We appreciate assistance from members of the fly community, particularly Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley, and Dr. Pernille Rorth, for reagents. We thank Flybase, the Bloomington Drosophila Stock Center, and Developmental Studies Hybridoma Bank for information and providing fly stocks and antibodies, respectively. LM is supported by the Department of Education&#160;Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) and by a NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). A portion of the microscopy work was supported by NSF MRI grant DBI-0722569 and the Keith R. Porter Core Imaging Facility. Research was supported in part by a NSF CAREER Award (1054422) and a Basil O&#8217;Connor Starter Scholar Award from the March of Dimes, both awarded to MSG.

1. Präparation Ovariolen <ol><li> Übertragen Sie etwa fünfzehn 2-4 Tage alte weibliche Fliegen und ein paar Männer auf eine frische fliegen Essen Fläschchen mit Mehr Trockenhefe. Verwenden Baumwolle als Plugin für die Fläschchen, und fügen Sie ein paar Tropfen Wasser auf die Baumwolle, die Luftfeuchtigkeit hoch zu halten. </li><li> Ort Vial in einem 25 ° C Inkubator für 14-16 h, um die Anzahl der Stufe 8-10 Eikammern maximieren. Hinweis: Die Inkubationszeit variiert je nach Temperatur und gewünschte Bühne. </li><li> Bereiten Dissektion Medien, 0,1 M KPO 4 und NP40 Lösungen für den nächsten Tag erforderlich (siehe Materialien). </li><li> Anesthetize die Fliegen mit CO 2, und legen Sie unter einem Dissektionsmikroskop. Pipette einige Tropfen Dissektion Medien in jeden Hohlraum in der Glas Depression Rutsche. </li><li> Halten Zange in jeder Hand in einem ca. 30 ° Winkel zur Tischplatte und orientieren eine weibliche Fliege mit den Flügeln nach unten. Mit Ihrer nicht-dominanten Hand, nehmen Sie den weiblichen mit einer Pinzette, greifen sie an der einnterior des Bauches, in der Nähe des Brustkorbs, und tauchen sie in die Dissektion Medien in der Vertiefung Schieber (1A Einschub). </li><li> Mit der anderen Pinzette, fassen Sie das Exoskelett an der ventralen posterioren des Bauches und durch durchbohren. Besorgen Sie sich die Eierstöcke am hinteren Ende, und ziehen Sie sie aus dem Bauch und legen Sie die frische Medien auf der anderen Seite der Mulde Rutsche. (1A kleines Bild). Vermeiden Auseinanderziehen des Darms. Entsorgen Sie die Karkasse. </li><li> Wiederholen Sie mit den anderen weiblichen Fliegen bis alle Eierstöcke seziert werden. Entsorgen Sie die Männer. </li><li> Mit einer Pinzette, halten Sie ein Eierstock am hinteren Ende (in der Nähe der größten Ei Kammern), und mit der anderen Hand mit einem Pinzette zu einem der vordersten Ei Kammern (Germarium) einklemmen. (1A). </li><li> Langsam und stetig, ziehen eine Ovariole Kette aus dem Eierstock Scheide. Weiterhin individuell sezieren Ovariolen bis alle gewünschten Ei Kammern removed. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,7-1,8 für alle seziert Eierstöcke. </li><li> Wenn Sie fertig sind, übertragen Ovariolen auf eine 0,6 ml Tube mit einem Kunststofftransferpipette. </li><li> Lassen Ovariolen setzen sich am Boden der Röhre, dann nach Fixierung und Färbung Schritten fortfahren. </li></ol> 2. Immunfluoreszenz (IF) Färbung von Ovariolen <ol><li> Dissektion Medium vorsichtig aus Ovariolen mit einer Pipette. Achten Sie darauf, keine Ovariolen oder Eikammern entfernen. Lassen Sie ca. 50 ul Ovariolen und Dissektion Medien. </li><li> In 50 ul von 16% Paraformaldehyd und 150 ul 0,1 M KPO 4 Puffer in einem Rohr, und fügen Lösung Eikammern, sie zu beheben. Inkubation unter Schütteln für 10 min. ACHTUNG: Para ist giftig. </li><li> Entfernen Fixiermittel und spülen Sie zweimal mit 0,5 ml NP40 Waschpuffer. </li><li> Zweimal für 15 Minuten jeweils bei RT waschen. </li><li> Siehe Standard-ZF-Protokoll 15 für den nachfolgenden Schritten. <ol><li> Kurz nach der Fixierung, fügenPrimärantikörper an den geeigneten Verdünnungen inkubieren O / N bei 4 ° C. In NP40 mehrmals waschen, dann fügen Sekundärantikörper (1: 200 Verdünnungen). </li><li> Mehrmals waschen in NP40, dann fügen Sie DAPI (1: 1000) für 10 Minuten, dann wiederholen Wäschen. Sobald IF-Protokoll abgeschlossen ist, fügen Sie 200 ul von 50% Glycerin in PBS zu Eikammern und lassen Sie sich bei Raumtemperatur für 2 Std. </li><li> Entfernen Lösung, ersetzen Sie es mit 70% Glycerin in PBS und mit Folie abdecken. Zeigen Probe bei 4 ᵒC bis einbaufertig. Unterdessen mit Schritt 3 fortfahren. </li></ol></li></ol> 3. Geleistete Vorbereitung von Glycerin Jelly Slides <ol><li> Messen Sie mindestens 4 ml Gelee Glycerin mit einem Spatel und füllen ein Glas Zellkulturröhrchen in die Halbmarathonmarke. Schmelzen Glycerin Gelee in einem Wasserbad bei 55 ° C für 30 min. </li><li> Gießen Sie einen kleinen Tropfen Glycerin, etwa 300 &amp; mgr; l aus der Stammlösung auf zwei Objektträgern. Mit einem Gewebe, verbreiten Glycerin in einer dünnen layer über jede der Folien. Dies liefert eine Basis und ermöglicht die einfache Entfernung von Glycerin Gelee in Schritt 5.6. </li><li> Schneiden Sie die Spitze aus einer gefilterten 1.000 ul Pipettenspitze. Verwenden Schnitt Pipettenspitze 1000-1500 ul warmen Glycerin Gelee langsam auf jedem Objektträger übertragen. Achten Sie darauf, um Blasen zu vermeiden. </li><li> Lassen Glycerin Gelee Folien sitzen für 5 Minuten bei Raumtemperatur eingestellt. </li><li> Platzieren Sie jede Glycerin Gelee Folie in 60 mm x 15 mm Petrischale und mit Plastikfolie abdecken. Bei 4 ° CO / N. Optional Speicher Glycerin Gelee Folien für bis zu 5 Tage bei 4 ° C. </li></ol> 4. Montage Egg Chambers <ol><li> Mit Proben aus Schritt 2.5, Pipette mehr 3 ul Tropfen Eikammern in 70% Glycerin in einem Glycerin Gelee Rutsche. Weiter Pipettieren 3 ul Tropfen, bis alle Eier Kammern sind auf dieser Folie. Stellen Sie sicher, jeder Tropfen mindestens zehn Eikammern. Inzwischen Hitze ein Kulturröhrchen aus Glycerin Gelee in einem 55 ° C Wasserbad. </li><li> Stellen Sie das Glycerin Gelee Rutsche mit Ei Kammern unter einem Dissektionsmikroskop. Einstellen der Vergrößerung, so daß nur ein Tropfen Eikammern ist in dem Sichtfeld (1B). </li><li> Mit einer 30-Gauge-Nadel, wie einem Löffel, nehmen Sie die gewünschte Stufe Eikammer. Wenn nötig, separate gewünschten Ei Kammern von einem Ovariole Kette mit Hilfe der Nadel wie ein Messer. </li><li> Um Verunreinigungen, die mit einer Abbildungs ​​stören können, zu vermeiden, übertragen das Ei Kammer zur zweiten Glycerin jelly Schieber mit dem vorderen zugewandt links (1E -1). Wiederholen, bis es mindestens sieben Eikammern reihen sich in einer Spalte (Abbildung 1C). </li><li> Bilden neue Spalten von sieben bis alle gewünschten Eikammern werden dem zweiten Glycerin jelly Träger übertragen. </li><li> Reißen Sie ein kleines Stück Gewebe und Twist. Verwenden Sie diese Option, um das überschüssige PBS-Glycerin von den Ei Kammern durch leichtes Berühren jeden einzelnen zu absorbieren. Achten Sie darauf, Eikammern nicht entfernen. </li><li> Schneiden Sie dieSpitze eines gefilterten 200 ul Pipettenspitze. Verwenden Sie diese Funktion, um 150 ul Glycerin Gelee, um alle Spalten der Eikammern decken zu übertragen. HINWEIS: Die Menge an Glycerin Gelee benötigt, um die Säulen zu decken auf Eikammer Stufen und die Anzahl der Säulen. Menge eingestellt werden kann. </li><li> Lassen montiert Eikammern sitzen für 5 min bei RT, bis die obere Schicht aus Glycerin Gelee vollständig verfestigt (1D). </li><li> Den Objektträger montiert Ei Kammern in einem 60 mm x 15 mm Petrischale und mit Plastikfolie abdecken. Lagerung bei 4 ° CO / N, damit die Glycerin Gelee Schichten (in der dunklen Ort, wenn es Bedenken über Photobleaching) zusammen zu verfestigen. </li></ol> 5. Herstellung von Egg Chambers for Imaging <ol><li> Zeigen Schieber montiert Ei Kammern unter einem Dissektionsmikroskop. Einstellen der Vergrößerung, so daß nur eine Spalte Eikammern ist in dem Sichtfeld. </li><li> Mit einem Winkel von 45 ° Miniatur Skalpell, schneiden Sie ein straight Linie entlang der rechten Seite der ersten Spalte Eikammern (nahe der hinteren Seite der Eikammern). (1D-E) </li><li> Als nächstes wird über der ersten Eierkammer an der Oberseite und unter der letzten Eikammer in der Spalte geschnitten. An diesem Punkt der Spalte Eikammern sollte auf drei Seiten geschnitten werden. </li><li> Verwendung eines microknife, Scheibe entlang der linken Seite der Säule, so nahe wie möglich an der vorderen Seite der Eikammern (1E -3). </li><li> Je 100 ul kaltem 1X PBT über die Schnitt Spalte. </li><li> Verwenden Sie einen abgerundeten Kanten Spachtel, um das überschüssige Glycerin Gelee um drei Seiten des Schnittes Spalte Eikammern und entsorgen zu entfernen, während der Rest auf der Folie. </li><li> Stecken Sie den Spachtel in den Schnitt an der vorderen Seite des Eier Kammern und trennen Sie die Spalte aus der Primär Glycerin Gelee Block. </li><li> Bereiten Proben entweder invertiert (5.8.1) oder stehend (5.8.2) Mikroskopie. <ol><li> Für Inverses Mikroskop: Transfer ter Spalte Eikammern zu einem Deckglas mit vorderen Seite Eikammern nach unten. Die Schritte 5.2-5.8, bis alle Spalten von Glycerin Gelee wurden entfernt und gelagert. Fügen Sie ein paar Tropfen 50% PBS-Glycerin auf jeden Block von Eikammern, um sie vor dem Austrocknen zu schützen. Bild Eikammern direkt auf Deckglas. </li><li> Für aufrechten Mikroskop: Übertragen Sie die Spalte von Ei Kammern auf einen Objektträger mit der vorderen Seite nach oben ein. Die Schritte 5,2-5,9, bis alle Spalten von Glycerin Gelee wurden entfernt und auf Objektträgern montiert. Fügen Sie ein paar Tropfen 50% PBS-Glycerin auf jeden Block von Ei Kammern und Deckblöcke mit einem # 1 ½ Deckglas. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+oogenesis.">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68 (1), 207-217 (2014).</li><li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+oogenesis.">Drosophila oogenesis.</a> Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li><li>Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+follicle+cells:+morphogenesis+in+an+eggshell.">Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell.</a> Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).</li><li>Bilder, D., Haigo, S. 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M., Niwa, R., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+response+of+protein+localization+and+microtubule+organization+to+nutrient+stress+during+Drosophila+early+oogenesis.">Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis.</a> Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).</li><li>Qui&#241;ones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila.">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).</li><li>Belu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upright+imaging+of+Drosophila+embryos.">Upright imaging of Drosophila embryos.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Hier beschreiben wir eine Methode zu montieren und Bild klein, entwickelt Eikammern von einer End-on-Perspektive. Gemeinsame Methoden zur Bildgebung Ei Kammern für Seitenansichten optimiert und vor allem ermöglichen eine präzise Visualisierung von mediolaterale Follikelzellen, wenn mit fluoreszierenden Antikörpern gefärbt. Die Verwendung von Z-Stapeln oder 3-D-Rekonstruktion Hilfsmittel in Anzeigen mehrerer Brennebenen, aber ist immer noch für subzelluläre Auflösung der Pole des elliptischen Eikammern (2...

Studium der Drosophila melanogaster hat große Einblicke in die genetische Regulation einer Vielzahl von Phänomenen ist. Insbesondere gab es umfangreiche Forschung auf Ei-Entwicklung, da Oogenese eine tractable Weg zu vielen verschiedenen Entwicklungsprozessen, einschließlich Gewebe Strukturieren Zellpolaritätswechsel, Zellzyklus-Schalt und translationale Regulation 1,2,3,4 untersuchen. Ein wichtiger morphogenic Ereignis während der Oogenese ist die Spezifikation, den Erwerb von Motilität und Migration aus einem Satz von Zellen, die sogenannten Randzellen (in 5 überprüft). Da Zellmigration ist ein Schlüsselmerkmal von tierischen Morphogenese und weil die genetische Regulation dieses Prozesses ist gut konserviert, sind wahrscheinlich auch in anderen Zusammenhängen wichtig Mechanismen in Fliegen bestimmt. So untersuchen wir die molekularen Kontrolle der Grenzzellmigration. Für unsere Untersuchungen haben wir eine neue Methode, um die vorderen Pole der sich entwickelnden Eier Beobachtung entwickelt,denen Grenz Zellen entstehen, zu untersuchen, wie sie im Detail zu entwickeln. Innerhalb der Eierstöcke, Eikammern bei verschiedenen Entwicklungsstadien existieren entlang Ketten genannt Ovariolen, die in einer dünnen Hülle (1A) umhüllt sind. Jedes Ei Kammer wird weitergehen, um ein Ei zu bilden. Während der Oogenese, müssen mehrere unterschiedliche Zelltypen in einer koordinierten Art und Weise zu entwickeln. Die D. melanogaster Eikammer aus 16 Keimlinien-Zellen, einschließlich einer Eizelle von einem einlagigen Follikelepithels 6 umgeben. Eine kleine Anzahl von spezialisierten Zellen, die so genannte polare Zellen, entstehen an den vorderen und hinteren Pole des Epithels. Die 6-8 enden Zellen stammen im anterioren Epithel der Eierkammer, von den Polarzellen 5,7 induziert. Mitte der Oogenese (Stufe 9), die Grenzzellen lösen sich von ihren Nachbarn und wandern zwischen den Nährzellen, die Eizelle an der hinteren der Eikammer 5,7 zu erreichen. Diese Bewegung muss erreicht werden,während die Grenzzellen in einer Cluster-Umgebung zwei unbewegliche Polarzellen, so dass dies eine Art kollektive Zellmigration. Erfolgreiche Migration der Grenzzellverband sorgt für die richtige Entwicklung der Mikropyle der Eierschale, die für die Befruchtung notwendig ist. Die vorderen polare Zellen anweisen Grenzzellschicksals durch die Aktivierung eines Signalübertragungskaskade. Polar Zellen eine Cytokin, ungepaarte (UPD), die zu einer Transmembranrezeptor, Domeless (DOME) bindet, auf benachbarte Follikelzellen in Stufe 8 von Oozytenentwicklung 8,9. Die Bindung von UDP verursacht Janus Tyrosin-Kinase (JAK), um das Signal Transducer und Aktivator der Transkription (STAT) 8,10,11 phosphorylieren. STAT bewegt sich dann in den Kern, um die Transkription zu aktivieren. Langsam Border Cells (SLBO) ist ein Transkriptionsfaktor, der eine direkte transkription Ziel von STAT ist und wird auch für die Grenzzellmigration 12 erforderlich. Seitenansichten Eikammern zeigen that STAT-Aktivität wird in einem Gradienten über die vordere Epithel 8,11,13 geregelt. Follikelzellen nächsten zu den polaren Zellen die höchste aktiviert STAT, damit sie sich Randzellen und dringen in den benachbarten Keimbahngewebes. Um zu verstehen, wie die Grenzzellen innerhalb festgelegter und nehmen Sie aus dem Epithel, müssen wir beobachten, wie sich das Gewebe organisiert. Wenn wir sehen Eikammern von einer anterioren-on Sicht würden wir radiale Symmetrie der STAT-Aktivität in den Follikelzellen rund um die Polarzellen erwarten. Eine End-Ansicht würde auch genauer Unterschiede von Membranproteinen und Zell-Zell-Interfaces zeigen vor und während der Ablösung als Vergleich die Zellen in unterschiedlichen Brennebenen. Da Eikammern sind länglich und miteinander durch Stiel Zellen angebracht, auf Objektträger nieder sie seitlich, so dass es schwierig ist, den vorderen Architektur zu beobachten. So viele Informationen über die Zellen, an den Polen des Eies Kammerwurde von Seitenansichten abgeleitet. Obwohl einige Informationen durch algorithmische 3-D-Rekonstruktionen von optischen Schnitten, Lichtstreuung, Photobleaching und schlechtere Auflösungsgrenzen in der Z-Achse erhalten werden diese Angaben weniger detailliert und zuverlässig in der Abwesenheit von teuren Techniken wie superauflösende Mikroskopie 14 . Andere Arten von Abschnitt basierten Bildgebung (beispielsweise Elektronenmikroskopie oder Mikrotom Schnitte) erfordert umfangreiche Manipulation von Geweben, einschließlich Entwässerung, was die Wahrscheinlichkeit für Artefakte. So eine neue Methode zur Bild D. entwickelten wir melanogaster Eikammern während aufrecht. Diese Methode hat sich bereits bei der Aufklärung, wie bewegliche Zellen sind vom Schicksal bestimmt (siehe Repräsentative Ergebnisse und Manning et al, im Berichts) bewährt und dürfte im weiteren Sinne wertvoll in Studien anderer Aspekte der Oogenese sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1027">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:348px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:279px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:283px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:348px;">0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer)</td>
			<td style="width:279px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:283px;">Add 3.1 g of NaH2PO4&#8226;H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:348px;">16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade</td>
			<td style="width:279px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>methanol-free to preserve GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">30G x 1/2 inch needle&#160;</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD305106</td>
			<td>Regular bevel</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:348px;">Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:279px;">Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten female flies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:279px;">PAA-cell culture company</td>
			<td style="width:119px;">A15-701</td>
			<td>Used in NP40 Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:348px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:279px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11295-10</td>
			<td style="width:283px;">Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:348px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td style="width:283px;">5mg/ml stock solution&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:348px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:279px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td style="width:283px;">Added to supplement dissection medium (10%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:348px;">Glass culture tube</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td>47729-576</td>
			<td>14mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Glass Depression Slides</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td>470019-020</td>
			<td>1.2 mm Thick, Double Cavity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Glycerin Jelly&#160;</td>
			<td style="width:279px;">Electron Microsocpy Sciences</td>
			<td>17998-10</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Glycerol</td>
			<td style="width:279px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:119px;">IB15760</td>
			<td>70% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:348px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I3021-500ML</td>
			<td style="width:283px;">(interchangable for Nonidet P-40)&#160; Used in NP40 Wash Buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Leica Fluorescent Stereoscope&#160;</td>
			<td style="width:279px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Leica SP5 Confocal Microscope</td>
			<td style="width:279px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>40x/0.55NA dry objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Micro spatula&#160;</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82027-518</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Microknife&#160;</td>
			<td style="width:279px;">Roboz Surgical Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;">37-7546</td>
			<td>45&#7506; angle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Microscope Slide</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">16004-368</td>
			<td>75x25x1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:348px;">NP40 Wash Buffer</td>
			<td style="width:279px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:283px;">50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td style="width:279px;">Life Technologies</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>Added to supplement dissection medium (0.6X)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Petridish- Polysterine, sterile</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>60Wx15H mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3813-10PAK</td>
			<td>10 packs of Powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3786-500G</td>
			<td>Used in 0.1M KPO4 Buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9791-500G</td>
			<td>Used in 0.1M KPO4 Buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Schneider&#8217;s Insect Medium</td>
			<td style="width:279px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"> 
			11720018</td>
			<td>With L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:348px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002-25G</td>
			<td>Used in fluorescent antibody staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S3014-500G</td>
			<td>Used in NP40 Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">TRIS-HCL</td>
			<td style="width:279px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:119px;">IB70144</td>
			<td>1M TRIS-HCL, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Volocity 3D Image Analysis Software</td>
			<td style="width:279px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For processing confocal Z-stacks</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

upright imaging of drosophila egg chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Die aufrechte bildgebenden Verfahrens konnten wir direkt die Organisation von Zellen in der vorderen Follikelepithels auf Stufe 8 zu sehen Ein allgemeiner Marker für Follikel Zellschicksal, die Augen Absent (EYA) Protein, sowie die Kern-DNA-Marker DAPI, hat auch Ausdruck in diesem Bereich der Zellen, und zeigten, dass alle Zellen könnten mit ähnlichen Färbungsintensitäten (2B &#39;) zu sehen ist. Proteine, die in Reaktion auf das Cytokin UPD reguliert zeigten jedoch erlichen Muster Expressionsnivea...

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Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Upright-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

upright-imaging-of-drosophila-egg-chambers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

7.6K Aufrufe.  University of Maryland Baltimore County. The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Serie: Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-Bilder aus dem<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Augen

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

Imaging Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bei Eiaktivierung

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Analyse der Actomyosin-Dynamik bei lokalen Zellstoff- und Gewebeskalen mit Zeitraffer-Filmen von kultivierten Drosophila-Eierkammern

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging und Analyse von Muskelkontraktionen im Drosophila-Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Auftauen, Kultivierung und Cryopreserving Drosophila -Zell-Linien

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in multicellular organisms. The TGF-&#946; superfamily includes TGF-&#946;, bone morphogenetic protein (BMPs), Activins, Growth and Differentiation Factors, and Nodals. It has long been known that the amount of ligand exposed to cells is important for its effects. It was thought that long-range concentration gradients set up embryonic pattern. However, recently it has become clear that the timing of exposure to these ligands is also important for their downstream transcriptional consequences. A TGF-&#946; superfamily ligand cannot have a developmental consequence until it is released from the cell in which it was produced. Until recently, it was difficult to determine when these ligands were released from cells. Here we show how to measure the release of a Drosophila BMP called Decapentaplegic (Dpp) from the cells of the wing primordium or wing disc. This method could be modified for other systems or signaling ligands.

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The timing of exposure to ligands may impact their developmental consequences. Here we show how to image release of a Drosophila bone morphogenetic protein (BMP) called Dpp from cells of the wing disc.

Imaging Dpp Release von einer Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Ganztierbildgebung von Drosophila melanogaster mittels Mikrocomputed Tomographie

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Dissektion und Live-Imaging der späten embryonalen Drosophila-Gonade

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...