Diese Vertikale stellt wichtige Schritte bei der Montage von Zellmembran-Affinitätschromatographiesäulen mit funktionellen Transmembranrezeptoren dar. Diese Säulen können zur Identifizierung kleiner Moleküle verwendet werden, die in komplexen Extrakten vorhanden sind und mit immobilisierten Transmembranrezeptoren interagieren. Zellmembran-Affinitätschromatographiesäulen beschleunigen die Identifizierung biologisch aktiver Verbindungen, die in komplexen Gemischen vorhanden sind.
Die Verwendung von zellulären Membranaffinitätschromatographiesäulen kann von besonderem Interesse für diejenigen sein, die an der Identifizierung pharmakologisch aktiver Verbindungen in komplexen natürlichen Matrizen wie Pflanzen-, Pilz- oder Bakterienextrakten interessiert sind. Bereiten Sie zunächst 200 millimolare Benzamidin-Stammlösung vor, indem Sie 120 Benzamid in fünf Millilitern ultrareinem deionisiertem Wasser auflösen. Bereiten Sie eine 10-millimolare PMSF-Stammlösung vor, indem Sie 0,017 Gramm PMSF in 10 Milliliter Ethanol in einem Abzug auflösen.
Bereiten Sie 100X Proteases Inhibitor Cocktail vor, indem Sie die handelsübliche Proteaseinhibitormischung in einem Milliliter ultrareinem deionisiertem Wasser auflösen. Mischen Sie gründlich und aliquot 200 bis 300 Mikroliter des Cocktails. Bereiten Sie 100 Millimolar ATP-Stammlösung vor, indem Sie 55.114 Milligramm ATP-Dinatriumsalzhydrat in einem Milliliter ionisiertem Reinstwasser auflösen.
Mischen Sie gründlich und aliquot 100 Mikroliter der Mischung. Bereiten Sie den Puffer vor, indem Sie 3,03 Gramm Tris-HCL, 2,9 Gramm Natriumchlorid, 0,22 Gramm wasserfreies Calciumchlorid, 0,2 Gramm Magnesiumchloridhexahydrat und 0,19 Gramm Kaliumchlorid in 500 Millilitern hochreinem entionisiertem Wasser auflösen. Bereiten Sie den Homogenisierungspuffer vor, indem Sie 17,3 Milliliter des Tris-Puffers mit 0,3 Milliliter Benzamidin-Stammlösung, 0,2 Milliliter PMSF-Stammlösung, 0,2 Milliliter Proteasen-Inhibitor-Cocktail, 20 Mikroliter ATP-Stammlösung, zwei Milliliter Glycerin und 0,029 Gramm EDTA mischen.
Stellen Sie den pH-Wert mit Salzsäurelösung auf 7,4 ein. Drehen Sie die bei vier Grad Celsius geernteten Zellen für fünf Minuten bei 400 x g herunter und entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das verbleibende Zellpellet mit 10 Millilitern 1X pH 7,4 eiskaltem PBS. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 20 Milliliter Homogenisierungspuffer hinzu.
Legen Sie die konische Röhre auf Eis. Übertragen Sie die Zellsuspension in einen 40 Milliliter Dounce Homogenisator Tissue Grinder, homogenisieren Sie die Suspension manuell auf Eis mit 40 Stößelschlägen nach oben und unten. Homogenisierte Zellsuspension in ein 50 Milliliter konisches Rohr überführen, das Pellet entsorgen und den Überstand in ein neues konisches Rohr überführen.
Speichern Sie das Zellmembranpellet und entsorgen Sie den Überstand. Bereiten Sie den Lösungslösungspuffer vor, indem Sie 8,7 Milliliter der Pufferlösung mit 0,1 Milliliter PMSF-Stammlösung, 0,15 Milliliter Benzamidin-Stammlösung, 0,1 Milliliter Proteasen-Inhibitor-Cocktail, 10 Mikroliter ATP-Stammlösung, einem Milliliter Glycerin und 0,2 Gramm Natriumcholat mischen. Übertragen Sie den Solubilisierungspuffer in das konische Rohr mit Zellmembranfragmenten.
Und das Pellet wieder suspendieren. Drehen Sie die resultierende Mischung bei 150 U / min bei vier Grad Celsius für 18 Stunden. Nach 18 Stunden das Solubilisierungsgemisch bei vier Grad Celsius für 30 Minuten bei 47.900 x g zentrifugieren.
Fügen Sie 100 Milligramm IAM hinzu. PC. DD2-Partikel zum Überstand und drehen das resultierende Suspensionsgemisch bei 150 U / min bei vier Grad Celsius für eine Stunde. Bereiten Sie Dialysepuffer in vier Litern ultrareinem entionisiertem Wasser vor, indem Sie 24 Gramm Tris-HCl, 23,4 Gramm Natriumchlorid, 0,06 Gramm Calciumchlorid, 5,85 Gramm EDTA und 0,07 Gramm PMSF hinzufügen.
PMSF zuerst in einer kleinen Menge Ethanol auflösen und dann langsam mit dem Puffer in das Becherglas geben. Schneiden Sie 10 Zentimeter Cellulosemembran-Dialyseschläuche ab, um den Dialyseschlauch vorzubereiten, und übertragen Sie die Suspension, die IAM enthält. PC. DD2-Partikel und Zellmembranfragmente in den Dialyseschlauch.
Verschließen Sie beide Enden des Dialyseschlauches mit Dialyseschlauchclips. Legen Sie das Dialyseröhrchen in den Dialysepuffer. Nach 24 Stunden den Dialyseschlauch in den frisch zubereiteten Dialysepuffer legen und die Dialyse für weitere 24 Stunden fortsetzen.
Bereiten Sie 10 millimolar pH 7,4 Ammoniumacetatpuffer vor, der zum Waschen des IAM verwendet wird. PC. DD2-Partikel und in Säulencharakterisierungsexperimenten durch Auflösen von 0,778 Gramm Ammoniumacetat in einem Liter hochreinem entionisiertem Wasser. Nach 48 Stunden Dialyse das Dialyseröhrchen aus dem Dialysepuffer entnehmen und den Inhalt des Dialyseröhrchens in ein 15 Milliliter konisches Röhrchen überführen.
Den Überstand entsorgen und das restliche Pellet dreimal mit 10 Millilitern Ammoniumacetatpuffer waschen. Nach der dritten Wäsche das verbleibende Pellet in einem Milliliter Ammoniumacetatpuffer resuspendieren. Mischen Sie es gründlich und verwenden Sie die resultierende Aufschlämmung, um die 5 x 20-Glassäule zu verpacken, um die CMAC-Chromatographiesäule zu erhalten.
Um die Säule zu verpacken, legen Sie einen Bodenfilter, der zuvor mit Ammoniumacetatpuffer getränkt war, in den Filterhalter. Setzen Sie den Filterhalter in die Glassäule ein und schrauben Sie den Säulendeckel an, um die Position des Halters zu sichern. Setzen Sie die Säule vertikal in eine Fingerklemme und befestigen Sie sie im Laborständer.
Legen Sie ein Becherglas unter die Säule, übertragen Sie ein kleines Volumen der Aufschlämmung langsam in die Glassäule, wobei ein Einkanalpipettierer die Pipettenspitze an der Glassäulenwand hält. Um den Verpackungsprozess zu beschleunigen, entfernen Sie den Puffer zwischen den einzelnen Schritten mit einer Mikropipette von oberhalb des stationären Bettes. Platzieren Sie einen oberen Filter und schrauben Sie die Adaptereinheit so, dass kein verbleibender Puffer über der stationären Phase vorhanden ist.
Sichern Sie die Position der Adaptereinheit mit dem Adapterschloss. Schließen Sie die Säule an eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographiepumpe an und um die Säule über Nacht mit Ammoniumacetatpuffer zu waschen, stellen Sie die Durchflussrate auf 0,2 Milliliter pro Minute ein. Für eine längere Lagerung führen Sie die Säule mit 0,05% Natriumazidlösung in Ammoniumacetatpuffer aus, tragen Sie einen Laborkittel, eine Schutzbrille und Handschuhe, wenn Sie mit Natriumazid arbeiten, und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.IAM.
PC. DD2-Partikel mit immobilisiertem Neuroblastom TrkB-Zellmembranfragmenten und in Gegenwart von BDNF ergaben fluoreszierende Partikel. Es wurde keine Fluoreszenz in TrkB-Nullzellmembran-gekapselten IAM-Partikeln beobachtet oder wenn kein BDNF wie in TrkB-Zellmembran-verkapselten IAM-Partikeln verwendet wurde. Es ist ein funktionelles CMAC-Säulen-typisches frontales Affinitätschromatogramm mit steigenden 7, 8-DHF-Konzentrationen von einem Millimolaren, 750 Nanomolaren, 500 Nanomolar und 300 Nanomolar zu den immobilisierten TrkB-Rezeptoren gezeigt, das eine konzentrationsabhängige Veränderung der Retentionszeit zeigte.
Eine nicht-funktionale CMAC-Säule zeigte den Mangel an konzentrationsabhängigen Veränderungen in der Retention des Markerliganden. Eine CMAC-Negativkontrollsäule wurde hergestellt, indem Zellmembranfragmente immobilisiert wurden, ohne das Zielprotein zu exprimieren, um unspezifische Wechselwirkungen auszuschließen. Die Zugabe von 0,2% wässrigem Gotu-Kola-Extrakt führte zu einer signifikanten Reduktion der 7,8-DHF-Retention, was auf das Vorhandensein konkurrierender Liganden für die Agonistenbindungsstelle hinweist.
Die fehlende Reduktion der 7, 8-DHF-Retention auf der CMAC-negativen TrkB-Nullsäule bestätigte den Mangel an funktionellen TrkB-Rezeptoren auf dieser Säule. Der fehlende Peak-Chromatographie-Ansatz identifizierte eine Verbindung, die stark auf der TrkB-Säule gehalten wurde, während sie früh auf der TrkB-Nullspalte eluierte, was auf eine spezifische Wechselwirkung hinweist. Es ist wichtig, Ihre Quelle von Rezeptoren für die schnelle zelluläre Membranaffinitätschromatographie-Säule zu kennen.
Stellen Sie sicher, dass Sie die Literatur lesen, um Homogenisierungs- und Lösungslösungspuffer richtig zu entwerfen. Die in diesem Protokoll vorbereitete zelluläre Membranaffinitätschromatographiesäule wurde verwendet, um neue potenzielle Arzneimitteltreffer zu identifizieren und die Art der Wechselwirkung zwischen immobilisiertem Rezeptor und seinen natürlichen Liganden zu charakterisieren.
