Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Stammzellfeld über die Rolle adulter Stammzellen bei der Regulierung des Krebszellverhaltens zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Bewertung von Krebszell- und Stammzellinteraktionen in vitro ohne den Einsatz lebender Organismen ermöglicht. Diese Technik hat Potenzial für Krebsmetastasen, da sie die fördernde Rolle von adulten Stammzellen bei Krebsmetastasen zu harten Geweben wie Knochen modelliert.
Die Demonstration des Verfahrens wird von Huseyin Apdik, einem Postdoktoranden in meinem Labor, durchgeführt. Beginnen Sie mit sterilen Extraktionszangen, um das Zellstoffgewebe aus dem Zentrum der Weisheitszähne zu entfernen, die von jungen Erwachsenen im Alter von 17 bis 20 Jahren erhalten wurden. Legen Sie das Gewebe in kaltes, vollständiges DMEM in 10-Zentimeter-Gewebekulturschalen und verwenden Sie ein Skalpell, um die Proben in Zwei- bis Drei-Millimeter-Fragmente zu zerkleinern.
Übertragen Sie die Stücke von jeder Schale in einzelne Brunnen einer Gewebekultur behandelt Sechs-Brunnen-Platte und decken Sie die Gewebe in jedem Brunnen mit 200 Mikroliter komplette DMEM. Lassen Sie das Gewebe mit einer mindestens zweistündigen Inkubation in einem befeuchteten, 37 Grad Celsius und 5% CO2-Zellkultur-Inkubator an den Brunnenböden anhaften. Am Ende der Inkubation die Gewebe mit zwei bis 2,5 Millilitern frischem gesamtmittelund kultilösen und die Zellen für weitere acht bis neun Tage kultivieren.
Wenn die Kultur 80% Konfluenz erreicht hat, waschen Sie jeden Brunnen mit zwei MilliliterPBS, gefolgt von einer Ablösung der Zellen mit zwei Milliliter Nbitin bei 37 Grad Celsius. Nach zwei Minuten, stoppen Sie die Reaktion mit zwei Millilitern komplettem DMEM pro Brunnen und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Dann setzen Sie die Pellets in 15 Milliliter frisches komplettes Medium pro zwei Bohrkörper von Zellen wieder auf und geben die Zellen für ihre nachfolgende Kultur in T75-Flaschen.
Nach mindestens acht Passagen, visualisieren Sie die Zellen durch Lichtmikroskopie. Die Zellstoffstammzellen sollten an den Kulturgerichten befestigt sein und eine spindelartige Zellmorphologie aufweisen. Für die Oberflächenmarkeranalyse, nachdem die Trypsinisierung nachgewiesen wurde, fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 20 Minuten bei Raumtemperatur in 1,5-Milliliter-Röhren, gefolgt von drei Wäschen in 500 Mikroliter PBS pro Wäsche.
Nach der letzten Wäsche die Zellen mit den entsprechenden Antikörpern von Interesse in 100 Mikroliter PBS pro Röhre für eine Stunde bei vier Grad Celsius beschriften. Am Ende der Inkubation die Zellen dreimal in PBS waschen, wie gezeigt, und die Zellen mit den entsprechenden sekundären Antikörpern in 100 Mikroliter PBS pro Tube für 30 Minuten bei vier Grad Celsius kennzeichnen. Dann waschen Sie die Proben dreimal in PBS und analysieren Sie die Zellen durch Durchflusszytometrie nach Standardprotokollen.
Zur Differenzierung der Zellstoffstammzellen werden für eine 24-Stunden-Inkubation im Zellkultur-Inkubator mal 10 bis vier Zellen in einzelne Brunnen von 24-Well-Platten in 500 Mikrolitern komplettem DMEM gesät. Am nächsten Tag das Medium in jedem Brunnen durch das entsprechende Differenzierungsmedium ersetzen und die Zellen zum Inkubator zurückbringen, das Medium zweimal pro Woche für zwei Wochen erfrischen. Die Differenzierung kann durch von Kossa und Alcian blau Färbung nach Standardprotokollen bestätigt werden.
Sammeln Sie nach zwei bis vier Passagen die konditionierten mittleren Überstande aus den kultivierten Zellstoffstammzellen, wenn die Kulturen 80% Konfluenz erreichen. Zentrifugieren Sie dann das gesammelte Medium, um jegliches Abfallgewebe und Zellablagerungen zu entfernen und das Medium bei negativen 20 Grad Celsius bis zum Gebrauch zu lagern. Zur Krebszellbehandlung samen Sie mal 10 bis fünf Tumorzellen in einzelne Brunnen einer 12-Well-Platte für die nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% CO2.
Verwenden Sie am nächsten Morgen eine sterile 200-Mikroliter-Spitze, um eine Kratzverletzung in jedem Brunnen zu machen und ersetzen Sie sofort den Überstand in jedem Brunnen durch frisches Medium, das verschiedene Konzentrationen von konditioniertem Medium enthält. Beobachten Sie dann sofort die Kratzer unter einem invertierten Mikroskop und erhalten Sie in regelmäßigen Zeitabständen Bilder der verletzten Kulturen. Messen Sie am Ende der Analyse den Kratzverschluss im Zeitverlauf in ImageJ.
Zur Beurteilung der Migration von Zellstoffstammzellen werden zunächst dreimal 10 zu den vier Zellstoffstammzellen auf einzelne 24-Well-Platteneinsätze mit 0,4 Mikron Poren in 250 Mikroliter DMEM gesetzt und die Einsätze über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert. Als nächstes säen Sie fünfmal 10 die vier Tumorzellen in einzelne Brunnen einer 24-Well-Platte in 500 Mikroliter DMEM für die nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Morgen kratzen Sie die Tumorzellen, wie gezeigt.
Ersetzen Sie die Überstande durch 500 Mikroliter frisches DMEM und legen Sie einen Zahnstoffstammzelleinsatz in jeden gut mit frischem Medium gefütterten Einsatz. Beobachten Sie dann sofort zellenauf einem invertierten Mikroskop und bilden Sie die Zellen in regelmäßigen Abständen ab, um die Migration von Zellstoffstammzellen zu bewerten. Um die direkten Wechselwirkungen von Zellstoffstammzellen mit Krebszellen zu bewerten, versuchen Sie jede beschriftete Kultur, um einzellige Suspensionen zu erhalten und die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation zu sammeln.
Setzen Sie die Pellets in verschiedenen Zelllinkerfarbstofflösungen aus, die in einem verdünnten C-Puffer hergestellt werden und gemäß den Anweisungen des Herstellers geliefert werden, und inkubieren Sie die Zellen sind Raumtemperatur für 10 Minuten. Beenden Sie die Färbereaktion mit 100 Mikroliter fetalem Rinderserum und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Dann zentrifugieren Sie die Zellen mit vollständigem Wachstumsmedium, bevor Sie fünfmal 10 auf die vier Zellstoffstammzellen und Tumorzellen pro Brunnen in einer Sechs-Brunnen-Platte in einem Verhältnis eins zu eins in zwei Millilitern des gesamten Mediums plattieren.
Sammeln Sie die Zellen nach 24 oder 48 Stunden Inkubation durch Zentrifugation, gefolgt von einer Wäsche in PBS. Setzen Sie dann die Zellen in 300 Mikroliterfluoreszenz-aktivierten Zellsortierpuffer in Fünf-Milliliter-Rund-Boden-Flow-Zytometrieröhren und Wirbel wieder aus, um alle Zellaggregate zu dispergieren, bevor die Zellen gemäß den standardmäßigen zytometrischen Analyseprotokollen analysiert werden. Zellstoffstammzellen zeigen nach der Beschichtung eine fibroblastenartige Zellmorphologie und exprimieren mesenchymale Stammzelloberflächenantigene, aber keine hämatopoetischen Zellmarker.
Veränderungen auf morphologischer und molekularer Ebene im Zusammenhang mit Osteo-, Chondro- und adipogene Differenzierung werden auch in den Zellstoffstammzellkulturen nach entsprechender Differenzierungscocktailanwendung beobachtet. Die Behandlung von kratzverletzten Tumorzellkulturen mit 10 und 20% Konzentrationen konditionierten Mediums erhöht den Kratzverschluss im Vergleich zu kontrollmittelbehandelten Tumorzellkulturen signifikant. Sezerse Moleküle aus Zahnzellstammzell-Insert-Kokulturen erhöhten auch den Kratzverschluss in verletzten Tumorzellen im Vergleich zu Kontrollzell-Kokulturen.
Die Fluoreszenzmikroskopanalyse der Wechselwirkungen von Zellstoffstamm und Tumorzelle innerhalb einer In-vitro-Zellkultur zeigt die Entstehung einer gut organisierten Struktur, innerhalb derer sich Tumorzellen nach 48 Stunden schnell vermehren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, zwei Gewebeproben in kaltem Medium zu halten und Proben sofort ins Labor zu transportieren, um den Zelltod zu minimieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in den Stammzellfeldern bei der Erforschung adulter Stammzellkrebs-Wechselwirkungen beim Menschen.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Immunzellverfolgung für differentialmarkierte Zellen verschiedener Stammzell- und Krebsarten durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen darüber zu beantworten, wie adulte Stammzellen mit Krebszellen interagieren und Krebsmetastasen kontrollieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit den menschlichen Proben gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen wie die Analyse von Patientenproben auf Infektionskrankheiten und die Einholung der schriftlichen Patientenzustimmung immer bei der Durchführung dieses Verfahrens umgesetzt werden sollten.
