We thank E. Arzt for his support through INM, M. Koch for help with the ESEM, and DENS Solutions for providing the microchips. Research in part supported by the Leibniz Competition 2013.

1. Vorbereitung der Kennzeichnung und Fixierungsreagenzien <ol><li> Vorbereitung Markierungspuffer (BSA-GEL-PBS) unter Verwendung autoklaviert phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4 (PBS). Supplement mit 1% BSA (Rinderalbuminfraktion V, Biotin-frei) und 0,2% Gelatine (GEL, aus Kaltwasserfischen Haut) und Wirbel / gut schütteln. Hinweis: Kann für ~ 5 Tage bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Vorbereitung Waschpuffer (BSA-PBS) von autoklaviertem phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4. Supplement mit 1% BSA und Vortex / gut schütteln. Hinweis: Kann für ~ 5 Tage bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Bereiten Sie 50 mM Boratpuffer (BB) von 200 mM Borsäure Stammlösung, pH-Wert auf 8,3 mit 200 mM Natriumtetra eingestellt. Hinweis: Kann für ~ 12 Monate bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Bereiten 0,1 M Cacodylatpuffer (CB) von 0,2 M Natriumcacodylat Stammlösung, pH-Wert auf 7,4 eingestellt, mit 0,1 M Saccharose ergänzt. Hinweis: Geöffnete Stammlösung kann für ~ 5 Tage bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Vorbereitung 0,1 M Glycin in PBS (GLY-PBS). Hinweis: Kann für ~ 2 Monate bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Bereiten Sie 3% Paraformaldehyd in CB (3% PFA) aus frisch zubereiteten oder geöffneten Fläschchen von 16% PFA, Stammlösung, EM Klasse. Hinweis: Geöffnete Stammlösung kann für ~ 5 Tage bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Bereiten Sie 2% Glutaraldehyd in CB (2% GA) aus frisch zubereiteten (oder geöffneten Fläschchen) 25% GA-Stammlösung, EM Klasse. Hinweis: Geöffnete Stammlösung kann für ~ 5 Tage bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Bereiten 300 nM EGF-Biotin-Markierungslösung <ol><li> Verdünnen Sie 6 um EGF-Biotin-Stammlösung in BSA-GEL-PBS, mit einem Volumen von 100 bis 200 &amp; mgr; l pro Mikrochip. Verwenden Sie innerhalb von ein paar Stunden. </li></ol></li><li> Bereiten Sie 10 nM STR-QD Markierungslösung <ol><li> Zentrifugieren Sie die Streptavidin-QD-Stammlösung für 4 min bei 8000 · g, nehmen Stand und verdünnt 1:10 in BB. Verschiedene Arten von Quantenpunkten verwendet werden kann, beispielsweise QD655 oder QD800. Zu verdünnen, um Endkonzentration in BSA-GEL-PBS, verwenden 75-100 ul pro Mikrochip. Verwenden Sie innerhalb vonein paar Stunden. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung der Siliziumnitridmembran Mikrochips <ol><li> Reinigen eines Mikroskopobjektträger aus Glas, wie für die Lichtmikroskopie verwendet wird, mit einem Reinraum Gewebe und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Äthanol. </li><li> In einer laminaren Luftstroms Werkbank mit einem niedrigen Staubgehalt, öffnen Sie einen Durchmesser von 100 mm Petrischale, und legen Sie die gereinigten Objektglas in die Schüssel; lassen Sie das Gericht offen. </li><li> Mit sauberen Pinzette, bevorzugt mit Kohlefaser oder anderen Beschichtung beschichtet ist, nehmen Sie 4-10 Mikrochips mit dünnen (50 nm) Siliziumnitrid-Membranen, eine nach der anderen, aus ihrer Aufbewahrungsbox und auf den Objektträger. Besorgen Sie sich die Mikrochips sanft an ihren Seiten und berühren Sie die fragile Oberseite, die aus dem dünnen Siliziumnitrid-Membran. Achten Sie unbedingt auf immer die Membranseite und berühren Sie sie nicht. Hinweis: Die Mikrochips sollten rechteckig sein und flachen Kanten senkrecht zu ihrer Siliziumnitrid abgedecktstellen, so dass sie leicht gegriffen werden kann. </li><li> Schließen Sie den Deckel der Petrischale und bringen sie zu einem Abzug. Holen Sie sich einen neuen Reinraumgewebe und legen sie neben der Petrischale. Bereiten Sie zwei saubere 200 ml Glasbecher, indem man mit 50-70 ml Aceton, und die andere mit einem ähnlichen Volumen Ethanol, beide HPLC-Qualität. Übertragen Sie die Mikrochips von der Glasobjektträger zunächst auf die Reinraumgewebe. </li><li> Aus dem Gewebe übertragen Mikrochips eines nach dem anderen in das erste Becherglas mit Aceton zur Entfernung der Schutzlackschicht. Warten Sie 2 Minuten, während sanft bewegten das Becherglas ein paar Mal, um sicherzustellen, dass die Mikrochips sind gut gespült. </li><li> Übertragen Sie die Mikrochips direkt in das Becherglas mit Ethanol, ohne sie auszutrocknen. Warten Sie 2 Minuten. Dann übertragen Sie den Becher auf die laminare Luftströmung Werkbank. Holen Sie sich einen neuen Reinraumgewebe. </li><li> Übertragen Sie die Chips auf das Gewebe und lassen Sie sie für ein paar Minuten trocknen. Übertragen Sie die Mikrochips auf den Objektträger in der Petrischale, schließen Sie das Gericht,und bringen sie in die Plasmareiniger. </li><li> Hinterlegung der Glasobjektträger mit den Mikrochips in das Plasma Reiniger. Ausführen eines 5 min Reinigungsprogramm, um die Oberfläche des Siliziumnitrid-Membran hydrophil zu machen. Hinweis: für unsere Plasmareiniger angewendet Geeignete Einstellungen sind: 70 mTorr Gasstrom von 11,5 sccm für O 2 und 35,0 sccm für Ar, 50 W vorne Radiofrequenz (RF) Ziel, 5 W HF-Bereich und max. reflektierte RF. </li><li> Setzen Sie den Glasobjektträger mit dem Mikrochip in die Petrischale, und schließen Sie den Deckel. Achten Sie darauf, um die Mikrochips sterilen von nun an zu halten. </li><li> Untersuchen Sie die Fensterflächen der Mikrochips unter einem Lichtmikroskop nach möglichen Membranbruch und Restschmutzpartikel. </li><li> Bringen Sie die Petrischale auf die laminare Luftströmung Werkbank. </li><li> Legen Sie die folgenden Elemente in der laminare Luftströmung Workbench: Rohre / Flaschen mit sterilisiert 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung (. PLL, Molekulargewicht 150.000-300.000, steril filtriert und Zellkultur getestet), HPLCreines Wasser, Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum, DMEM ohne Serum, einem Reinraum Gewebe einer sterilen 24-Well-Platte (eine Platte mit 12 Vertiefungen können ebenfalls verwendet werden), einen sterilen 96- ergänzt Well-Platte, sterile Pipettenspitzen, eine Pipette, und flache, abgerundete Spitze, Pinzette. </li><li> Nehmen Sie die 24-Well-Platte, und füllen Sie einen gut mit PLL und zwei Brunnen mit HPLC-Wasser, verwenden Sie eine ca. Volumen von 1 ml pro Vertiefung. Nehmen Sie die 96-Lochplatte und füllen Sie für jeden Mikrochip zwei Brunnen mit Serum DMEM und ein gut mit serumfreiem DMEM, verwenden Sie eine ca. Volumen von 200 ul pro Vertiefung. </li><li> Von nun an mit Hilfe einer Pinzette mit sterilem Tipps, um die Mikrochips zu handhaben. Dies erreichen, zum Beispiel, indem Sie kurz flammenden und anschließend Abkühlung die Spitzen der Pinzette. </li><li> Zuerst übertragen Sie die Mikrochips von der Glasobjektträger auf die Reinraumgewebe. Aus dem Gewebe, Transfer bis zu sechs Mikrochips in die PLL-gefüllte gut, bebrüten die Mikrochips für 5 min. Nichte: Bei einem Experiment mit mehr Mikrochips, füllen weitere Bohrungen im 24-Well-Platte. </li><li> Die Mikrochips Anschließend spülen, indem man sie, einer nach dem anderen, in die erste wassergefüllten gut, und von dort in die zweite Wanne mit Wasser gefüllt. Die Mikrochips in das Wasser länger als etwa eine Minute zu lassen Sie nicht auf die Entfernung von PLL zu vermeiden. </li><li> Schließlich legen Sie sie einzeln in die DMEM gefüllten Wells der 96-Well-Platte. Speichern die 96-Well-Platte im CO 2 kultiviert, bis die Zellsuspension wird hergestellt. </li></ol> 3. Herstellung von Zellen, die auf Mikrochips <ol><li> Führen eine Subkultur von COS7-Zellen, um eine Zellsuspension mit einer Konzentration von ca. vorzubereiten. 5 × 10 5 Zellen / ml. Achten Sie darauf, die Zellen monodisperse. </li><li> Nehmen Sie die 96-Loch-Platte mit den Mikrochips, und fügen Sie einen Tropfen der Zellsuspension in jedes Mikrochip. Warten Sie 5 min. </li><li> Start in den Fensterbereichen der Mikrochips mit einem inversen Mikroskop untersuchen, um choose rechten Augenblick zur Übertragung in ein neues und mit serumfreiem DMEM. Anmerkung: Eine gute Dichte der Zellen mit etwa einer Zelle pro 2500 &amp; mgr; m 2 Fläche erreicht, entsprechend 24 COS7 Zellen auf einer Fenstergröße von 150 x 400 um. Höhere Zelldichten, besteht das Risiko, um eine maximale Abflachung der Zellen zu verhindern. Beachten Sie, dass, nachdem eine Zelle nach unten auf die SIN-Membran angesiedelt, braucht es 3-5 min, um genügend Haftung auf widerschwimm off während der Übertragung in das neue gut entwickelt. </li><li> Übertragen Sie Mikrochip zum nächsten gut, wenn ausreichend Zellen auf das Fenster geklebt. Halten Sie die Mikrochips immer mit den Zellen nach oben und vermeiden Sie jegliche Berührung dieser Seite. </li><li> Nach der Übertragung prüfen jeden Mikrochip-Fenster wieder. Wenn zu viele Zellen wurden gewaschen und die Anzahl der verbleibenden Zellen nicht ausreichend ist, erneut verreiben die Zellsuspension (aufzubrechen neu gebildeten Zellklumpen) und wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,5. </li><li> Wenn alle übertragenen Mikrochips genuganhaftenden Zellen auf ihre Fensterflächen, übertragen Sie die Chips in den letzten gut mit serumfreiem DMEM. Legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen in die CO 2-Inkubator und lassen Sie die Zellen zu gewinnen und flach aus für mehrere Stunden, am besten O / N. </li></ol> 4. EGFR Labeling, Fixierung und Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Für die folgenden Schritte, verwenden Sie ein 96-Loch und einer 24-Well-Platte. Pre-fill Wells mit den jeweiligen Lösungen, und verwenden Sie eine Zeile oder Spalte per Mikrochip. Die 24-Well-Platte ist unter dem Abzug für die Fixierung Schritte mit CB, PFA und GA verwendet. Immer übertragen Mikrochips mit den Zellen nach oben und vermeiden Sie jegliche Berührung dieser Seite. </li><li> Mikrochips spülen, indem man die Mikrochips in einem gut mit frischen BSA-GEL-PBS, dann legen Sie Platte mit 96 Vertiefungen in Brutschrank bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Inkubieren mit 300 nM EGF-Biotin-Lösung für 3 min bei 37 ° C. Da die Zellen wird die Endozytose von EGF-markierten EGFRs starten, gehen Sie so schnell wie möglich nach Step 4,4. </li><li> Spülen 3 mal mit PBS und 1-mal mit CB (jetzt der 96-Well-Platte wird wieder bei RT). </li><li> Inkubieren in 3% PFA für 10 min. </li><li> Spülen Chips 1 Zeit mit CB, und 3-mal mit PBS. </li><li> Inkubieren in Gly-PBS für 2 Minuten, spülen Sie 2 mal mit 1 Zeit PBS. </li><li> Inkubieren in 10 nM STR-QD 10 min. </li><li> Mit BSA-PBS spülen 4 mal. </li><li> Tauchen Sie einen Mikrochip in einem Glasboden-35-mm-Schale mit BSA-PBS-Fertig bei RT. </li><li> Erwerben Differentialinterferenzkontrast (DIC) Bildern und Fluoreszenzbilder von QD-markierte Zellen. <ol><li> Verwenden Sie ein 40-facher Luft Ziel für Übersichtsbilder der Zellen mit QD655 beschriftet. Verwenden Sie ein Ölimmersionsobjektiv (beispielsweise 63X), um die effizienteste Sammlung des emittierten Fluoreszenzlicht zu ermöglichen; Dies ist insbesondere dann erforderlich, wenn Abbilden Zellen mit QD800 markiert. </li><li> Verwenden Sie einen Filterwürfel, die die QDs zur Fluoreszenzanregung Licht zwischen 340 und 380 nm über 420 nm sui aussetzt und ermöglicht die Erfassung des emittierten LichtsTabelle für die meisten QD (Filter Cube A in diesem Fall). </li><li> Minimieren Sie die Lichtintensität, zu intensives Licht, das die Probe beschädigen könnten. Stellen Sie die Belichtungszeit auf mindestens 300 ms, so dass die Signale aller QDs erfasst, stellt fest, dass die Fluoreszenz der QDs hat eine Blinkverhalten. </li><li> Passen Sie die Lichtintensität und die Verstärkung zu helle Bilder ohne sichtbare Bildrauschen zu schaffen, bei gleichzeitiger Minimierung der Lichtintensität. Hinweis: Alternativ können kürzere Belichtungszeit verwendet, wenn Bildserie werden von der gleichen Region übernommen werden. Diese Serie kann verarbeitet werden, um eine maximale Bildprojektion ergeben, was zu einer Mittelwertbildung und damit Geräuschreduzierung des resultierenden Bildes. </li></ol></li><li> Legen Sie die abgebildeten Mikrochip zurück (Zellen nach oben) in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit BSA-PBS gefüllt. </li><li> Spülen Mikrochips 1 mal in CB. </li><li> Inkubieren in 2% GA für 10 min. </li><li> Spülen Sie 1 Mal in CB und 3-mal mit BSA-PBS. </li><li> Shop Mikrochips bis ESEM imaging, in BSA-PBS vorgefüllten Vertiefungen einer neuen Platte mit 96 Vertiefungen. Für jeden Mikrochip füllen eine Reihe von vier Vertiefungen mit HPLC-Wasser. Anmerkung: Die Proben können bei 4 ° C mehrere Wochen haltbar, aber die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn der vollständige Abbildungsreihe innerhalb von zwei Tagen durchgeführt. QDs wird langsam beginnen, um aus der Probe zu trennen, es wird daher nicht empfohlen, mehr als 10 Tage warten, bevor der ESEM-Bildgebung durchgeführt wird. Anmerkung: Die Fluoreszenzbilder werden für die zukünftige Analyse gelagert. Die Positionen der Zellen in den Bildern kann leicht mit Elektronenmikroskopie Bildern über die Lokalisierung der Ecken des SiN-Fenster und Messen der Positionen relativ zu den Ecken in Beziehung gesetzt werden. Hinweis: Es ist ratsam, Qualitätsfluoreszenzbilder zu drucken und nutzen sie zur Orientierung bei der Aufnahme die ESEM Bilder. </li></ol> 5. Wet ESEM-STEM ganzer Zellen <ol><li> Bereiten Sie die ESEM für nasse STEM <ol><li> Montieren Sie den gasförmigen Sekundärelektronen-detector (GSED) und die Peltier-Stufe, die das STEM-Detektor (unter der Probe entfernt). </li><li> Starten Sie den Kühlwasserstrom durch die Bühne, und die Temperatur um 3 ° C. </li><li> Die Bühne xy-Koordinaten auf Null, und stellen Sie den Arbeitsabstand auf ca. 6 mm. </li></ol></li><li> Während der ESEM-Bildgebung, halten Sie die 96-Loch-Platte mit den Mikrochips zu kühlen, beispielsweise auf gefrorenen Kühlelemente, in einem Styropor-Box. </li><li> Zum Laden einer Probe in die vorgekühlten ESEM-STEM Bühne, nehmen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen aus dem Kühlbehälter und legen Sie sie in der Nähe der geöffneten ESEM Bühne. Setzen Sie einen neuen Reinraumgewebe daneben. </li><li> Schnell spülen einen Mikrochip (mit den Zellen nach oben) durch Eintauchen vier Mal, jedes Mal für etwa eine Sekunde, in eine gut mit HPLC-Wasser gefüllt. </li><li> Tupfen Sie die Rückseite des Mikrochips kurz auf die Reinraumgewebe und legen Sie den Mikrochip in den vorgekühlten Bühne. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nass bleiben, kann das seindurch eine reflektierende Oberfläche erkannt (Trocknen ergibt eine matte Oberfläche). </li><li> Befeuchten Sie die Probenoberfläche mit 3 ul abgekühlt HPLC-Wasser (stellen Sie sicher, dass Sie die Oberfläche mit der Pipettenspitze berühren), und befestigen Sie die Probe in der Bühne. </li><li> Stellen drei zusätzliche 3 &amp; mgr; l Wassertröpfchen auf der Stufe nahe der Probe. </li><li> Schließen Sie die Probenkammer </li><li> Spülen Sie die Probenkammer durch Aus- und Einschalten der Druck fünf Mal zwischen 800 und 1500 Pa. Beenden Sie das Radfahren mit 800 Pa. </li><li> Schalten Sie den Elektronenstrahl (30 kV) an und untersuchen Sie die Probe unter der niedrigsten Vergrößerung mit beiden Detektoren, dh der GSED und der STEM-Detektor, um für den Standort des Mikrochips Fenster zu suchen. Hinweis: Wenn die Wasserschicht zu dick ist, kann das Fenster nicht sichtbar sein. In diesem Fall starten Absenken des Drucks auf 760 Pa und warten Sie einige Minuten. Das Fenster wird erst mit der GSED sichtbar. </li><li> Positionieren Sie den SiN-Membran-Fenster in der Mitte des Bildes, indem Sie den Specimen Bühne und den Druck auf 750 bis 720 Pa zu reduzieren. Hinweis: Wenn der Wasserschicht dünn genug ist, wird das Fenster auch mit der STEM-Detektor sichtbar. </li><li> Von nun an verwenden die Dunkelfeld-Segment des STEM-Detektor, um Bilder aufzunehmen. Zunächst erwerben ein oder zwei Bilder, die alle Zellen auf der gesamten Fensterfläche. </li><li> Vergleichen Sie diese ESEM Bilder mit der Lichtmikroskopie Bilder, suchen Sie die Ecken des SiN-Fenster. </li><li> Korrelieren die Koordinatensysteme beider Mikroskopie Modalitäten durch den Vergleich der Vergrößerung, Rotation und möglicher Spiegelung. Suchen Sie die gleichen Zellen in beiden Bildern. </li><li> Wählen sehr kleine Schmutzpartikel oder ein Zellenbereich mit kleinen Merkmalen zu Abbildungseinstellungen, wie dem euzentrischen Höhe der Feinorientierung und die Korrektur der Linsen stigmatism einzustellen. Arbeiten bei einer Vergrößerung von mindestens 50.000X verwenden eine Elektronensondenstrom etwa 0,6 nA, einen Pixel-Verweilzeit von 30 us und eine Bildgröße von 1024 x 884 Pixel. Hinweis: Weitere Einstellungen können auch be verwendet wird, solange eine Erhöhung der Elektronendosis vermieden. Hinweis: Auch bei der Arbeit sehr sauber, werden die Chipoberflächen in der Praxis immer enthalten einige Schmutzpartikel, da das Protokoll nicht in einer Reinraumumgebung ausgeführt. </li><li> Um STEM Bilder aus den QD-markierte Zellen aufzeichnen, beziehen sich auf die Fluoreszenzbilder und wählen Sie eine Zelle von Interesse. Hinweis: Es ist am besten, mit einer Zelle, die starke QD Signale starten. </li><li> Nehmen Sie einen Überblick über STEM Bild dieser Zelle. </li><li> Gehen Sie zu einem Randbereich, wo die Zelle Rand ist sichtbar und vergrößern, um 50.000X Vergrößerung erreichen. </li><li> Nehmen Sie die Bilder, welche einzelnen QDs, verwenden Pixelverweilzeiten von 20-30 &amp; mgr; s. Um Strahlenschäden, Bild jede Region nur einmal mit hoher Vergrößerung zu vermeiden. Hinweis: In der Regel, in dieser Phase sowohl, den Fokus und die Korrektur des Astigmatismus, müssen einige Feineinstellung. </li><li> Nach der Aufnahme von einer ausreichenden Anzahl von hoher Vergrößerung Bilder, Zoom-out und Wechselerfordern eine weitere STEM Übersichtsbild, Darstellung der Regionen nur mit hoher Vergrößerung als dunkle Rechtecke aufgezeichnet. Hinweis: Diese Übersichtsbilder werden später dazu dienen, ESEM und Fluoreszenzbilder zu korrelieren und die genaue Lage der hohen Vergrößerung Bilder innerhalb der zellulären Kontext zu bestimmen. </li><li> Weiter zur nächsten Zelle von Interesse, beginnen Sie mit einem Übersichtsbild, nehmen Sie eine Reihe von Bildern mit hoher Vergrößerung, und am Ende mit einem Übersichtsbild. </li><li> Am Ende eines ESEM Bildgebungssitzung, erhöhen den Druck auf 850 bis 900 Pa vor dem Start, um die Kammer zu entlüften. Anmerkung: Diese Druckerhöhung verbessert die Möglichkeit der Wiedergewinnung des Mikrochip mit einer noch benetzten Fläche; Dies kann jedoch nicht immer erreicht werden. Eine Probe, die nie getrocknet worden ist, kann in BSA-PBS wieder hergestellt werden und, falls gewünscht, in der ESEM erneut untersucht zu einem späteren Zeitpunkt. </li></ol>

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	<li>Dukes, M. J., Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence+microscopy+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum-dot-labeled+proteins+in+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence microscopy and scanning transmission electron microscopy of quantum-dot-labeled proteins in whole cells in liquid.</a> ACS Nano. 4, 4110-4116 (2010).</li><li>Nishiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+scanning+electron+microscope+observes+cells+and+tissues+in+open+medium+through+silicon+nitride+film.">Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film.</a> J. Struct. Biol. 169, 438-449 (2010).</li><li>Kinoshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-electron+microscopy+of+primary+cell+cultures+from+genetically+modified+animals+in+liquid+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy.">Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 20, 469-483 (2014).</li><li>Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+whole+cells+in+liquid+with+nanometer+resolution.">Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).</li><li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Scanning+Transmission+Electron+Microscopy:+Imaging+Protein+Complexes+in+their+Native+Environment+in+Whole+Eukaryotic+Cells.">Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells.</a> Microsc. Microanal. 20, 189-198 (2014).</li><li>Peckys, D. B., Baudoin, J. P., Eder, M., Werner, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+subunit+locations+determined+in+hydrated+cells+with+environmental+scanning+electron+microscopy.">Epidermal growth factor receptor subunit locations determined in hydrated cells with environmental scanning electron microscopy.</a> Sci. Rep. 3, 2621-2626 (2013).</li><li>Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+variations+of+HER2+dimerization+in+breast+cancer+cells+discovered+by+correlative+fluorescence-+and+liquid+electron+microscopy.">Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence- and liquid electron microscopy.</a> Science Advances. under revision, (2015).</li><li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nat. Meth. 2, 743-749 (2005).</li><li>Herbst, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+epidermal+growth+factor+receptor+biology.">Review of epidermal growth factor receptor biology.</a> Int. J.Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59, S21-S26 (2004).</li><li>Normanno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+signaling+in+cancer.">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer.</a> Gene. 366, 2-16 (2006).</li><li>Hofman, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+coalescence+of+different+lipid+rafts.">EGF induces coalescence of different lipid rafts.</a> J. Cell Sci. 121, 2519-2528 (2008).</li><li>Irwin, M. E., Mueller, K. L., Bohin, N., Ge, Y., Boerner, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+raft+localization+of+EGFR+alters+the+response+of+cancer+cells+to+the+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+gefitinib.">Lipid raft localization of EGFR alters the response of cancer cells to the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib.</a> J. Cell Physiol. 226, 2316-2328 (2011).</li><li>Lillemeier, B. F., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane-associated+proteins+are+clustered+into+islands+attached+to+the+cytoskeleton.">Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 18992-18997 (2006).</li><li>Mayawala, K., Vlachos, D. G., Edwards, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneities+in+EGF+receptor+density+at+the+cell+surface+can+lead+to+concave+up+scatchard+plot+of+EGF+binding.">Heterogeneities in EGF receptor density at the cell surface can lead to concave up scatchard plot of EGF binding.</a> FEBS Lett. 579, 3043-3047 (2005).</li><li>Valley, C. C., Lidke, K. A., Lidke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+organization+of+ErbB+receptors:+insights+from+microscopy.">The spatiotemporal organization of ErbB receptors: insights from microscopy.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6, (2014).</li><li>Peckys, D. B., Bandmann, V., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence-+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence- and scanning transmission electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Meth. Cell Biol. 124, 305-322 (2014).</li><li>Peckys, D. B., Dukes, M. J., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence+and+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence and electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Methods Mol. Biol. 1117, 527-540 (2014).</li><li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells.">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> J. Microsc. 243, 273-283 (2011).</li><li>Bogner, A., Thollet, G., Basset, D., Jouneau, P. H., Gauthier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wet+STEM:+A+new+development+in+environmental+SEM+for+imaging+nano-objects+included+in+a+liquid+phase.">Wet STEM: A new development in environmental SEM for imaging nano-objects included in a liquid phase.</a> Ultramicroscopy. 104, 290-301 (2005).</li><li>Chung, I., Akita, R., Vandlen, R., Toomre, D., Schlessinger, J., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells.">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464, 783-787 (2010).</li><li>Stoyan, D., Stoyan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+pair+correlation+functions+of+planar+cluster+processes.">Estimating pair correlation functions of planar cluster processes.</a> Biom. J. 38, 259-271 (1996).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tumor-targeted+fluorescence+imaging+using+near-infrared+non-cadmium+quantum+dots.">In vivo tumor-targeted fluorescence imaging using near-infrared non-cadmium quantum dots.</a> Bioconjug. Chem. 21, 604-609 (2010).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work.">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Meth. 6, 21-23 (2009).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem. Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Warren, C. M., Landgraf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+ERBB+receptors:+Multiple+layers+of+diversity+and+control.">Signaling through ERBB receptors: Multiple layers of diversity and control.</a> Cell. Signal. 18, 923-933 (2006).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Mol. Cell. Proteomics. 12, 1563-1571 (2013).</li><li>Hoenger, A., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+macromolecular+organization+of+cells+by+electron+tomography.">Probing the macromolecular organization of cells by electron tomography.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 89-96 (2009).</li><li>Zhang, J., Leiderman, K., Pfeiffer, J. R., Wilson, B. S., Oliver, J. M., Steinberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+topography+of+membrane+receptors+and+signaling+molecules+from+spatial+patterns+obtained+using+nanometer-scale+electron-dense+probes+and+electron+microscopy.">Characterizing the topography of membrane receptors and signaling molecules from spatial patterns obtained using nanometer-scale electron-dense probes and electron microscopy.</a> Micron. 37, 14-34 (2006).</li><li>Pinto da Silva, P., Kan, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-fracture:+a+method+for+high+resolution+labeling+of+cell+surfaces.">Label-fracture: a method for high resolution labeling of cell surfaces.</a> J. Cell Biol. 99, 1156-1161 (1984).</li><li>Bergersen, L. H., Storm-Mathisen, J., Gundersen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+quantification+of+amino+acids+and+proteins+in+complex+subcellular+compartments.">Immunogold quantification of amino acids and proteins in complex subcellular compartments.</a> Nat. Protoc. 3, 144-152 (2008).</li><li>Orlov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+immunogold+labelling+of+RNA+polymerase.">Live cell immunogold labelling of RNA polymerase.</a> II. Sci. Rep. 5, 8324 (2015).</li><li>Fiala, G. J., Kaschek, D., Blumenthal, B., Reth, M., Timmer, J., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clustering+of+the+B+cell+antigen+receptor+demonstrated+by+mathematically+extended+electron+microscopy.">Pre-clustering of the B cell antigen receptor demonstrated by mathematically extended electron microscopy.</a> Front. Immunol. 4, 427 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

, Die räumliche Verteilung und die Stöchiometrie der Membranproteine, wie beispielsweise die EGFR, in ganzen Zellen wichtige Kontextinformation über seine Funktion und deren eventuellen Änderungen 11-14. Es wird schwierig, die Verteilung der Monomere, Dimere und Cluster direkt auf einem subzellulärer Ebene mit gängigen biochemischen Verfahren, für die Informationen über die Lokalisierung des Proteins in der Zelle oder Unterschiede zwischen den Zellen 15 verloren studieren. Die hier beschriebenen Etikettierung und Mikroskopieverfahren erlauben die Sichtbarmachung von Proteinkomplexen auf einer Längenskala von wenigen Nanometern, so daß seine Stöchiometrie kann im Rahmen der einzelnen, intakten Zellen 4-7 untersucht werden. Dies ist nicht mit der (Super Resolution) Lichtmikroskopie 23, weil seine Entschließung nicht ausreichend, um Moleküle in einem Proteinkomplex beschäftigt zu unterscheiden ist möglich. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ist ein Ensemble Mittelungstechnik &lt;sup&gt; 24, und nicht unbedingt die Dimere und höhere Ordnung Clustern zu erkennen als Folge der kurzen Reichweite der Energieübertragung 25. Ligationsassays 26 nicht tatsächlich Abstände zu messen und daher nicht in der Lage ist, zwischen einem zellularen Bereich mit einem hohen Proteindichte unvermeidlich, was zu einer Anzahl von detektierten Annäherungen durch Zufall aus einer zelluläre Region mit einer ähnlichen Proteindichte aber Protein enthält Komplexe unterschiedliche Abstände zwischen den Etiketten aufweisen. Die geforderte hohe Auflösung, die Bestandteile von Proteinkomplexen Visualisierung wird durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) erreicht. Jedoch wird die herkömmliche TEM von ganzen Zellen durch die Anforderung von dünnen Proben / Abschnitte schneiden durch die Plasmamembran 27 oder Plasmamembran Rippen oder Abbruch 28,29 was zufällig gebildeten kleinen Membranstücke beschränkt. Die Plasmamembran wird somit nicht als Ganzes abgebildet wird, was zu einem Mangelder möglicherweise entscheidenden zellulären Kontext-Informationen. Andere experimentelle Herausforderungen für die Untersuchung von Protein-Stöchiometrie in Zellen entstehen aus der aufgetragenen Proteinmarkierung. Üblicherweise verwendeten Immunmarkierung trägt die Schwierigkeit, die eins-zu-eins-Stöchiometrie zwischen Rezeptor und Marker kann nur mit einem einwertigen Sonde erreicht werden kann; ist dies nicht der Fall, wenn primäre und sekundäre Antikörper erforderlich sind. Um Informationen über die Protein Stöchiometrie zu erhalten, ist es erforderlich, dass eine Sonde bindet eindeutig einem Epitop auf dem Rezeptor und weist eine Bindungsstelle für eine Fluoreszenzsonde oder einer hohen Ordnungszahl Nanopartikel auf der anderen Seite. Zweitens ist die Präzision erreichbar mit Antikörper-Markierung aufgrund ihrer Größe von 30 bis 30 nm beschränkt, so dass eine Unterscheidung zwischen Nachbar einzelne Proteine, Homodimere oder größere Cluster nicht möglich ist, zumindest nicht für Rezeptoren der EGFR-Familie. Viel kleineren spezifischen Etiketten werden in der Literatur und ca bekanntn auch für die intrazelluläre Markierung 31 aufgebracht werden, aber diese sind nicht häufig verwendet. Die Länge des gesamten Etiketts (EGF-Biotin-Streptavidin-QD) von ähnlicher Abmessung wie die EGFR und ausreichend klein, um das Dimer zu detektieren. Außerdem vermeidet die beschriebene zweistufige Etikettiervorgang Kennzeichnung induzierten Rezeptoraggregation. Unsere Methode ist nicht sehr schwierig, nicht viel mehr als Fluoreszenzmikroskopie von markierten Proteinen. Jedoch benötigt ein Experiment mit großer Sorgfalt durchgeführt werden, da die Anzahl der Stufen summiert und ein Fehler in einem der Schritte können zu einem kompletten Ausfall des Experiments führt. Der Umgang mit den Mikrochips ist langweiliger als die Handhabung von TEM Grids, aber einige Trainings leere Chips wird empfohlen. ESEM-STEM ganzer hydratisierten Zellen ist wahrscheinlich der schwierigste Aspekt und erfordert mindestens eine qualifizierte Betreiber und mehrere Tage von der Praxis, um eine Auflösung von etwa 3 nm zu erreichen, wie erforderlich, um die QDs zu visualisieren. Strahlung damAlter der Probe unter Untersuchung eine Gefahr. Der Druck und die Temperatur sollte sorgfältig beobachtet, um eine Wasserschicht aufrecht zu erhalten. Darüber hinaus kann die Dicke der Wasserschicht zwischen den Zellen variieren. Es ist ratsam, die Anwesenheit der Wasserschicht unter Verwendung des gasförmigen Elektronendetektor über die Probe zu überwachen, wie auch anderswo. 6 beschrieben Zelluläre Regionen sollten nur einmal oder zweimal abgebildet werden, um Schäden zu vermeiden. Eine Haupteinschränkung des Verfahrens besteht darin, dass hochauflösende Information über die Ultrastruktur fehlt. Andere Techniken, zum Beispiel Cryo TEM, werden benötigt, um die Proteinstruktur und der zellulären Ultrastruktur 15 zu studieren. Zweitens die Untersuchung der dynamischen Zusammenspiel von einem Vielfachen von Proteinen in lebenden Zellen in Zeitraffer-Mikroskop nicht möglich ist aufgrund von Strahlenschäden und erfordert state-of-the-Art-Lichtmikroskopie 23. Derzeit ist unser Verfahren nicht in der Lage, die Bestimmung der absoluten Höhe der Dimere seit dem lAbeling Effizienz ist unbekannt, aber wir erwarten, dass diese Daten in Zukunft hinzuzufügen. Dennoch ist es möglich, zu sagen, ob Dimere vorhanden sind oder nicht. Aus der Literatur ist bekannt, dass sogar ein Markierungseffizienz etwa 15% reicht aus, um Dimere mit ausreichender statistischer Signifikanz 32 zu erkennen. Es ist ohne weiteres möglich, andere membrangebundene Rezeptoren über ihre Liganden zu untersuchen, über biotinylierten Fab-Fragmenten von Antikörpern oder über andere kleine Linker 7 unter Verwendung des beschriebenen zweistufigen Markierungsprotokoll. Da wir bereits gezeigt, dass zwei verschiedene Farben (Größen) der QDs verwendet werden kann, und Gold-Nanopartikel-Markierung wurde in früheren Arbeiten 6 verwendet, so scheint es möglich, mehrere Proteinspezies im gleichen Experiment zu beschriften. Die größte Herausforderung für die Untersuchung der Stöchiometrie von mehreren Proteinspezies ist die Gewährleistung einer ähnlichen Markierungseffizienz für beide Spezies oder zumindest eine Normalisierung der erhaltenen relativen Stöchiometrie auf der Achtungive Kennzeichnung Wirkungsgrade. Dennoch unterscheiden sich die beiden unterschiedlichen QD in dieser Studie verwendet scheinen nicht sehr verschieden in Markierungseffizienz (siehe 2 und 4). Das beschriebene Verfahren, das Zwei-Schritt-Markierung mit QDs und korrelative Fluoreszenzmikroskopie und ESEM-STEM stellt eine praktikable Methode, um das komplexe Zusammenspiel von Membranproteinen in den intakten Plasmamembranen von ganzen Zellen zu studieren.

Ein neuer Ansatz wurde vor kurzem mit markierten Proteinen in flüssigem Zustand unter Verwendung von STEM 1-3 oder korrelative Fluoreszenzmikroskopie und STEM 4-7 eingeführt, die dem Bild mit ganzen Zellen. Diese Methode ist in der Lage, die räumliche Verteilung der Membranproteine ​​und Proteinkomplexen einschließlich ihrer Stöchiometrie auf der Einzelmolekülebene in den intakten Plasmamembranen von ganzen Zellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit einen zweistufigen spezifische Markierung von Rezeptorproteinen mit Fluoreszenzquantenpunkten (QDs) 8 und korrelativen Lichtmikroskopie und ESEM-STEM. Als Beispiel untersuchten wir die EGFR, ein Membranprotein, das an die Proteinkinase-Superfamilie gehört. Nach Ligandenbindung aktiviert und dann der Rezeptor bildet ein Dimer mit einem anderen aktivierten EGFR; die nachfolgende Signalkaskade treibt Zellproliferation 9. Mutationen, die zu abnormalen EGFR-Expression oder -Aktivität spielen eine zentrale Rolle in vielen Arten von Krebs 10. Studying die räumliche Anordnung dieser Membranrezeptor in ganzen Zellen wichtige Kontextinformation über seine Funktion und deren eventuellen Änderungen 11-14. Aber es bleibt schwierig, die Verteilung der EGFR Monomere, Dimere und Cluster direkt auf einem (Teil-) zellulärer Ebene mit biochemical- oder konventionellen Mikroskopieverfahren 15 zu sondieren. Unsere Methode ist in der Lage, zu visualisieren EGFRs mit einer räumlichen Auflösung von wenigen Nanometern, so dass die Positionen von Proteinen, in einem Komplex bestimmt werden kann. Am wichtigsten ist, bezieht sich die erhaltenen Informationen zu dem stöchiometrischen Verteilung zum nativen Zustand des Proteins in der intakten Zelle. Um eine kurze Strecke zwischen dem Etikett und dem Rezeptor zu erreichen, wurde EGFR direkt über seinem Liganden EGF bezeichnet, mit einer Biotin-Streptavidin-Bindung zu einem QD. Dieses Label kann sowohl mit Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden. Wir haben dieses Label für korrelative Bildgebung von COS7-Zellen in verwendetFlüssigkeit in einem mikrofluidischen Kammer zuvor 1,16,17 umschlossen. Jedoch aufgrund eines Vielfachen von Streptavidin-Molekülen pro QD, kann das Etikett im Rezeptoraggregation induzieren, was zu einer geringen Markierungsausbeute oder eher teuer Experimenten und es ist nicht möglich, auf die Stöchiometrie der untersuchten Proteins schließen. Etikett induzierten Rezeptorclusterbildung ganz durch den Einsatz der hier dargestellten zweistufigen Markierungsverfahren, was zu einer Sonde, umfassend biotinylierten EGF, denen nur ein Streptavidin-Quantenpunkt (STR-QD) angekoppelt ist vermieden. Die Zellen werden zuerst mit biotinyliertem EGF inkubiert und dann fixiert. Der Fixierungsschritt bestimmt den Zeitpunkt, zu dem Protein Prozesse werden gestoppt (in Abhängigkeit von der Geschwindigkeit der Fixierung). STR-QD wird anschließend als zweiten Schritt der Markierungsprotokoll angewendet. Clustering nicht stattfindet, da dynamischen Membranbewegung der Proteine ​​behindert wird, wenn die Proteine ​​befestigt sind. Darüber hinaus ist die STR-QD-Lösung, die dieteuerste Komponente des Experiments sich in optimierter geringer Konzentration angewendet werden, und dieser zweite Schritt der Etikettierung ist es zeitlich nicht entscheidend, dh die QD in einigen Minuten angekoppelt werden. Die Stöchiometrie von EGFR zu untersuchen, wie in ganzen Zellen verteilt waren zelluläre Proben auf Silicium-Mikrochips 18 vorbereitet. Nach dem Aufbringen des zweistufigen QD Kennzeichnung sowie die Aufzeichnung der Fluoreszenzmikroskopiebilder wurden die Zellen mit reinem Wasser gespült und in hydratisiertem Zustand unter Verwendung von ESEM-STEM 19 abgebildet. Die resultierenden Korrelations Bilder geben Auskunft über die zellulären EGFR Verteilung und der Stöchiometrie in ihrem natürlichen Kontext der hydratisierten Zellen. Ein ähnliches Verfahren wurde verwendet, um Proteine ​​HER2 in Brustkrebszellen in einer aktuellen Studie 7 studieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>AF6000 + DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESEM</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td>Quanta 400 FEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x) - Calcium chloride - Magnesium chlorid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstripper</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>25-056 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, chromasolv Plus for HPLC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34877-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Roti-Stock 10x PBS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1058.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Rotisolv HPLC grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin-free (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>O163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7041-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T873.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shoul</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>E3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium teraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9640-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 streptavidin conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Q10121MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 800 streptavidin conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Q10173MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon microchips with silicon nitride membranes</td>
			<td>DENS Solutions</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>of 50 nm thickness and dimensions of 50 &#181;m x 0.40 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the stoichiometry of epidermal growth factor receptor in intact cells using correlative microscopy

Dieses Protokoll beschreibt die Markierung des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) auf COS7-Fibroblastenzellen und anschließende korrelativen Fluoreszenzmikroskopie und Environmental Scanning-Elektronenmikroskopie (ESEM) von ganzen Zellen in hydratisiertem Zustand. Fluoreszenzquantenpunkten (QD) wurden über eine zweistufige Markierungsprotokoll an EGFR gekoppelt und stellt eine effiziente und spezifische Markierung von Proteinen, unter Vermeidung Etikett induzierten Clustering des Rezeptors. Fluoreszenzmikroskopie zur Verfügung gestellt Übersichtsbilder der zellulären Stellen des EGFR. Die Rastertransmissionselektronenmikroskop (STEM) Detektor wurde verwendet, um die QD-Etiketten mit nanoskaliger Auflösung zu erfassen. Die erhaltenen korrelativen Bilder liefern Daten des zellulären EGFR Verteilung und der Stöchiometrie auf der Einzelmolekülebene in der natürlichen Umgebung des hydratisierten intakte Zelle. ESEM-STEM-Bilder zeigten der Rezeptor als Monomer vorliegen, wie Homodimer und in kleinen Clustern. Markierung mit zwei verschiedenen QDs,dh eine Emission bei 655 nm und bei 800 offenbart ähnliche Charakteristik Ergebnisse.

Figur 1 und 2 zeigen repräsentative Bilder von QD655 markierten membrangebundener EGFR in intakten, vollständig hydratisiert COS-7-Zellen sichtbar gemacht. Das DIC-Bild in Abbildung 1 a gibt einen Eindruck von der Membran Topographie der Zellen und die entsprechenden Fluoreszenzbild in Figur 1b veranschaulicht die Verteilung der EGFR nach 3 min der EGF-Biotin inkubiert. 1A und B sind jeweils zusammen aus zwei genähte Bilder mit einer 40X Luftziel aufgezeichnet. Der EGF EGFR aktiviert wird über die gesamte Zelloberfläche verteilt. In den meisten Zellen eine leichte Verstärkung der Fluoreszenz (1B) können an den Zellenrändern zu sehen ist, die einen lokal erhöhten Auftreten von EGFR 20. Kontrollversuche durchgeführt, unter Verwendung eines ähnlichen Protokolls verifiziert bestimmte EGFR Kennzeichnung (Daten nicht gezeigt). Diese Steuerungen enthalten: 1) ein Steuer Kennzeichnung ohne vorherige Inkubation der cells mit EGF-Biotin, dh nur Inkubation mit STR-QD, und 2) einer Inkubation mit nicht-biotinyliertem EGF und STR-QD. Die drei Zellen mit Rechtecken markiert wurden weiter mit ESEM-STEM sucht. Die ESEM-STEM Bilder in 1C dargestellt - E zeigen geringer Vergrößerung Übersichten dieser Zellen. Diese Transmissionsbilder reflektieren ganzen Zellen in hydratisiertem Zustand mit einer dünnen Wasserschicht über der Zelle aufhalten auf einem Silizium-Mikrochip mit Siliziumnitrid (SiN) Sichtfenster angeordnet. Die Vakuumkammer im Mikroskop enthaltene Wasserdampf, und das Gleichgewicht zwischen der Probentemperatur und der Druck wurde so eingestellt, um eine dünne Schicht der Flüssigkeit auf den Zellen zu halten. Die einzelnen Zellen können leicht auf Grund ihrer Form und Lage auf die Membran SiN Fenster erkannt werden kann. Die Low-Vergrößerung ESEM-STEM Bilder offenbaren feine Strukturen, wie Filopodien, die sich von der Zellkante zur benachbarten Zellen und einige Struktureninnerhalb der dünneren Zellregionen. Dicken zentralen zellulären Regionen einschließlich den Kern weiß erscheinen, weil die Übertragung durch die Probe ist nicht möglich, für Elektronen der eingesetzten Energie (30 keV). Hochauflösende ESEM-STEM-Bilder wurden in den Verdünner, Randregionen erfasst. Die räumliche Auflösung für die ESEM-STEM von Nanopartikeln in den dünnen Regionen von Zellen in einer dünnen Flüssigkeitsschicht wurde in einer früheren Studie 6 bestimmt, bis zu 3 nm betragen. Vier Bilder mit hoher Auflösung in 2A gezeigt - D wurden an den Stellen der kleinen Rechtecke in 1C aufgezeichnet - E. Die verwendete Vergrßerung war ausreichend, um einzelne QD erscheinen als helle, geschoßförmigen Stangen zu erkennen, die jeweils einer einzelnen gebundenen EGFR. Die QD655 hat typischen Abmessungen von 6 x 14 nm 2. 2A (entspricht der rechteckige Bereich in der Zelle in Figu deutetWieder 1C) zeigt QD Etiketten auf einer Membran diagonal falten Querung des Bildes. Diese Membranstruktur weist eine höhere Dichte als die EGFR umgebenden Membranbereichen. An mehreren Standorten, waren zwei Etiketten in unmittelbarer Nähe. Zwei Beispiele mit Abständen von 20 und 24 nm sind mit Pfeilspitzen markiert. Diese Paare von Etiketten, um EGFR Dimere gehör interpretiert. 2B zeigt ein Beispiel von dem Rand einer Zelle (1D linken Rechteck) kann EGFR Monomere und Dimere sowie gesehen werden. 2C (1C rechten Rechteck) wurde in einer Region mit einer geringeren Fluoreszenzsignal, dh niedrigere EGFR Dichte aufgezeichnet. Dennoch EGFR wurde auch hier in Dimere als auch gefunden. Außerdem ließen sich zwei Gruppen von 10 oder 11 EGFRs (siehe Ellipsen). 2D zeigt ein weiteres Beispiel eines Membranfalte (1E) mit kleineren Cluster einschließlich 5-6 EGFRs, zusätzlich zu mehreren Monomerenund Dimere. Als ein Beispiel für die Art von Informationen, die aus diesen Daten wird die Paarkorrelationsfunktion 21 g (x) erhalten wird, kann für alle Etikettenpositionen in Figur 2 bestimmt werden kann. Man beachte, daß diese Analyse ist nicht Teil des Protokolls und das Verfahren wurde beschrieben an anderer Stelle 6,7. g (x) ist ein Maß für die Wahrscheinlichkeit eines Teilchens in einem bestimmten radialen Abstand x von einem Referenzpartikel gefunden werden. g (x) = 1 für eine Zufallsverteilung, und ein größerer Wert ist ein Beweis für das Clustering. Die Positionen insgesamt 210 Etiketten wurden automatisch in den vier Bildern von 2A-D detektiert wird, und g (x) wurde berechnet unter Verwendung einer Abschnittsgröße von 5 nm und einem Glättungsfilter mit einer Bandbreite von 10 nm. Die g (x) die Kurve (3) zeigt eine bevorzugte Mitte-zu-Mitte-Abstand von QD 25 nm. EGFRs somit nicht zufällig ausgerichtet, aber ein signifikanter Anteil von ihnen liegt bei dieser bevorzugten Abstand. Von einer approximate molekulares Modell 6 (3 Kasten) Wir schätzen, dass der Abstand zwischen dem QD und der EGF-Bindungstasche von Mitte zu Mitte beträgt ~ 14 nm, und in der Mitte-zu-Mitte-Abstand zwischen den beiden QDs auf eine EGFR-Dimer, die an sein ~ 27 nm (dieser Wert wird wahrscheinlich von einigen Nanometern variieren aufgrund der Flexibilität des Linkers). Die bevorzugte Etikettenabstand ist somit im Einklang mit der erwarteten Etikettenabstand für den EGFR-Dimer innerhalb der Genauigkeit des Verfahrens. Die g (x) -Kurve größer als Eins für die Entfernung von bis zu 300 nm, was das Vorhandensein von Clustern in Übereinstimmung mit den Daten. Diese Analyse zeigt, daß die Stöchiometrie der EGFR kann mit unserer Methode untersucht werden. Figur 4 zeigt ein ähnliches Ergebnis wie Figur 2, mit der Ausnahme, dass die Kennzeichnung mit EGF-QD800 geführt und ein 63X Ölimmersionsobjektiv wurde für die Fluoreszenzbildes verwendet. Diese Daten bestätigen, daß diese typischen Ergebnisse sind ebenfalls gefunden, wenndie EGFR-Kennzeichnung ist mit QDs, die in der Nähe von roten Spektrums emittieren getan. 4A ist das Fluoreszenzbild einer repräsentativen Zelle zeigt 4B die gleiche Zelle im ESEM-STEM Übersichtsmodus und 4C ist eine 150.000-facher Vergrößerung Bild, aufgezeichnet am oberen Rand der Membranzelle (siehe Rechteck in Figur 4B). Ähnlich wie bei 2A und D Abbildung, die Bilder erfassen QD-markierte EGFR auf einer Membran Falte und zeigt monomeren, dimeren und Clustered-Rezeptoren. Beachten Sie, dass das Elektron dichten QD Kern scheint etwas kleiner und runder als die Kerne der QDs Emission bei 655 nm, im Einklang mit ihren kleineren Kerngröße 22 ~ 5 nm. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig1.jpg" /> Abbildung 1. Korrelative DIC, Fluoreszenz und ESEM-STEM von EGF-QD655 markierten EGFR auf vollständig hydratisiert COS-7-Zellen </stRong&gt;. (A) DIC Bild der Zellen auf dem SiN-Membran Fensterbereich gewachsen, wodurch ein topographisches Bild von der Plasmamembran. (B) Fluoreszenzbild zeigt Zellen auf der zentral gelegenen SiN-Membran-Fenster (durch die gestrichelte Rechteck markiert). (C - E) Drei ESEM-STEM geringer Vergrößerung Bilder von der mit Rechtecken in A und B markierten Zellen. Diese Zellübersichtsbilder dienen dazu, die genaue Lage der nachfolgend aufgenommenen Bilder mit hoher Auflösung zu bestimmen. Die Lage von vier hochauflösenden Bildern (in 2A-D dargestellt) sind mit weißen Rechtecke gekennzeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig2.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 2. Hochauflösende ESEM-STEM Bilder zeigen Membran gebunden EGFRs. (A) Schliffbild bei 75,000X Vergrößerung des in Figur 1B markierten Bereich. Viele Monomere sind sichtbar. Mehrere Dimere mit den Pfeilspitzen markiert. (B) und (C) bei 50.000-Bilder Vergrößerung des linken erworben, in 1C markiert jeweils rechts Membranbereichen. Cluster von EGFRs skizziert. (D) mit 50.000-Vergrößerung am Standort in 1D markiert aufgenommene Bild. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig3.jpg" /> Abbildung 3. Paarkorrelationsfunktion g (x) als Funktion der radialen Distanz X für den inter-parti bestimmt<html> CLE Abstände aller 210 Etiketten in 2A &amp; ndash; D erfasst. Der Peak bei 25 nm zeigt an, dass eine Mitte-zu-Mitte QD Abstand hat eine viel höhere Wahrscheinlichkeit des Auftretens als zufällige, wobei ag (x) = 1 anzeigt, eine zufällige Chance. Die gestrichelte Linie ist ein Leitfaden für das Auge darstellt, g (x) einer Zufallsverteilung. Der Einschub zeigt ein ungefähres Molekularmodell des EGFR-Dimer mit gebundenen EGF und Streptavidin beschichteten QDs über Biotin gebunden. Die Modelle von Streptavidin wurden EGF und EGFR von CPK-Modelle der 1stp (Streptavidin), 1EGF (EGF) erhalten, 1NQL, 2JWA, 1M17, 1IVO und 2GS6 (EGFR) Strukturen im RCSB Protein Protein Databank, erstellt von Jmol Version 12.2.15. Das Biotin-Modell ist wie in RCSB Ligand Explorer Version 1.0 erstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> /53186/53186fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4. Beispielhafte COS-7-Zellen mit EGF-QD800 markiert und mit korrelativen Fluoreszenz und ESEM-STEM abgebildet. (A) Fluoreszenzbild, (B) geringer Vergrößerung Übersicht ESEM-STEM Bild. (C) Hochauflösendes Bild am Ort des Rechtecks ​​in b aufgenommen am 150,000X Vergrößerung. Monomeren, dimeren und gruppierten EGFRs ähnlich Markierung mit EGF-QD655 werden erkannt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Studieren der Stöchiometrie der Epidermal Growth Factor Receptor in intakten Zellen mit korrelative Mikroskopie

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K Aufrufe.  INM-Leibniz Institute for New Materials. This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level. 

Serie: Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

Studieren Zellrollen Trajectories auf Asymmetric Rezeptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Forschung

Biotechnik

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduktion des neuronalen Wachstums

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

Gentransfer und Transfektion in humanen Pankreaskarzinom-Zellen mit Epidermal Growth Factor Gelatin-Based Engineered Nanovektoren Rezeptor-gezielte

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

Mikroinjektion Wound Assay und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Lokalisierung von Epidermal Wundreaktion Reporter in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Elektro Growth Factor Releasing Mikrosphären in Fasergerüste

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Polyelektrolytkomplex für Heparin-Bindungsdomäne Osteogenisches Growth Factor Lieferung

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein (HDL)-mimicking nanoparticles (NPs). HDLs are endogenous NPs and have been explored as vehicles for the delivery of therapeutic agents. Various methods have been developed to prepare HDL-mimicking NPs. However, they are generally complicated, time consuming, and difficult for industrial scale-up. In this study, one-step homogenization was used to mix the excipients and form the prototype NPs. NGF is a water-soluble protein of 26 kDa. To facilitate the encapsulation of NGF into the lipid environment of HDL-mimicking NPs, protamine USP was used to form an ion-pair complex with NGF to neutralize the charges on the NGF surface. The NGF/protamine complex was then introduced into the prototype NPs. Apolipoprotein A-I was finally coated on the surface of the NPs. NGF HDL-mimicking NPs showed preferable properties in terms of particle size, size distribution, entrapment efficiency, in vitro release, bioactivity, and biodistribution. With the careful design and exploration of homogenization in HDL-mimicking NPs, the procedure was greatly simplified, and the NPs were made scalable. Moreover, various challenges, such as separating unloaded NGF from the NPs, conducting reliable in vitro release studies, and measuring the bioactivity of the NPs, were overcome.

Simple homogenization was used to prepare novel, high-density, lipoprotein-mimicking nanoparticles to encapsulate nerve growth factor. Challenges, detailed protocols for nanoparticle preparation, in vitro characterization, and in vivo studies are described in this article.

Vorbereitung und Charakterisierung von neuartigen HDL-imitierenden Nanopartikeln für die Nervenwachstumsfaktorverkapselung

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...