この方法は、二極化RNA局在化のメカニズムと機能に関するRNA生物学分野の主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、生きた組織における内在性RNAの密売のリアルタイム可視化を可能にすることです。この技術の意味は、新しい治療標的を発見する可能性があるため、RNA関連疾患の治療にまで及ぶ。
この方法は、フルーツフライ卵室内のRNAプロセスに関する洞察を提供することができますが、ゼブラフィッシュや培養細胞などの他のシステムにも適用できます。一般的に、この方法に新しい個人は、分子ビーコン小道具の設計と送達に関連する課題のために苦労します。分子ビーコンマイクロインジェクションの場合、40X油の目的を選択し、解剖された卵チャンバーを顕微鏡ステージにカバースリップを取り付けます。
マイクロインジェクションに適した中期から後期の発達段階で卵室を見つけます。次に、適切な注入および補償圧力を備えたマイクロインジェクターを設置する。マイクロマニピュレータージョイスティックを使用して、1マイクロリットルの分子ビーコン溶液を装填した針をオイルドロップにそっと下げます。
視野の周辺に向かって先端に焦点を合わせます。針先から空気を取り除き、針から流れがあることを確認し、針をホーム位置に持って来るために、きれいな機能を実行します。マイクロ注入される卵室に焦点を当て、卵室の端近くに焦点を戻す針を持って来ます。
毛包細胞をナース細胞から分離する膜が焦点となるような目的のz位置の微調整を行う。2~5秒の期間にわたって分子ビーコンを注射するために、針をナースセルに挿入します。再現性のあるマイクロインジェクションの成功を確実にするために、毛包細胞を分離する膜と注射されるナース細胞に注意深く焦点を当て、マイクロマニピュレーターで針の先端を焦点にします。
すべての分子ビーコンが注入されたら、針をそっと取り出し、自宅の位置に引き込みます。目的を画像取得の目的の倍率に変更します。次に、新しい目的の下で卵室に焦点を当て、画像の取得を開始します。
分子ビーコンのスポット検出のために、イメージJ.ICYへの変換ツールを使用して画像をICYに戻します。スケール バーは、スタック上に自動的にオーバーレイされます。必要に応じて、インスペクターウィンドウを使用してスケールバーを編集します。
次に、レイヤータブの下にあるスケールバーの目のアイコンを無効にして、元のスタックからスケールバーを削除します。検出と追跡、検出、スポット検出器を選択し、入力および前処理パラメータに対して現在のシーケンス入力検出とチャネルゼロを確認します。検出器の場合は、解析を実行するのに十分な Z スライスがない場合にのみ、3D の 2D 波長を使用して暗い背景の明るいスポットを検出するを選択します。
スケールごとに尺度と感度を選択し、より大きなスポットにスケールを追加し、シーケンスから対象領域が対象領域に設定されていることを確認します。フィルタリングの場合は、フィルタが設定されていないか確認し、出力で適切なファイル形式を選択します。スポット検出結果を追跡解析に使用する場合は、プールへのエクスポートを選択します。
共局在解析の場合は、他のチャネルのスポット検出を繰り返します。分子ビーコンスポットを追跡するには、スポット検出と同じパラメータを使用して検出と追跡、追跡、スポット追跡を選択し、スポット検出器を実行します。推定パラメータをクリックし、パラメータ推定ポップアップウィンドウで目的のターゲットモーションを選択します。
次に、[追跡の実行] をクリックします。トラックを視覚化するには、検出と追跡、追跡、およびトラック マネージャーを選択します。カラートラックプロセッサの場合は、[有効] を選択し、トラックの色を選択します。
トラックプロセッサの追加から、トラックプロセッサタイムクリップを選択します。チェック クリッパー ウィンドウで、現在のタイム ポイントの前後に表示する検出数を入力します。トラック情報を XML トラックファイルとして保存し、カメラアイコンを使用して結果のスクリーンショットを取得します。
z 方向に沿ってスタックを投影するには、検索バーを使用してプラグインを見つけ、ドロップダウンメニューから最大投影を選択します。インスペクタウィンドウでシーケンスタブ、キャンバス、回転を選択して画像を希望の向きに調整し、回転した画像のスクリーンショットを取得します。次に、対象の領域、2D の対象領域を選択し、対象の領域の形状を選択し、トリミングする画像上の対象領域を選択します。
タイムスタンプオーバーレイプラグインをインストールし、タイムスタンプの配置とフォーマット方法の指示については、ポップアップウィンドウの指示に従ってタイムスタンプを追加します。時間間隔を変更または追加するには、シーケンスプロパティウィンドウで「編集」をクリックします。目のアイコンをアクティブにして、インスペクタ ウィンドウのレイヤー タブの下にあるスケール バーを戻します。
次に、タイムスタンプ付きの結果のスクリーンショットを取得し、TIFF と AVI の両方の形式で画像を保存します。この方法を例示するように使用すると、種々の段階の卵形成の様々な段階、特に中発性の中期における分子ビーコンを介して内在性mRNAの輸送および局在化パターンを可視化することができる。同じステージの卵室に個別に注入すると、異なるオスカー特異的分子標識が同じ局在パターンを提示する。
ナース細胞の細胞質に注入された分子ビーコンは、隣接する看護師細胞および卵母細胞に自由に拡散する。これにより、ビーコンは、マイクロインジェクション部位以外の部位で、標的とハイブリダイズし、蛍光シグナルを生成することができる。中発性のオスカルGFPトランスジェニック卵室では、取得データの分析は、分子ビーコンを使用して検出された蛍光シグナルを用いて遺伝子操作されたGFPタグ付きオスカーmRNAの蛍光シグナルに対する広範な共局在化を示す。
さらに、5Dスタックをさらに解析して、看護師細胞および卵母細胞細胞質の両方で長距離輸送のためのオスカーmRNA軌道を決定することができる。その開発後、この技術は、RNA生物学の分野の研究者がショウジョウバエ卵室で内因性の母体の母RNA輸送と局在を探求する道を開いた。
