Wir danken Chandran Sabanayagam für seine Hilfe bei der Entwicklung des Systems, Joshua Edel für Beratung in der Gestaltung der Mikrofluidik-Gerät und das Personal an der Rowland Institute der Harvard University für die Bearbeitung von Teilen der Einrichtung. Wir erkennen an, nützliche Gespräche mit Mitgliedern der Meller Gruppe an der Rowland Institute und an der Boston University, und die Mitglieder der T. Ha &#39;s-Gruppe am UIUC für hilfreiche Informationen. Schließlich schätzen wir die finanzielle Unterstützung von der National Science Foundation (PHY-0701207) und dem National Institute of Health (GM075893).

1 - Montage des mikrofluidischen Zelle Die mikrofluidischen Zelle erfolgt durch Fusion aus einem gemusterten, 2 mm dick, Polydimethylsiloxan (PDMS) Festplatte auf eine frisch gereinigte Quarz Deckglas. Die PDMS-Diskette enthält vier 30 ul rechteckigen Kammern, die durch Ein-und Auslass flexible Kapillaren verbunden mit einem Pufferspeicher und einer Spritzenpumpe, bzw. für die kontrollierte Fluss von Puffer zugegriffen wird. Die Messzelle ist auf seiner Rückseite durch ein Glasfenster unterstützt und auf eine maßgeschneiderte Küvettenhalter mit einem wassergekühlten thermoelektrischen Element die Temperatur zu regulieren. <ol><li> Um die gemusterten PDMS Festplatte, mix 10 Teilen Silicon-Elastomer-Basis mit 1 Teil Härter, gut mischen und Entgasung für 1 Stunde im Vakuum. </li><li> Vorsichtig gießen das Elastomer-Mix auf den mikrofluidischen Zelle Form. In unserem Fall ist dies ein 1 &quot;Silizium-Wafer mit vier Streifen (1x10 4 x 1x10 3 x 300 um) von negativen Photoresist gemacht. Lassen Sie diese auf einer Heizplatte bei 70 ° C aushärten für zwei Stunden. </li><li> Ziehen Sie vorsichtig das gehärtete PDMS Festplatte aus der Form mit einer Rasierklinge. Sicherung der Festplatte auf ein 1&#39;&#39;Glasfenster (mit 8 x 2 mm Durchmesser vorgebohrt an beiden Enden der Kanäle) von Plasma-oxidierende beide Oberflächen für 30 Sekunden. Sicherung der Glasscheiben auf der flachen Seite des PDMS Festplatte (die Seite nicht mit den Kanälen). </li><li> Legen Sie ein 2-Zoll langen, flexiblen Quarzglaskapillare Schlauch durch jede Glasscheibe das Loch, bis sie den Kanal erreicht. Einsetzen einer Nadel und dann nach mit der Kapillare kann diesen Prozess erleichtern. Seal die Glasscheibe Löcher mit einer schnellen Aushärtung Silikonverguss wie Kwik-Cast. </li><li> Spülen der Kanäle mit Ethanol und Wasser, und Plasma-Aktivierung der Zelle zusammen mit einem frisch gereinigten, 1-Zoll runden Quarz Deckglas für 30 Sekunden. Wir schlagen vor, Reinigung dieses Deckglas mit Piranhas *. Fuse das Deckglas auf der Seite der Zelle mit den Kanälen, Abdichtung der Kammern. </li><li> Lassen Sie die Montage Zelle zu härten bei Raumtemperatur über Nacht. </li></ol> * Piranha ist eine Lösung von H 2 O 2 und H 2 SO 4 in 1:2.5 Proportionen. Zur Reinigung der Deckgläser, tauchen sie in Piranha bei 90 ° C für 20 min. 2 - Die Aktivierung der Oberfläche für Molekül Immobilisierung Für Nukleinsäure-Studien besteht die einfachste Oberflächenimmobilisierung Schema der ersten Beschichtung eine Glas-oder Quarz-Deckglas mit biotinyliertem Rinderserumalbumin (BSA) und dann mit Streptavidin. Dies ermöglicht dem biotinylierten Probe mit hoher Spezifität für Tage bei Raumtemperatur immobilisiert werden. <ol><li> Connect flexible Schlauch an den Kapillaren zur einfachen Puffer-Injektion mit einer Spritze und Nadel. </li><li> Inject einer Lösung von 0,1 mg / ml biotinylierte BSA in Puffer A (10 mM TRIS-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, gefiltert mit 0,02 um-Filter) in den Kanal und Inkubation für mindestens 30 min. </li><li> Flow 300-500 ul Puffer A mit einem freien biotinylierten BSA aus dem Kanal zu entfernen, wobei darauf geachtet, keine Luftblasen im Inneren der Kammer Falle. </li><li> Inject einer Lösung von 0,1 mg / ml Streptavidin in Puffer A und Inkubation für 15 min. Wiederholen Sie dann Schritt 3. </li><li> Der Fluss durch eine 3-5 pM Lösung des biotinylierten Probe. Führen Sie eine Oberflächen-Scan, um die Abdeckung der fluoreszierenden Moleküle kontrollieren. Wenn nötig, erhöhen die Konzentration der Probe um eine bessere Abdeckung zu erreichen. Inkubieren für 10 min und wiederholen Sie Schritt 3. </li></ol> Die mikrofluidischen Zelle befindet sich auf einem motorisierten XY-Tisch ermöglicht grob (bis zu 25 mm) Bewegung mit optisch kodiert DC-Motoren montiert und fein (1 nm) Bewegung mit zwei closed-loop Piezo-Aktuatoren (Physik Instrumente Modell M-014 oder ähnlich). Dies kann entweder vor oder nach der Aktivierung der Oberfläche für die Immobilisierung Probe durchgeführt werden. 3 - Vorbereiten der Imaging Buffer (IB) Die IB besteht aus einer enzymatischen Sauerstoffbindung und einem Triplett-Quencher, wie Trolox. Da der IB durch ständig über Nacht geleert wird, sollte mindestens 10 ml im Voraus vorbereitet werden. <ol><li> Bereiten Sie 10 ml von 0,8% w / v D-Glucose, mindestens 35 mM TRIS-HCl pH 8,0 und 50 mM NaCl in deionisiertem Wasser. Die höhere Konzentration des Puffers ist aus zwei Gründen wichtig: Lösen Trolox wird die Lösung in einen sauren und der enzymatischen Reaktion wird auch niedriger der pH-Wert der Lösung im Laufe der Zeit. Da diese Lösung hat eine lange Haltbarkeit kann es als eine Stammlösung gelagert werden. </li><li> Lösen Sie 5 mg Trolox im Puffer in Schritt 1 durch Vortexen für ein paar Minuten und dann Schütteln für&gt; 10 min bereit. Trolox ist nicht sehr leicht löslich in Wasser bei pH&gt; 7, so drängt es nicht diesen Schritt. Die Lösung wird mit einem 0,2 um-Filter und lassen Entgasung im Vakuum für 10 Minuten. </li><li> Bereiten Sie die &quot;gloxy&quot; enzymatische Lösung durch Mischen von 60 ul water, 20 ul 5X Puffer A, 20 ul der Katalase, 1 mg Glucose-Oxidase und 100 ul 10 mg / ml BSA. Die Lösung wird mit einem 0,22 um Filter-Zentrifuge. </li><li> Vorsichtig mischen Puffer aus Schritt 2 mit dem &quot;gloxy&quot;-Lösung aus Schritt 3 Vermeidung der Bildung von Luftblasen. </li><li> Durchfluss der IB durch den Kanal mit einer konstanten Rate von 5 l / min mit einem mechanischen Spritzenpumpe, um den Fluss zu steuern. Bubble-Argon-Gas in die IB Reservoir an Luftsauerstoff aus re-Auflösung in den Puffer zu verhindern. </li></ol> Die Abtastung der Oberfläche, Molekül-Lokalisierung und Erfassung von einzelnen Moleküls Intensität Spuren wird durch ein LabView-Programm, das automatisierte Datenerfassung 1 erlaubt gesteuert. Das Programm scannt 20x20 um 2 Bereiche mit 0,2 mm Auflösung mit einer Geschwindigkeit von 0,1 mu m / ms. Die Daten werden sofort verarbeitet, um die Intensität gewichteten Positionen aller Pixel über dem Hintergrund zählt zu erhalten. Sobald die immobilisierten Moleküle gefunden werden, werden sie verschoben eins nach dem anderen in das konfokale Volumen und die Intensität der Donor-und Akzeptor-Fluorophor als Funktion der Zeit, bis beide Fluorophore photobleach werden aufgezeichnet. Die Bühne ist dann so programmiert werden, um einen neuen Ursprung 100 pm weg, und der Scan-Vorgang wird wiederholt. 4 - repräsentative Ergebnisse Im Folgenden sind einige Bilder zeigen die versammelten mikrofluidische Zelle vor Aktivierung der Oberfläche und, nachdem er auf dem Mikroskop bereit für Molekül Immobilisierung montiert. Wenn der Kanal erfolgreich aktiviert ist, sollte Oberflächenscans ähnlich sein wie die Scans unten zeigt Emission des Donor-Farbstoff (grün) und Akzeptor (rot) nach direkter Anregung des Donors dargestellt. Diese Moleküle sind eins nach dem anderen in die Sondierung Volumen bewegt wird und die Fluoreszenz wird im Laufe der Zeit, bis beide Farbstoffe photobleach aufgezeichnet, wie in der einzigen Molekül Spuren gezeigt. Von Spuren wie diese kann man erhalten, die FRET-Effizienz, die von der momentanen Donor-Akzeptor-Trennung, die wiederum verwendet, um die Struktur und Dynamik von Molekülen von biologischem Interesse zu erkunden, ist informiert. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="Abbildung 1" border="0" /> Abbildung 1: Microfluidic Zelle mit vier Kanälen, die jeweils mit Eingang / Ausgang Kapillaren. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="Abbildung 2" border="0" /> Abbildung 2: Cell am Mikroskop bereit für Messungen montiert. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="Abbildung 3" border="0" /> Abbildung 3: Setup für sm-FRET-Messungen. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 3 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="Abbildung 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="Abbildung 5" border="0" /> Abbildungen 4 und 5: Rote und grüne Kanal eines Oberflächen-Scan von immobilisierten FRET-Moleküle mit grünem Laser angeregt. Bitte klicken Sie auf eine größere Version zu sehen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">Abbildung 4</a> oder <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">Abb. 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="Abbildung 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="Abbildung 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="Abbildung 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="Abbildung 9" border="0" /> Abbildungen 6, 7, 8 und 9: Intensity Flugbahnen der Spender (grün) und Akzeptor (rot) Fluorophoren markiert, um ein DNA-Molekül 8, 10, 16 und 18 Basenpaare voneinander entfernt. Bitte klicken Sie auf eine größere Version zu sehen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">Abbildung 6</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">Abbildung 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">Abbildung 8</a> oder <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">Abbildung 9</a> .

<ol>
	<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Techniques,+a+Laboratory+Manual.">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis.">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules:+Corrections+due+to+nonideal+transfer.">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li><li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li><li>Di Fiori, N., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Article in preparation. , .</li></ol>

Obwohl die obige Protokoll wurde für uns ein besonderes System und für eine bestimmte Auswahl von Farbstoffen (TMR und ATTO647N) optimiert wurde, ist es keineswegs die einzige bewährte Methode. Vor kurzem wurde eine alternative Sauerstoffbindung System, bestehend aus Protocatechusäure (PCA) / ​​Protocatechuat-3 ,4-Dioxygenase (PCD) gezeigt, dass die Photostabilität bestimmter Farbstoffe 4 zu erhöhen. Ebenso können andere Triplett-Zustand Quencher wie β-Mercaptoethanol (BME) anstelle von Trolox verwendet werden, obwohl diese nicht unterdrücken können lang anhaltende Blinken einige Farbstoffe, insbesondere Cy5 5. Obwohl Immobilisierung über Biotin-Streptavidin-biotinylierten Rinderserumalbumin (BSA) ist die bevorzugte Wahl für Nukleinsäuren Studien wird ein Polyethylenglykol (PEG)-beschichteten Oberfläche besser für Untersuchungen von Proteinen geeignet, da es unspezifische Adhäsion 1 verhindert. Darüber hinaus können sub-beugungsbegrenzten Größe Vesikel verwendet werden, um das Biomolekül des Interesses in den Fällen, wo es von Oberflächen-Wechselwirkungen 6 beeinflusst werden kann, zu verkapseln. In diesem Artikel haben wir einem konfokalen Aufbau mit Silikon Avalanche-Photodioden ausgestattet, um die Fluoreszenz-Intensität Spuren erwerben verwendet. Dieses Protokoll funktioniert genauso gut mit Total Internal Reflection Fluorescence Mikroskope (TIRF) mit CCD-Kameras ausgestattet. Unabhängig von der Mikroskopie verwendet, sm-FRET können auf räumliche Auflösungen nähert sich dem Angström, wenn der Donor-und Akzeptor Signal korrekt 7 korrigiert werden informieren.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>TSP150375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica cover slip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Esco Products</td>
<td>R425000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diba Industries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9085</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>0021122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DowCorning</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>Silicone Elastomer Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Trolox</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aldrich</td>
<td>238813</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose Oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kwik-Cast Sealant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>Kwik-Cast</td>
<td>Silicone Casting Compound</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)-Mikroskopie wurde in großem Umfang verwendet werden, um die Struktur und Dynamik von Molekülen von biologischem Interesse, wie Nukleinsäuren und Proteinen zu studieren. Einzelmolekül-FRET (sm-FRET)-Messungen an immobilisierten Molekülen erlauben langen Beobachtungen der System-wirksam, bis beide Farbstoffe photobleach-was in der Zeit-Spuren, die über biomolekulare Dynamik mit einem breiten Spektrum von Zeitskalen von Millisekunden bis Minuten. Zur Erleichterung der Übernahme einer großen Anzahl von Spuren für statistische Auswertungen, muss der Prozess automatisiert werden und die Probe Umfeld sollte dicht über die gesamte Messzeit (~ 12 Stunden) gesteuert werden. Dies geschieht mit Hilfe eines automatisierten konfokalen Mikroskop, das die Befragung von Tausenden von einzelnen Molekülen über Nacht ermöglicht, und einem mikrofluidischen Zelle, die den kontrollierten Austausch von Puffer erlaubt, mit eingeschränkten Sauerstoffgehalt und sorgt für eine konstante Temperatur während des gesamten Messperiode. Hier zeigen wir, wie die Mikrofluidik-Gerät montieren und wie man seine Oberfläche für die DNA-Immobilisierung zu aktivieren. Dann werden wir erklären, wie man einen Puffer vorbereiten, die Photostabilität und die Lebensdauer der Fluorophore zu maximieren. Schließlich zeigen wir die Schritte in der Vorbereitung der Einrichtung für die automatisierte Übernahme von zeitaufgelösten Einzelmolekül-FRET beteiligt Spuren von DNA-Molekülen.

Watch this Scientific Journal Video about Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules at JoVE.com

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

In diesem Artikel beschreiben wir, wie wir FRET Spuren von einzelnen DNA-Molekülen auf einer Oberfläche immobilisiert mittels eines automatisierten konfokalen Mikroskop zu erhalten.

Automated System für Single Molecule Fluorescence Messungen der Oberflächen-immobilisierten Biomoleküle

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

automated-system-for-single-molecule-fluorescence-measurements

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Aufrufe.  Boston University. In diesem Artikel beschreiben wir, wie wir FRET Spuren von einzelnen DNA-Molekülen auf einer Oberfläche immobilisiert mittels eines automatisierten konfokalen Mikroskop zu erhalten.

Serie: Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Single Molecule Methoden zur Überwachung von Veränderungen in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Forschung

Biologie

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Studieren von DNA-Looping von Einzelmolekül-FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Methode zur Kennzeichnung Transkripte in einzelnen Escherichia coli Zellen für Einzelmolekül-Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Experimente

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Isolation und Fluoreszenz-Imaging für Single-Particle-Rekonstruktion der Chlamydomonas Centriolen

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing the innate cellular fluorescence signature from each individual live cell in a population distributed in a three-dimensional (3D) space. The innate fluorescence signature of a cell is a collection of fluorescence signals emitted by various biomolecules within the cell. Previous studies established that innate fluorescence signatures reflect various cellular properties and differences in physiological status and are a rich source of information for cell characterization and identification. Innate fluorescence signatures have been traditionally analyzed at the population level, necessitating a clonal culture, but not at the single-cell level. CRIF is particularly suitable for studies that require 3D resolution and/or selective extraction of fluorescence signals from individual cells. Because the fluorescence signature is an innate property of a cell, CRIF is also suitable for tag-free prediction of the type and/or physiological status of intact and single cells. This method may be a powerful tool for streamlined cell analysis, where the phenotype of each single cell in a heterogenous population can be directly assessed by its autofluorescence signature under a microscope without cell tagging.

Here, a protocol is presented for optically extracting and cataloging innate cellular fluorescence signatures (i.e., cellular autofluorescence) from every individual live cell distributed in a three-dimensional space. This method is suitable for studying the innate fluorescence signature of diverse biological systems at a single-cell resolution, including cells from bacteria, fungi, yeasts, plants, and animals.

Rekonstruktion von einzelligen angeborenen Fluoreszenzsignaturen durch konfokale Mikroskopie

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

Paralleler Hochdurchsatz-Single Molecule Kinetic Assay für standortspezifische DNA-Spaltung

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...