Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Epigenomik zu beantworten, indem sie demonstriert, wie ein Sequenzierungs-basiertes Tool zur Bewertung der Auswirkungen von Umweltfaktoren auf die DNA-Methylierung entwickelt und implementiert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine umfassendere und quantitativemethode zur Bewertung der DNA-Methylierungsniveaus im Vergleich zu Array-basierten Plattformen bereitstellen kann. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Identifizierung von DNA-Methylierungsänderungen aufgrund verschiedener Arten physiologischer Prozesse in jedem Organismus, dessen Sequenzdaten verfügbar sind.
Obwohl diese Methode Einen Einblick in die Auswirkungen von Stress auf die DNA-Methylierung geben kann, kann sie auch auf andere Umweltfaktoren oder physiologische Bedingungen angewendet werden, wie die Exposition gegenüber Umweltgiften bei fettiger Ernährung und Erkrankungen wie Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Nach dem Scheren von DNA und der Überprüfung der Größe mittels Bioanalyzer 180 Mikroliter DNA-bindender Magnetperlen zu jeder Probe hinzufügen und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Pellet die Perlen auf einer Magnetplatte, und entfernen Sie den Überstand.
Das Pellet in 200 Mikroliter n.G. 70% Ethanol wieder aufhängen. Als nächstes verwenden Sie eine Magnetplatte, um die Perlen zu pellet, und entfernen Sie so viel Ethanol wie möglich. Die Perlen in einem Hitzeblock bei 37 Grad Celsius drei bis fünf Minuten trocknen.
Dann das Pellet in 44 Mikroliter nukleasefreiem Wasser wieder aufhängen und etwa 42 Mikroliter des Überstandes sammeln. Nach dem Ligistieren der Adapter und der Überprüfung der Ligation mittels Bioanalyzer, übertragen Sie die Proben in DNA-bindende Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie dann einen beheizten Vakuumkonzentrator, um das Probenvolumen unter 3,4 Mikroliter zu reduzieren.
Danach 5,6 Mikroliter Methyl-Seq Block Mix zu jeder Probe hinzufügen und in einem thermischen Cycler inkubieren. Bereiten Sie Capture Library Hybridization Mix gemäß dem Textprotokoll vor. Fügen Sie dann 20 Mikroliter Capture Library Hybridization Mix zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie 16 Stunden lang bei 65 Grad Celsius.
Gegen Ende der Inkubationszeit bereiten Sie Streptavidin-Magnetperlen vor, indem Sie 50 Mikroliter Streptavidin-Magnetperlen pro Probe zu einem neuen Acht-Well-Streifenrohr hinzufügen. Waschen Sie die Perlen mit 200 Mikroliter Methyl-Seq Bindungspuffer. Legen Sie das Streifenrohr auf eine Magnetplatte und entfernen Sie den Überstand von den Perlen.
Dann setzen Sie die Perlen in 200 Mikroliter Methyl-Seq Bindungspuffer wieder aus. Fügen Sie die Proben zu den gewaschenen Streptavidin-Perlen hinzu und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten auf einem rotierenden Mischer. Während sich die Proben mischen, werden 200 Mikroliter Methyl-Seq Wash Buffer Two in dreifache Brunnen einer 96-Well-Platte und vorwarm auf 65 Grad Celsius gemischt.
Nachdem die Proben inkubiert werden, pellet die magnetischen Perlen mit einer Magnetplatte und entfernen Sie den Überstand. Dann, resuspendieren Sie die Perlen in 200 Mikroliter Methyl-Seq Wash Buffer One. Inkubieren Sie die Perlen für 15 Minuten bei Raumtemperatur, und verwenden Sie eine Magnetische Platte, um den Überstand zu entfernen.
Danach das Perlenpellet in 200 Mikroliter vorgewärmtem Wash Buffer Two wieder aufsetzen. Dann inkubieren Sie die Perlen in einem thermischen Cycler, bevor Sie eine Magnetplatte verwenden, um die Perlen zu pellet. 20 Mikroliter Methyl-Seq Elution Buffer zu den gewaschenen Perlen geben und bei Raumtemperatur 20 Minuten bebrüten.
Verwenden Sie eine Magnetplatte, um die Perlen zu pellet, und übertragen Sie den Überstand auf ein neues Streifenrohr. Fügen Sie zunächst dem zuvor gesammelten Überstand 130 Mikroliter Bisulfit-Umwandlungsreagenz hinzu. Teilen Sie die 150-Mikroliter-Reaktionen gleichmäßig in zwei Brunnen auf.
Dann inkubieren Sie die Reaktionen in einem thermischen Cycler. Verwenden Sie 600 Mikroliter Bindungspuffer, um die Proben an die Spinspalten zu binden, und waschen Sie die Spalten mit 100 Mikroliter Waschpuffer. Zentrifugieren Sie dann die Spalten, und verwerfen Sie den Durchfluss.
Fügen Sie danach 200 Mikroliter Desulphonation Buffer zu den Spalten hinzu. Inkubieren Sie die Säulen für 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Säulen zweimal mit 200 Mikroliter Waschpuffer.
Fügen Sie dann 10 Mikroliter Elution Buffer zur Spalte hinzu. Bei Raumtemperatur inkubieren und Zentrifuge. Bereiten Sie den PCR-Reaktionsmaster-Mix entsprechend dem Textprotokoll vor.
Fügen Sie dann 82 Mikroliter der Master-Mischung zu jeder Probe hinzu, und inkubieren Sie die Proben in einem thermischen Cycler. Bereiten Sie zunächst den PCR Master Mix Two auf Eis gemäß dem Textprotokoll vor. Dann, zu jeder Probe, fügen Sie 25,5 Mikroliter PCR Master Mix Zwei und fünf Mikroliter kommerzielle Indexierung Primer, und inkubieren die Proben in einem thermischen Cycler.
Bewerten Sie die DNA-Konzentration der Proben mit hochempfindlichen DNA-Nachweisreagenzien auf einem Bioanalyzer. Die Methyl-Seq-Bibliotheken werden dann zur Sequenzierung auf dem Sequenzer der nächsten Generation übermittelt. Nach der Bisulfitumwandlung und PCR-Verstärkung von Validierungsproben, bereiten Sie einen Master-Mix mit Bindungspuffer, Wasser und Streptavidin-beschichteten Sepharoseperlen vor.
Dann 75 Mikroliter der Master-Mischung und fünf Mikroliter des verschachtelten PCR-Produkts auf eine 96-Well-Platte geben und die Platte 15 bis 60 Minuten auf einem Plattenshaker schütteln. Während die Platte schüttelt, fügen Sie 12 Mikroliter Primer in die Brunnen einer pyrosequencing Assay-Platte. Nach dem Schütteln ein Vakuumwerkzeug in einen mit Wasser gefüllten Trog legen und dann das Werkzeug mit Bindungsreaktionen in die Platte legen.
Als nächstes tauchen Sie das Vakuumwerkzeug in halb gefüllte Tröge ein, die 70 % Ethanol, Natriumhydroxid und Trisacetatpuffer enthalten. Trennen Sie das Vakuum, und legen Sie das Vakuumwerkzeug in die HS-Pyrosequencing-Assay-Platte, um die Perlen zu übertragen. Legen Sie die Platte auf einen Wärmeblock, und brüten bei 80 Grad Celsius für zwei Minuten.
Lassen Sie die Platte schließlich fünf Minuten abkühlen, bevor Sie mit dem Pyroprogramm beginnen. In diesem Protokoll lieferte die Analyse der Methyl-Seq-Bibliotheken eine Rangliste der differenziell methylierten Regionen, oder DMRs, zwischen gestressten und unbelasteten Tieren und eine grafische Darstellung der DMRs. Die Validierung durch Bisulfit-Pyrosequencing zeigte, dass die gestressten Tiere alle über alle CpGs hinweg höhere Methylierungswerte aufwiesen als die unbelasteten Tiere.
Die Methylierungswerte bei CpG 10 wurden auch mit den mittleren dreiwöchigen CORT-Werten für jedes Tier verglichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es eine bescheidene Korrelation zwischen den endokrinen und Methylierungsdaten gibt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zunahme der durchschnittlichen DNA-Größe zwischen DNA-Scherung und Adapterligationsschritten zu vergleichen und eine ausreichende Bibliotheksmenge vor der Sequenzierung sicherzustellen.
Nach diesem Verfahren können andere ähnliche Ansätze umgesetzt werden, um neue Fragen zu beantworten, wie z. B. die Auswirkungen von Umweltgiftstoffen auf die Neuroentwicklung von Ratten. Nach ihrer Entwicklung bot diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Epigenetik die Möglichkeit, genomweite VERÄNDERUNGEN der DNA-Methylierung in allen Nicht-Modell- oder Modellorganismen zu erforschen, in denen genomische Sequenzen verfügbar sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit den temperaturempfindlichen Enzymen die Lagerung auf Eis erfordert, während sie im Minus 20-Grad-Gefrierschrank verwendet werden.
Die RNA-Perlen, die für die Zielerfassung verwendet werden, erfordern auftauen und lagern auf Eis, während sie im Einsatz sind, und langzeitgelagert im Minus-80-Grad-Gefrierschrank.
