Diese Technik ermöglicht es, lange biologische Prozesse in sezierten Drosophila-Eizellenkammern, wie z.B. die Eizellkernmigration, mittels Live-Imaging-Mikroskopie zu beobachten. Dieses Protokoll beschreibt, wie die sezierten Eierkammern 12 Stunden lang am Leben erhalten werden, um Live-Imaging-Mikroskopie durchzuführen. Zu Beginn 200 Mikroliter Schneider Medium pipetten und mit 30 Mikrolitern von 10 Milligramm pro Milliliter Insulin ergänzen, dann fügen Sie vier Mikroliter wärmeinaktiviertes fetales Kalbserum hinzu.
Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um eine kleine Menge Silikonfett um das Loch auf der Unterseite des punktierten Schlittens aufzutragen. Positionieren Sie einen Abdeckrlip und verwenden Sie das breite Ende einer Pipettenspitze, um Druck auf den Coverlip auszuüben, um das Silikonfett abzuflachen, um einen Silikonring im Inneren des Objektträgers zu erzeugen. Die betäubten weiblichen Fliegen werden in den Sezierbrunnen mit 150 Mikrolitern des Bildmediums überführen.
Um das Weibchen zu sezieren, verwenden Sie die Zange, um den Thorax zu greifen und die dorsale Bauchkutikula mit einem zweiten Paar Zangen zu kneifen. Entfernen Sie vorsichtig die Gebärmutter, den Eileiter und die Muskelscheide. Isolieren und lösen Sie das Paar Eierstöcke, die an der Nagelhautöffnung sichtbar sind.
Legen Sie einen Tropfen von 10 bis 15 Mikrolitern des Bildgebungsmediums auf die Eierstöcke und übertragen Sie einen Eierstock in die Bildgebungskammer. Um die Ovariolen zu trennen, verwenden Sie die Nadel, um das hintere Ende des Eierstocks zu halten. Verwenden Sie eine andere Nadel, um das Keimarium vorsichtig zu ziehen, um die Ovariolen auseinander zu necken.
Halten Sie die Scheide mit einer Nadel und ziehen Sie die Ovariole mit einer anderen Nadel durch die größeren Kammern, um die verbleibende Muskelscheide an den Eierkammern zu entfernen. Lassen Sie die ungehüllte Ovariole sinken und kontaktieren Sie den Abdeckungsrutsch. Entfernen Sie die späten Stadien und den Rest der Eierstöcke mit einer Zette aus dem Mikrokammer.
Verwenden Sie Nadeln, um die Eierstöcke vorsichtig zu entfernen, um die Erfassung zu erleichtern. Schneiden Sie ein kleines 10 x 10 Millimeter großes Quadrat der durchlässigen Membran. Tragen Sie die Membran vorsichtig auf die Oberseite des Bildmediums auf, um Luftblasen auszustoßen.
Dann verschließen Sie die Kammer hermetisch mit einer dünnen Schicht Halogenkohlenstofföl um den Brunnen auf der Kontur der Membran. Legen Sie das Bildgebungssetup auf den Objektträgerhalter des invertierten Mikroskops und verwenden Sie ein 40-faches Objektiv. Die Migration des Eizellkerns einer Wildtyp-Eizelle wurde mittels Live-Imaging-Mikroskopie erfasst.
Der Kern erreicht entweder die vordere Plasmamembran oder die laterale Plasmamembran, bevor er entlang der Trajektorien gleitet, um seine endgültige Position am Schnittpunkt der beiden Plasmamembranen zu erreichen. Membrandeformitäten, unorganisierte Follikelzellen, verkümmerte Zellen und geschrumpfte Kerne sind die ersten Anzeichen für absterbende Eierkammern. Die degenerierte Eizelle vor acht Stunden Bildgebung wird normalerweise nicht nachgewiesen.
Seltene Fälle einer frühen Degeneration sind jedoch auf Probleme bei der Dissektion oder montage zurückzuführen. Die Beschädigung der Eierkammern beeinträchtigt ihr Überleben. Daher stehen eine filigrane handgenaue Dissektion und Vorbereitung der Mikrokammer im Vordergrund.
Dieses Verfahren ermöglichte es uns zu visualisieren, dass der Eizellkern während seiner Migration drei verschiedene Bahnen nehmen kann und verschiedene Organellen diese Trajektorien innerhalb der Eizelle regulieren.
