세서 시간 클립을 선택합니다. 체크 클리퍼 창에서 현재 시간 점 전후에 표시할 검색 수를 입력합니다. 트랙 정보를 XML 트랙 파일로 저장하고 카메라 아이콘을 사용하여 결과 스크린샷을 얻습니다.
z 방향을 따라 스택을 투영하려면 검색 모음을 사용하여 플러그인을 찾고 드롭다운 메뉴에서 최대 프로젝션을 선택합니다. 검사기 창에서 시퀀스 탭, 캔버스 및 회전을 선택하여 이미지를 원하는 방향으로 조정하고 회전된 이미지의 스크린샷을 얻습니다. 그런 다음 관심 영역, 관심 영역 2D 영역을 선택하고 관심 영역 을 선택하고 자르기 위해 이미지에 대한 관심 영역을 선택합니다.
타임스탬프 오버레이 플러그인을 설치하고 팝업 창의 지침에 따라 타임스탬프를 추가하여 타임스탬프를 배치하고 포맷하는 방법에 대한 지침을 설정합니다. 시간 간격을 변경하거나 추가하려면 시퀀스 속성 창에서 편집을 클릭합니다. 눈 아이콘을 활성화하여 검사창의 레이어 탭 아래에 있는 축척 막대를 다시 추가합니다.
그런 다음 타임스탬프가 찍힌 결과의 스크린샷을 얻고 TIFF 및 AVI 형식으로 이미지를 저장합니다. 이 방법을 이용하여, 특히 우발생의 다양한 단계, 특히 중기 우발생 후의 분자 비콘을 통해 내생성 mRNAs의 수송 및 국소화 패턴을 시각화할 수 있다. 개별적으로 동일한 단계 계란 챔버에 주입 할 때, 다른 oskar 특정 분자 비콘은 국소화의 동일한 패턴을 제시한다.
간호사 세포의 세포질에 주입된 분자 비콘은 인접한 간호사 세포뿐만 아니라 난소세포로 자유롭게 확산됩니다. 따라서, 비콘은 그들의 표적으로 혼성화하고 마이크로 주입 사이트 보다는 그밖 사이트에 형광 신호를 생성할 수 있습니다. 중반 oogenesis에서 oskar GFP 형질 전환 계란 챔버에서, 수집 데이터의 분석은 분자 비콘을 사용하여 검출된 형광 신호와 함께 유전자 조작 된 GFP 태그 오스카르 mRNA의 형광 신호에 대한 광범위한 지역화를 보여줍니다.
더욱이, 5D 스택은 간호사 세포와 난소세포 세포질 모두에서 장거리 수송을 위한 oskar mRNA 궤적을 결정하기 위해 추가로 분석될 수 있다. 개발 후, 이 기술은 RNA 생물학 분야의 연구원들이 Drosophila 계란 챔버에서 내인성 모계 mRNA 수송 및 국소화를 탐구하는 길을 열었습니다.
