Dieses Protokoll bietet eine schnelle und effiziente Strategie, um gleichzeitig zwei Assays zu verwenden, um mehrere hundert Verbindungen auf ihre Auswirkungen auf das Zellwachstum zu überprüfen. Die Assays können uns Informationen darüber liefern, ob bestimmte Verbindungen zytotoxisch sind, das Zellwachstum hemmen oder das Zellwachstum verbessern. Durch die Verwendung der beiden Assays zusammen sind wir in der Lage, die Genauigkeit zu erhöhen und zytotoxische Verbindungen zu identifizieren.
In Fällen, in denen die Ergebnisse der beiden Assays voneinander abweichen, kann diese Strategie es uns ermöglichen, Verbindung mit einzigartigen Auswirkungen auf die Zellfunktion zu identifizieren, die mit anderen Mitteln weiter untersucht werden können. Der Hauptvorteil dieser Strategie ist, dass sie schnell, kostengünstig und arbeitsintensiv ist. Einmal gemeistert, Es ermöglicht Forschern, leicht einen primären Bildschirm von bis zu 200 Verbindungen in einer Woche durchzuführen, und dann eine erschöpfende Dosis-Reaktionskurve auf 10 bis 15 Verbindungen in einer anderen Woche durchführen.
Demonstriert werden ich und Rohini Manickam, ein Mitarbeiter und Post-Baccalaureate-Stipendiat aus dem Labor. Erstens, in einem biologischen Sicherheitsschrank, Kulturzellen in einem T75-Kolben mit NSC-Medium, so dass sie mindestens 80% konfluent sein, wenn der Test beginnt. Und legen Sie den Kolben in einen Zellkultur-Inkubator, der bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid eingestellt ist.
Sobald die Zellen 80% Konfluss erreichen, entfernen Sie den Kolben aus dem Inkubator und aspirieren Sie Das NSC-Medium. Fügen Sie drei Milliliter Zelldissoziationsreagenz hinzu und brüten Sie fünf Minuten im Inkubator. Nach der Inkubation sieben Milliliter NSC-Medium in den Kolben geben und Pipette kräftig geben, um sicherzustellen, dass sich alle Zellen lösen.
Übertragen Sie die dissoziierte Zelllösung auf ein 15-Milliliter-Rohr und Zentrifugieren Bei 200-fachem G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand aus der Röhre und hängen Sie die Zellen in 10 Milliliter NSC-Medium wieder auf. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer, um die Zellen zu zählen, und fügen Sie NSC-Medium in die Röhre ein, um die Konzentration der Zellen auf 200 000 Zellen pro Milliliter neu zu justieren.
Dann, mit sechs der acht Schlitze eines achtKanal-Mehrkanal-Pipettierer, um 100 Mikroliter der Zellmischung Spalte für Spalte in 60 Innenbrunnen von drei 96 Brunnenplatten, die mit extrazellulären Matrix beschichtet wurden. Fügen Sie 100 Mikroliter Basismedium oder NSC-Medium zu allen Brunnen ohne Zellen hinzu, um die potenzielle Verdunstung aus äußersten Brunnen, die Zellen enthalten, zu minimieren. Unter einem Zellkulturmikroskop können Sie mindestens 10 Brunnen auf jeder der drei 96 Brunnenplatten visuell inspizieren, um zu bestätigen, dass die Zellen bei der erwarteten Dichte sitzen.
Inkubieren bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Entfernen Sie die Zellkulturplatten 16 bis 24 Stunden nach dem Aufteilen aus dem Inkubator und aspirieren Sie NSC-Mittelspalte für Spalte mit einem acht Kanal-Multi-Well-Pipettor ab, wobei nur sechs der acht Multi-Well-Steckplätze verwendet werden. Fügen Sie 95 Mikroliter frisches NSC-Medium zu jedem Brunnen der drei Replikplatten hinzu und legen Sie die Platten wieder in den Inkubator.
Mit einem acht Kanal Multi-Well Pipettor, fügen Sie 49 Mikroliter NSC Medium in jedem der inneren 60 Brunnen einer leeren U-Boden, V-Boden oder rund-Boden 96 Well Platte. Entsiegeln Sie die vorbereitete Master-Compound-Platte. Einen Mikroliter der Verbindung von der Masterplatte in jeden der inneren 60 Brunnen mit NSC-Medium pfeifen und die verdünnte Verbindung dreimal mit einem Tischpipettor mischen.
Als nächstes entfernen Sie die drei 96 Well-Platten von NSCs aus dem Inkubator und geben fünf Mikroliter der verdünnten Verbindung in jeden Brunnen der drei Platten, die Zellen enthalten, um eine ein bis 1000 Verdünnung für die endgültige Zusammengesetztenkonzentration von 10 Mikromolaren mit einer DMSO-Konzentration von 0,1%Inkubationszellen mit Verbindung für 72 Stunden zu erhalten, und fahren mit Zytotoxizitätstests fort. Um Dosis-Wirkungs-Assay durchzuführen, richten Sie einen 96-Brunnen ein. Verwenden Sie Spalte Zwei für sechs DMSO-Kontrollreplikationen und testen Sie Triplizen von bis zu drei verschiedenen Verbindungen bei zweifachen seriellen Verdünnungen, bei sechs Dosen, beginnend mit einer hohen Dosis von 10 Mikromolaren.
Vier Mikroliter 100%DMSO oder Testverbindung in DMSO in 196 Mikroliter NSC-Medium in einem 0,5- oder 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr verdünnen. Fügen Sie 25 Mikroliter des verdünnten DMSO zur Kontrolle von Brunnen und 50 Mikroliter der verdünnten Testverbindungen zu ihren entsprechenden Brunnen hinzu. Pipette 25 Mikroliter NSC Medium zu den restlichen leeren Brunnen im Inneren der 96 Brunnenplatte.
Mit einem Mehrkanalpipettor 25 Mikroliter der Verbindung aus den 10 Mikromolarenbrunnen auf die fünf Mikromolarenbrunnen übertragen und mindestens fünfmal mischen. Ersetzen Sie die Pipettenspitzen, und wiederholen Sie den Vorgang, indem Sie die verbleibenden Reihen mischen, um Triplicate bei zweifachen Verdünnungen für insgesamt sechs Dosen für jede der Verbindungen zu erzeugen. Übertragen Sie fünf Mikroliter jeder Verdünnung in eine neue Platte mit Kulturzellen, die getestet werden.
Legen Sie die Platte im Inkubator bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Nachdem die Zellen 72 Stunden lang inkubiert wurden, entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und legen Sie sie in den Plattenleser. Öffnen Sie die Imager-Software, um Protokoll- und Experimentierdateien für die Studie einzurichten.
Wechseln Sie zum manuellen Imager-Modus im Task-Manager, und klicken Sie auf Jetzt erfassen. Wählen Sie 96 Well Plate als Schiffstyp. Wählen Sie 10 Mal für die Vergrößerung und rotes fluoreszierendes Protein 531 und 593 für die Bildgebung tdTomato.
Klicken Sie auf einen Brunnen. Klicken Sie dann auf Autofokus, um das Bild zu fokussieren, und Auto Expose für die richtige Belichtungszeit. Passen Sie bei Bedarf den Fokus und die Belichtung manuell an.
Klicken Sie auf das Kamerasymbol, um das Bild aufzunehmen. Klicken Sie dann auf Prozessanalyse oben, um mit dem Erstellen des Protokolls fortzufahren. Und wählen Sie die Registerkarte Analyse aus.
Klicken Sie rechts neben dem Bild im Analyseschritt analysieren auf Zellzellanalyse, und klicken Sie auf Start. Das Bild zeigt hervorgehobene Zellen, um jede einzelne Zelle anzuzeigen. Klicken Sie auf die Auswahl Optionen, um Parameter zu ändern, um Zellen basierend auf dem Fluoreszenzschwellenwert oder der Zellengröße besser auszuwählen.
Wenn der Bildleiter die Zellen richtig zählt, klicken Sie unten auf dem Bildschirm auf Schritt hinzufügen. Klicken Sie auf das Symbol oben auf dem Bildschirm, um Experimente aus dem Bildsatz zu erstellen. Klicken Sie im geöffneten Fenster unter der Registerkarte Protokoll auf Prozedur.
Wählen Sie dann im neuen Fenster, das sich öffnet, Lesen aus. Klicken Sie auf Vollplatte, um nur die 60 Bohrungen auszuwählen, die die Zellen enthalten. Klicken Sie auf OK, um Änderungen zu speichern.
Klicken Sie dann im Prozedurfenster auf OK. Klicken Sie auf das Wiedergabesymbol, um die Platte auszuführen. Speichern Sie in der Eingabeaufforderung die Datei, und klicken Sie dann in der Eingabeaufforderung Lastplatte auf OK. Laden Sie nach Abschluss der Bildgebung die Zellenzähldaten aus dem Imager-Softwareprogramm zur Analyse in eine Kalkulationstabelle herunter.
Innerhalb von zwei Stunden nach Abschluss der tdTomato-Bildgebung beginnen Sie mit dem MTT-Test. Wiegen Sie 25 Milligramm MTT und setzen Sie es in fünf Milliliter NSC Medium, um fünf Milligramm pro Milliliter MTT-Lagerlösung zu machen. Wirbel die Lösung für mehrere Minuten, bis es keine sichtbaren Ausscheidungen von MTT.
Entfernen Sie Zellkulturplatten aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Medium Zellkultur. VERdünnen Sie MTT ein bis zehn in frischem NSC-Medium und fügen Sie 100 Mikroliter des verdünnten MTT zu jedem Bohrkörper der Zellen hinzu. Inkubieren Sie Zellen bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden.
Ein purpurner Niederschlag ist in etwa im Verhältnis zur Anzahl der Zellen im Brunnen sichtbar. Saugen Sie die MTT-Lösung von den Platten, und fügen Sie 50 Mikroliter von 100%DMSO zu jedem Brunnen hinzu. Legen Sie die Platten auf einen Shaker bei Raumtemperatur für 10 Minuten bei 400 RPM.
Danach die Platte auf einen Plattenleser übertragen. Lesen Sie die Absorption jedes Bohrbrunnens bei der voreingestellten Wellenlänge von 595 Nanometern, und exportieren Sie Daten zur Analyse in die Kalkulationstabelle, genau wie bei den Zellzähldaten. Die Untersuchung von tdTomato Fluoreszenzbildern ergab zwei Brunnen, die sich auf Toxizität zwischen MTT und Zellzahl-Assay diskoraniert.
Für einen Brunnen deuteten die Daten über die Zellzahl auf keine Toxizität hin. Aber MTT-Daten taten es. Ein anderer Brunnen hatte die Zellzahl um MTT im Verhältnis zur tdTomato-Zahl überschätzt und schien größere Zellen zu haben, während in Brunnen, in denen MTT die Zellzahl im Vergleich zu tdTomato unterschätzte, die Zellen kleiner zu sein schienen.
Zusammenfassend klassifizierte der tdTomato-Assay 11 Verbindungen als toxisch, 11 als wachstumshemmend und eine als wachstumsfördernd, wobei 34 keine offensichtliche Wirkung auf das Zellwachstum hatten. Der MTT-Assay klassifizierte 13 Verbindungen als toxisch, zwei als wachstumshemmend und eine als wachstumsfördernd, wobei 41 keine offensichtliche Wirkung auf das Zellwachstum hatte. Die Grafik der lebensfähigen Zellen für die Verbindung WP1066 zeigt eine relativ flache Kurve ohne Toxizität für die vier niedrigsten Konzentrationen.
Die Kurve fällt schnell bei der fünfmikromollaren Dosis und sinkt auf fast volle Toxizität bei 10 Mikromolaren, was zu der tödlichen Dosis 50 als 4,4 und 6,0 Mikromolar für den tdTomato-Assay und den MTT-Assay führt. Es ist wichtig, dass Verbindungen im Dosis-Reaktions-Bildschirm richtig verdünnt werden, so dass die richtige Dosis-Antwort-Kurve erzeugt wird. Verbindungen, die durch dieses Verfahren identifiziert werden, um das Zellwachstum zu beeinflussen, können weiter durch funktionelle Assays charakterisiert werden, um potenziell neuartige Signalwege zu identifizieren, die das Zellwachstum steuern.
Verbindungen, die für neuronale Stammzellen toxisch sind, wurden als potenzielle therapeutische Wirkstoffe für Hirntumoren wie Glioblastom und Neuroblastom getestet. Tragen Sie beim Umgang mit Säugetierzellen, DMSO und MTT immer Handschuhe und einen Labormantel. Entsorgen Sie DMSO und MTT gemäß den Richtlinien für chemische Abfälle Ihrer Institution.
