Diese Technik nutzt die Multi-Photonen-Laserscanmikroskopie in Verbindung mit der Laserblitz-Photolyse eines photoaktivierbaren Nikotinmoleküls. Ermöglicht eine präzise Aktivierung von nicotinischen cholinergen Rezeptoren. Diese Technik ermöglicht eine feine spatiotemporale Kontrolle über Nikotinrezeptor-Agonistanwendung, bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von Rezeptor-funktionellen Expressionsmustern und cholinerge Synaptik oder Volumenübertragung.
Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, verwenden Sie einen programmierbaren Pipettenzieher, um eine Glasmikropipette mit einem Öffnungsdurchmesser von 20 bis 40 Mikrometern zu ziehen. Etwa einen Milliliter Aufnahmelösung durch einen 0,22-Mikron-Filter abseihen. Und resuspendieren Sie genug lyophilisiertes photoaktivierbares Nikotin in der gefilterten Aufnahmelösung, um eine zweimillimolarige Endkonzentration zu ergeben.
Füllen Sie die gezogene lokale Anwendung Micropipette mit 50 Mikroliter des photoaktivierbaren Medikaments, und sichern Sie die Pipette in einem Pipettenhalter auf einem Mikromanipulator montiert. Schließen Sie den Pipettenhalter über eine entsprechende Rohrlänge an ein Druckauswurfsystem an, das eine nachhaltige Niederdruckanwendung kann. Und verwenden Sie den Mikromanipulator, um die lokale Anwendungspipette in die extrazelluläre Aufnahmelösung zu manövrieren.
Positionieren Sie die Pipettespitze etwas über einer Maus-Hirngewebeprobe, etwa 50 Mikrometer von der Zelle des Interesses entfernt. Und kurz ein bis zwei Pfund pro Quadratzoll Druck auf die Pipette auftragen. Es sollte minimale bis keine Verschiebung der Zelle von Interesse sein.
Nachdem Sie eine stabile Ganzzell-Patchklemme erreicht haben, schalten Sie die niedrige Anwendung auf der Druckauswurfvorrichtung ein und sättigen Sie das Gewebe, das die Zelle umgibt, für ein bis zwei Minuten mit photoaktivierbarem Nikotin. Lokale Anwendung führt zu zusätzlicher Komplexität in das Experiment. Aber es schont Verbindung und ermöglicht höhere Konzentrationen von PA-Nic verwendet werden.
Für die Badanwendung des photoaktivierbaren Nikotins zunächst genug des lyophilisierten Arzneimittels in einer Aufzeichnungslösung auflösen, die für die kontinuierliche Rezirkulation in eine 100-Mikromolar-Endkonzentration geeignet ist. Und laden Sie das resultierende Gemisch in ein Perfusionssystem. Beginnen Sie dann mit der Rückführung der photoaktivierbaren Nikotinlösung mit einer Rate von 1,5 bis 2 Millimetern pro Minute, indem Sie Schläuche mit minimalem Innendurchmesser und Gesamtlänge verwenden, um das erforderliche Rezirkulationsvolumen zu minimieren.
Während der Rezirkulation die Lösung kontinuierlich mit Carbogen sprudeln und die Badtemperatur bei schlechten Lichtverhältnissen bei 32 Grad Celsius halten. Bad Anwendung profitiert von der Einfachheit und Gleichmäßigkeit der PA-Nic Permeation des Gewebes. Aber es nutzt notwendigerweise niedrigere mikromolare PA-Nic-Konzentrationen, und verbraucht höhere Gesamtmengen an Verbindung.
Zur Live-Visualisierung eines medialen Hatula-Neurons verwenden Sie durch Übertragendes Licht oder Infrarot-Differential-Interferenz-Kontrastoptik und eine Videokamera, um eine stabile, ganzzellige Patchklemmenaufzeichnung zu erstellen. Nach dem Einrichten der hochwiderstandsgebundenen Konfiguration mit Zellen, aber vor dem Einbruch, schalten Sie setup und Software in den Laser-Scan-Modus. Verwenden Sie nach dem Einbruch laserscanning, um zu überprüfen, ob der bildgebende Farbstoff von Interesse das Neuron passiv durch Diffusion füllt.
Lassen Sie den Farbstoff die Zellfächer für mindestens 20 bis 30 Minuten füllen, bevor Sie die Live-Scan-Funktion verwenden, um das Neuron und das subzelluläre Fach von Interesse zu visualisieren. Wählen Sie bildgebende Parameter aus, die eine genaue Live-Visualisierung der neuronalen Features ermöglichen, indem Sie die entsprechenden Einstellungen bearbeiten, um die Anzeigevisualisierung, Auflösung, Signal-Rausch-Verhältnis und Bildbildbildaufnahmezeit bei Bedarf zu beeinflussen oder zu ändern. Um den Signalkontrast zu verbessern, öffnen Sie das Fenster des Nachschlagenstischs, und passen Sie die Einstellungen für den Nachschlagenstischboden und die Deckeneinstellung an.
Um einen Bereich von Interesse innerhalb des Gewebes zu finden, wählen Sie den 1X optischen Zoom und verwenden Sie die Schwenksteuerungen. Verwenden Sie das Werkzeug Z-Serie, um eine Start- und Stoppposition auszuwählen, die die zu sehenswürdigkeitende Zelle enthält. Legen Sie eine Schrittgröße von einem Mikrometer fest, und wählen Sie eine Bildgröße aus, die ein Bild mit der höchsten Auflösung liefert.
Oft 1, 024 x 1, 024 Pixel pro Linie. Dann nacheinander bilden Sie das Neuron in jeder Z-Ebene, die die Zelle enthält. Um die Laserstimulation zu kalibrieren, starten Sie das Systemscannen mit einer bildgebenden Laserleistung größer als minimal, und optimieren Sie den objektiven Fokus auf die dünne rote Markerfluoreszenzschicht.
Wählen Sie einen Bereich innerhalb des Fluoreszenzfeldes frei von Schmutz und gleichmäßig mit Marker beschichtet, und öffnen Sie das Werkzeug-, Kalibrierungs- und Ausrichtungsmenü, um die unkaging galvocalibration-Funktion auszuwählen. Folgen Sie dem Brennfleck-Tutorial zur räumlichen Kalibrierung des zweiten Galvanometer-Spiegelpaares, wählen Sie den 405-Nanometer-Laser, eine Laserstimulationsleistung von 400 und eine Stimulationsdauer von 20 Millisekunden. Um Löcher mit einem bis fünf Mikrometern Durchmesser in den roten Marker zu geben.
Wählen Sie Aktualisieren aus, um das Bild nach dem Brennen des mittleren Punkts zu stimulieren und zu aktualisieren, und verschieben Sie die runde rote Anzeige an die tatsächliche Spotposition der mittleren, rechten Mitte und der unteren Mitte, um ein Raster von neun Punkten zu erhalten. Um die Kalibrierung zu testen, öffnen Sie das Markierungspunktfenster und aktivieren Sie manuell die Stimulationsparameter der definierten Flecken in einem neuen Bereich der Probe, wobei darauf zu achten ist, dass die richtige neueste Kalibrierdatei in das Markierungspunktfenster geladen wird. Wenden Sie dann einen Testimpuls an, um die korrekte Kalibrierung zu überprüfen.
Um den subzellulären Bereich kurz abzubilden und zu lokalisieren, wählen Sie Live-Scan aus und erhöhen Sie den optischen Zoom, um bei Bedarf kleine Strukturen zu visualisieren. Platzieren Sie das Markpunkt-Einpunkt-Fadenkreuz direkt neben der Zellmembran, und legen Sie die Photostimulationsparameter auf eine Dauer von 1 bis 50 Millisekunden, eine Laserleistung von einem bis vier Milliwatt und mindestens eine Studie fest. Wählen Sie dann Run-Mark-Punkte aus, um das Markierungspunktprotokoll zu initiieren, und beobachten Sie die datenerfassung der Elektrophysiologie in Echtzeit.
Photoaktivierbare Nikotin-2PE-Fluoreszenz von einMillimolar PA-Nic wird leicht beim Druckauswerfen aus einer lokalen Anwendungspipette nachgewiesen. Während die Lieferung der wichtigsten photochemischen Produkte der photoaktivierbaren Nikotinphotolysereaktion kein fluoreszierendes Signal bei gleicher Konzentration und Anregungsleistung und Wellenlänge erzeugt. Demonstrieren der Spezifität der photoaktivierbaren Nikotinergebnisse.
Die Abbildung des photoaktivierbaren Nikotins, das auf das Hirngewebe aufgetragen wird, wie gezeigt, zeigt das Vorhandensein des Arzneimittels innerhalb von 100 bis 200 Mikrometern der lokalen Anwendungspipette. Bestätigen, dass photoaktivierbares Nikotin effektiv über eine lokale Anwendung in das Hirngewebe abgegeben werden kann. Hier werden hochwertige Bilder gezeigt, in denen die neuronale Morphologie vollständig zu sein scheint, das Rauschen minimiert wird und der Schmutz die Interpretation der zellulären Morphologie nicht beeinträchtigt.
Diese Bilder sind jedoch von geringerer Qualität. Aufgrund eines niedrigeren Signal-Hintergrund-Verhältnisses und erheblicher Trümmer. Die Kombination der zweiphotonen Laserscanning-Mikroskopie von medialen Habenula-Neuronen in Gehirnscheiben mit Laserblitz-Photolyse von PA-Nic, wie gezeigt, ermöglicht die Abstimmung von elektrophysiologischen Reaktionen mit der zellulären Morphologie.
Eine Einzelpunkt-Photolyse, die in 10-Sekunden-Intervallen durchgeführt wird, ermöglicht eine ausreichende Erholungszeit für den Basishaltestrom. Während ein kürzeres Ein-Sekunden-Intervall zu einer allmählichen Erhöhung des Haltestroms führt, während das Protokoll fortfährt. Der Hinweis, dass das Nikotin nicht genügend Zeit hat, um mit den kürzeren Intervallen vom System wegzudiffuszusein.
Bei der Entwicklung von Experimenten, die photoaktivierbare Moleküle verwenden, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, fluoreszierende Indikatoren auszuwählen und Fluorophore mit kompatiblen Anregungsemissionsspektren zu melden. PA-Nic ist aufgrund seiner kurzwelligen Photolyse-Spitze mit den gängigsten Fluorophoren kompatibel. Bei der Wahl der am besten geeigneten PA-Nic Anwendungstechnik ist es wichtig, die funktionelle Expression, physiologische Aktivität der Nikotinrezeptoren in den Neuronen von Interesse sorgfältig zu berücksichtigen.
Die geschickte Anwendung dieser Technik ermöglicht eine feine raumzeitliche Kontrolle der Nikotinanwendung, die aufregende neue Möglichkeiten zur Untersuchung der Kinetik der nativen Nikotinrezeptor-Interaktion, subzellulären Lokalisierung und Modulation der neuronalen Aktivität durch Nikotinrezeptaktivierung ermöglicht.
