In diesem Artikel wurde eine einfache Methode beschrieben, um die Wundung in einem dreidimensionalen, multizellulären Organkulturmodellsystem zu bewerten. Wir tun dies mit Schweineaugen, aber auch wenn Sie nicht mit Augen vertraut sind, können Sie diesen Test tun. Als Überblick erhielten wir Schweineaugen, schnitten die Kugeln aus, machen eine kreisförmige Wunde in der Hornhaut, die durch das Epithel und etwa ein Drittel des Stromas geht.
Wir schneiden die Hornhaut aus, montieren sie auf einer Agar-Basis und legen dieses Konstrukt in den Brutkasten. Das Gewebe füllt sich in der Bildung einer Narbe in der Hornhaut. Sie müssen keine Wachstumsfaktoren oder sogar Serum hinzufügen.
Dies geschieht in serumfreien Medien. Obwohl dies in der Hornhaut durchgeführt wird, kann es als Modellsystem für die fibrotische Heilung im Allgemeinen verwendet werden. Wie viele der zellulären Wege, die während der Narbenbildung aktiviert werden, sind ähnlich zwischen den Systemen.
Verwenden Sie in einer Biosicherheitshaube eine chirurgische Klinge mit gerader Kante, um den Globus auf einem mit Ethanol gereinigten Schneidebrett vom Deckel zu entfernen und das überschüssige Fettgewebe von jedem Auge zu entfernen. Halten Sie die gereinigte Kugel hinter enderhand mit Zangen sofort tauchen Sie das Auge in PBS gefolgt von drei schnellen Dips in 10%Jod, und zwei schnelle Dips in PBS. Dann wickeln Sie das Auge umlaufend mit einem sauberen Laborgewebe, um mit genügend Druck zu wickeln, um eine straffe Hornhautoberfläche zu erreichen, ohne die Hornhaut zu kontaktieren.
Mit einem sechs Millimeter Trephin, durchdringen Sie das Epithel in der vorderen Stroma in der Mitte der Hornhaut, ohne eine volle Dicke durch die gesamte Hornhaut gewickelt, und drehen Sie das Trephin 180 Grad im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn fünfmal, während Sie leichten Druck anwenden, um die Wunde zu vertiefen. Wenn die Wunde tief genug ist, um eine Gewebeklappe mit Zangen zu heben, verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um die Klappe parallel zum Globus zu schneiden, während Sie die vordere Hornhaut innerhalb des Wundrandes weiter heben. Wenn die gesamte Klappe entfernt wurde, sollte eine kreisförmige Wunde in der Mitte der Hornhaut gefunden werden.
Um die Hornhaut zu ernten, greifen Sie das Auge mit dem Laborgewebe, und verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um einen kleinen Schnitt einen Millimeter vom Rand der Hornhaut entfernt zu machen, um den Limbus und die Gewebesammlung einzuschließen. Mit einer kleinen, scharfen Schere setzt der Schnitt um den Globus fort und hält einen Millimeter Abstand über die Hornhaut, um den Limbus im Takt zu halten. Dann legen Sie die Hornhaut, Wundseite nach unten, in eine 60-Millimeter-Oder 100-Millimeter-Schale mit einem Milliliter PBS.
Um die Hornhaut zu montieren, verwenden Sie zwei Paar Zangen, um die Hornhaut epithel-Seite nach oben zu halten, um eine Tasse zu erstellen, und verwenden Sie eine sterile Transferpipette, um erwärmte Agar-Lösung in die Hornhaut hinzuzufügen, bis die Tasse voll ist. Nachdem der Agar aushärtet, die Hornhaut vorsichtig in eine neue 60-Millimeter-Platte agar-Seite nach unten legen und die Platte mit einem Deckel bedecken. Dann fügen Sie vier Milliliter von ergänzten serumfreien Medium zu jeder Platte von Hornhäuten Ahorn pflege die Hornhäuten an einer luft-flüssigen Schnittstelle an der limbalen Grenze in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5%Kohlendioxid, und benetzen die Hornhautoberflächen einmal täglich mit einem Tropfen ergänzten Serum-freien Mediumaus dem konditionierten Medium in der Schale, um das Gewebe hydratisiert zu halten.
Mischen Sie für den Genknockdown fünf Mikroliter kleiner Interferenz oder siRNa mit 50 Mikroliter reduziertem Serum minimum essential medium und zwei Mikroliter Transfektionsreagenz. Mit 50 Mikroliter reduziertem Serummedium pro Hornhaut. Nach fünf Minuten die beiden Mischungen vermischen und 200 Mikroliter reduziertes Serum-Mindestmedium zu jeder siRNA-Mischung hinzufügen.
Dann Pipette die siRNA-Lösungen fallen klug auf jede Wunde. Dann die Hornhäuten in den Brutkasten geben. Nach drei Stunden verwenden Sie das Medium in jeder Schale, um die siRNA von den Hornhautoberflächen zu waschen, und ersetzen Sie das konditionierte Medium in jeder Schale durch frisch ergänztes Serumfreies Medium plus Antibiotika.
Dann kehren Sie die Hornhautkulturen in den Zellkultur-Inkubator zurück und brüten für zwei Wochen. Sechs Stunden nach der Verwundung fehlt das Hornhautepithel. Sechs Tage nach der Verwundung wächst das Epithel wieder.
Fluoreszenz-Aminofärbung mit alpha glatter Muskelaktivität zeigt einen Gradienten aktiver Myofibroblasten entlang des Wundrandes vom vorderen zum hinteren Stroma. Immun-histochemische Färbung für Alpha glatte Muskel Aktin zeigt eine dramatische Zunahme der Alpha glatten Muskel Aktin Protein Expression in verwundetplus Kontrolle siRNA Hornhäasen. Im Vergleich zu unverwundeten und Zielprotein siRNA behandelt, verwundete Hornhäuten.
In ähnlicher Weise ist Fibronectin Extra-Domäne A in siRNA behandelt enfegen Hornhäuten im Vergleich zu unverwundeten und Zielprotein siRNA behandelt verwundeten Hornhäuten. Nachweis eines erfolgreichen Abschlags des Zielproteins. Darüber hinaus verhindert die Behandlung der verwundeten Hornhäute mit dem Toxin, das nicht spezifisch auf das Zielprotein abzielt, eine Reepithelisierung und führt zu qualitativem Zelltod, einer unorganisierten Matrix und stromalen Vakuolen, die darauf hindeuten, dass das Toxin die Heilung bei der Konzentrationstest nicht fördert.
Abschließend, beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Klinge parallel zum Gewebe zu halten, während schneiden, so dass es nicht den Globus durchdringt. Mit diesem Test können verschiedene Wundtechniken eingesetzt werden, einschließlich chemischer Verbrennung oder Epithelkratzen. Es kann auch für Arzneimitteltoxizität Assays verwendet werden, um festzustellen, ob das Epithel heilt und mit welcher Geschwindigkeit.
Dies ist ein Kosteneinsparungen ex vivo, Organkulturmodellsystem, das Ihren in vivo Wundheilungsstudien vorausgehen kann.
