Anthony Renda wurde von einem University of Victoria Graduate Fellowship Award unterstützt. Myre und Winifred Sim Fund, einer kanadischen Stiftung für Innovation Finanzhilfe, wird British Columbia Knowledge Development Fund - Diese Arbeit wurde von einem Natural Sciences and Engineering Research Council von Kanada Discovery Grant, ein NARSAD Young Investigator Award (bis RN), eine Victoria-Stiftung unterstützt und ein Natural Sciences and Engineering Research Council von Kanada Research Tools und Instrumentation Grant. Wir danken Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald und Daniel Morgado für exzellente Maus Tierhaltung.

1. Pump Implantation <ol><li> Vor der Implantation Pumpe, füllen und bereitet die Alzet mini-osmotischen Pumpen (Alzet, Modell 2002, Cupertino, USA) man aufpassen, nicht, um Luftblasen zu präsentieren. Dieses Modell der Mini-osmotische Pumpe liefert Lösung bei einer Rate von 0,5 ul / h für 14 Tage. Stellen Sie sicher, sterilen Bedingungen. Wiegen Sie leeren und gefüllten Pumpen. Am Ende des Experiments (10 Tage nach der Implantation), kann die verbleibende Flüssigkeit in der Pumpe mit einer Spritze und Nadel entfernt und gewogen, um die gepumpte Volumen zu berechnen. </li><li> Pumpen mit Kontroll-Lösung enthalten Kochsalzlösung (0,9% w / v, Teknova, S5819, Hollister, USA). (-)-Nikotinhydrogentartrat Salz (Sigma, Cat # N5260) in Kochsalzlösung verdünnt (0,9% w / v) und sterilisiert durch Filtrieren durch einen 0,22 um Filter-End-Spritze, um Nikotin-Lösung, 1 M Stammlösung von herzustellen. Wir haben früher Nikotin bei 0,4 und 2 mg / kg / h (berechnet als freie Base von Nikotin) für 10 Tage verabreicht. </li><li> Bereiten Sie drei Solebäder (drei10 cm Kochsalzlösung gefüllten Petrischalen). Sobald die Pumpe gefüllt worden ist und gedeckelt, waschen Pumpe gründlich in jedem aufeinander folgenden Solebad, um jegliche Spuren des Medikaments auf die äußere Schale zu entfernen. Tauchen Sie ein in Pumpen gefüllt Kochsalzlösung für die Lagerung bis Chirurgie, halten Sie die Steuerungs-und Nikotin-Pumpen in separaten Behältern Kochsalzlösung. </li><li> Um eine gesunde Erholung zu fördern und das Risiko einer postoperativen Infektion, haben saubere Käfige für eine langfristige Erholung vorbereitet. </li><li> Für kurzfristige Erholung unmittelbar nach der Operation, bereiten Sie einen Käfig mit einem Heizkissen und eine Wärmelampe. </li><li> Um chronische Nikotin-Effekte zu untersuchen haben wir 5 bis 6 homozygot α4YFP knock-in Mäuse (2-3 Monate alt) in jeder Gruppe (Kontrolle oder Nikotin). Die α4YFP Knock-in Mauslinie wurden für 10 Generationen der C57BL/6J Mausstamm worden zurückgekreuzt. Wir sorgen dafür, das Alter und Geschlecht von allen Mäusen sind die gleichen für die Studie und dass alle Operationen werden am selben Tag durchgeführt, um die Variabilität zu minimieren. Um zu verhindern hypothermia den Mäusen während und nach der Operation, auszustatten OP-Tisch mit einem Heizkissen im sterilen OP-Tuch abgedeckt. </li><li> Induzieren die α4YFP Knock-in-Maus mit 3 l / min Sauerstoff und 3% Isofluran und dann Aufrechterhaltung der Narkose mit 2,5 l / min Sauerstoff und 1% Isofluran. Wir bevorzugen Isofluran, weil nach Abschluss der Operation Isofluran löscht das System schnell und die Mäuse sind sich dessen bewusst und mobile innerhalb von ~ 2 min. Augentropfen sofort (Tear-Gel, Novartis), um Schädigung der Hornhaut zu vermeiden. </li><li> Die Pumpen werden subkutan über einen Hautschnitt an der Rückseite des Halses implantiert und die Pumpe wird kaudal entlang der Dorsalseite des nach hinten geschoben. Wischen Sie den Bereich auf dem Rücken zwischen den Vorderbeinen mit 95% Ethanol auf das Fell matt. Drücken Sie die Haut mit einer Pinzette 0,8 mm Graefe (Fine Science Tools, 11050-10) und eine 1 cm zentralen seitlichen Schnitt mit Iris Schere (Fine Science Tools, 14060-10). </li><li> Um eine subkutane Platz für die Pumpe zu erstellen, legen Standardmuster Scheres (Fine Science Tools, 14101-14) in den Schnitt und schieben Sie sie vorsichtig in Richtung der kaudalen Ende des Tieres. </li><li> Mit 1,0 mm Graefe Pinzette (Fine Science Tools, 11650-10), entfernen Sie die Pumpe aus Kochsalzlösung. Halten Sie die offenen Einschnitt mit einer Pinzette und setzen Sie die Pumpe in den Einschnitt mit der osmotischen Pumpe Kappe mit Blick auf den kaudalen Ende des Tieres, und schieben Sie die Pumpe bis zum kaudalen Ende. </li><li> Pinch Wunde geschlossen mit 0,8 mm Zange und wenden eine ausreichende Menge an Vetbond (3M, Kat. Nr. 1469SB) kleben. Halten Sie bis Wunde verschlossen wird. </li><li> Entfernen Sie das Tier von Isofluran-Maske, mit dem Analgetikum spritzen, Meloxicam (0,1 mg / kg sc), und in einen kurzfristigen Erholung Käfig, bis bewussten und mobil. Dann in einer langfristigen Erholung Käfig legen mit Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung. </li></ol> 2. α4YFP knock-in Mäuse-Fixierung durch intrakardiale Perfusion <ol><li> Machen Lösungen einen Tag vor der Prozedur und lassen bei 4 ° C. Um die Variabilität zu minimieren alle Mäusewird am selben Tag und mit der gleichen Charge von Lösungen perfundiert werden. </li><li> Führen Perfusion Fixierungen in einem gut belüfteten Raum. Spülleitung von peristatische Pumpe (Masterflex Easy Load, 7518-00; Masterflex Pumpen Controller, 60648) mit ddH 2 O. </li><li> In ~ 0.0015g von Heparin (Sigma, Cat # H4784), einem Antikoagulans, bis 20 ml PBS pH 7,6 (Invitrogen, Kat. # 70011). </li><li> Anesthetize α4YFP knock-in Mäuse durch die Injektion intramuskulär eine Mischung aus Ketamin (25 mg / kg, Wyeth Animal Health) und medatomidine Hydrochlorid (0,25 mg / kg, Pfizer) in das Hinterbein Muskeln und sofort setzen das Tier zurück in seine Heimat Käfig. </li><li> Pin Tieres zu einem Styropor-Deckel in ein Metallgehäuse eingelegt worden sein. Wischen Thorax mit 95% Ethanol. Pinch Haut mit einer Pinzette Adson (Fine Science Tools, 91106-12) und öffnen Sie die snip Brusthöhle mit Iris-Schere. Klemmen Sie den Brustkorb mit einem ultrafeinen Gefäßklemme (Fine Science Tools, 13021-12) und setzen Sie das Herz. </li><li> Die Pumpe zu starten PBS bei 4 ml / min und insert eine 23G Butterfly-Nadel (Becton Dickinson, 367.253) in den linken Ventrikel des Tieres. Unmittelbar schnippeln den rechten Vorhof, Blut zu erlauben und Perfusat zu entkommen. </li><li> Perfundieren 20 ml PBS (pH 7,6), dann wurden 30 ml 4% Paraformaldehyd (pH 7,6, mit PBS aus einer 16% PFA Lager verdünnt, Electron Microscopy Sciences, Kat. # 15.710), dann 20 ml 5% Saccharose (pH 7,6) . Wir fanden, dass mehr als Fixierung Autofluoreszenz erhöht. Perfusion mit 5% Saccharose spült restliche PFA aus dem Gehirn, die Autofluoreszenz senkt. </li><li> Entfernen Gehirn und Speicher in 30% Saccharose für 3 Tage. </li><li> Um Gehirne für koronale Schnitte frieren, schneiden Sie das Kleinhirn mit einer Rasierklinge und Ort des Gehirns in einem Kunststoff-Einbettform (VWR, Kat. Nr. 18986-1) rostralen Seite nach oben und tauchen in Oktober Montage Compound (Tissue-Tek, Kat. Nr. 4583) . Frieren in Trockeneis und Lagerung bei -20 ° C vor dem Schneiden. </li><li> § Gehirne (30 &amp;mgr; m dick) auf einem Kryostat und dann auf beschichtete Objektträger übertragen. Lagern Sie die Hirnschnitte bei -20 &amp;deg; C in Dia-Boxen, die ein wasserfreies Calciumsulfat Stein. Die Dia-Box sollte in einem Zip-Lock versiegelten Tüte sein, um Feuchtigkeit zu vermeiden und die anschließende Gefrierbrand, wenn sie bei -20 ° C gelagert </li></ol> 3. Imaging mit fluoreszierenden nAChRs spektrale konfokale Mikroskopie <ol><li> Stellen Sie sicher, Dias haben minimale Risiko gegenüber einer Lichtquelle zu minimieren Ausbleichen. </li><li> Coverslip die Gehirn Abschnitt Dias mit einer Halterung Medium, das nicht inhibiert fluoreszierendes Protein Fluoreszenz. Wir haben gute Erfolge mit Mowiol 4-88 (pH 8,5 in Tris-HCl und Glycerin, EMD-Calbiochem, Kat. Nr. 475904), die nach ein paar Stunden aushärtet. Sicherstellen, dass die Mowiol auf Raumtemperatur äquilibriert, bevor Abdeckung rutscht, um Luftblasen zu vermeiden. Verwenden Sie kein Nagellack beim Abrutschen abzudecken, wie es YFP-Fluoreszenz wird zu stillen. </li><li> Die Bilder werden aufgenommen mit einer Nikon C1si spektralen konfokalen Mikroskop-System. Einzelheiten über die Methode der spektralen konfokalen Imaging und Linear Unmixing sind bietend anderswo 13-15. Die Begründung für die Verwendung eines spektralen konfokalen Mikroskops ist, dass feste Hirngewebe inhärenten Autofluoreszenz hat. Spectral konfokale Bildgebung auf der Nikon C1si verwendet ein Array von 32 Photomultiplier-Detektoren, die Probe ein bestimmter Bereich der Wellenlängen von fluoreszierenden emittierten Lichts, gebrochen räumlich in seine verschiedenen Wellenlängen über ein Gitter dispersiven Element wie ein Prisma weißes Licht in brechenden den Farben des Regenbogens 16. Was gesammelt wird, ist ein Lambda-Stapel Bilder - Bilder bei verschiedenen Wellenlängen des Lichts, so dass ein Emissionsspektrum für jedes Pixel eines Lambda-Stapel von Bildern gesammelt gesammelt. Seit YFP und Gewebeautofluoreszenz jeweils charakteristischen spektralen Signaturen haben, kann der Lambda Stack entfalteten unter Verwendung eines linearen algebraischen Algorithmus Entmischung in separate YFP und autofluoreszierenden Signale (Abb. 2) werden. Somit können sehr genaue Quantifizierung von YFP-Fluoreszenz auch in Gewebe mit einem hohen Grad der Au bestimmt werdentofluorescence. </li><li> Verschiedene Einstellungen können die Bildqualität und die Fluoreszenz-Sammlung Effizienz zu optimieren. Wir werden berichten Einstellungen, die wir verwenden in der Regel aber diese Einstellungen können in Abhängigkeit von der Probe und dem konfokalen Mikroskop werden. Um genau zu quantifizieren Veränderungen in α4YFP Untereinheit Ausdruck mit chronischem Nikotin wir sicherstellen, dass die Graustufe Intensität der Signale aller Pixel unter sättigenden Wert sind (&lt;4095 für 12 Bit Graustufen). Darüber hinaus besteht eine mögliche Zunahme des Signals durch den Rezeptor Hochregulation Aufnahme durch Einstellen der konfokalen so, dass Pixel etwa ein Drittel der Sättigung Wert (~ 1300-1400) oder weniger betragen. Sobald die Einstellungen optimiert sind, werden die Einstellungen beibehalten identisch für alle bildgebenden Sessions und Proben. </li><li> Wir verwenden die folgenden Einstellungen für die Bildgebung α4YFP mit einem 60X Öl CFI Plan Apo VC Ziel (1,40 NA, 0,13 mm Arbeitsabstand): 488 nm Laser-Linie bei 15% der maximalen Übertragung eines 40 mW Argon-Laser, Spektraldetektor Gewinn bei 220, Spektralbereich von 496,5 nm bis 656,5 nm bei 5 nm Auflösung abgebildet, wohnen 512 x 512 Pixel über einen 50 um x 50 um-Bereich, ein Medium Pinholegröße (60 mu m Durchmesser), eine 4,08 Mal Pixel, Mittelung über zwei Scans und 12-Bit-Graustufen. </li></ol> 4. Linear Unmixing der spektralen konfokalen Bildern und Bildanalyse <ol><li> Um lineare Entmischung auf einer Beispiel-Bild mit einer spektralen konfokalen Mikroskop aufgenommen durchzuführen, muss man zunächst einen Referenzspektrum für YFP und eine Referenz-Spektrum für Gewebeautofluoreszenz. </li><li> Eine wichtige Voraussetzung für jede Referenz-Spektrum ist es, ein hohes Signal-Rausch-Fluoreszenz-Spektrum mit dem gleichen Laser-Linie für die Abbildung Ihrer Proben werden bebildert zu erhalten. Obwohl der 514 nm Laserlinie des Argon hat eine höhere Effizienz auf Anregung YFP wir es vorziehen, Bild YFP mit dem 488 nm Laser-Linie begeistern, denn es gibt bessere Trennung von der maximalen Emission von YFP und der 488 nm-Linie ist weniger likely zu verzerren den Gipfel, und man kann die gesamte YFP Emissionsspektrum einschließlich der Aufstieg zu Höchstleistungen zu erzielen. Wir Bild löslichen YFP in einer Zelllinie transfiziert, so dass eine starke YFP erhalten wird und das resultierende YFP-Spektrum ist in der Bibliothek von Referenzspektren gespeichert. Transfizierte α4YFP überexprimiert in Zelllinien können ebenfalls verwendet, da es wird auch ein hohes Signal zu Hintergrund-Spektrum werden. </li><li> Um eine Referenz Spektrum der Autofluoreszenz wir Autofluoreszenz Bild aus einer Wildtyp-Maus Gehirn Abschnitt aus den verschiedenen Hirnregionen zu erhalten, dass wir Bild von der Maus α4YFP wollen und erhalten ihre entsprechenden Spektren. Wir verwenden das gleiche Laser-Linie, 488 nm, und Bild mit nahezu identischen Parametern, obwohl wir den Detektor Gain verändern können, Laserintensität oder führen durchschnittlich zu bildgebenden Signal-Rausch zu maximieren. </li><li> Nach Erhalten einer spektralen konfokalen Bildes von einem Bereich des Gehirns α4YFP Maus, wird das Bild dann in seine YFP und autofluor entfaltetenescence Signale durch Anwendung eines linearen Entmischung Algorithmus unter Verwendung der Referenz-Spektrum von YFP und das Referenzspektrum von Wildtyp-Maus Autofluoreszenz von der gleichen Hirnregion. </li><li> Die ungemischten α4YFP Bild kann dann in einer Bildanalyse-Software wie ImageJ (geöffnet werden <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) und dann die mittleren Pixel-Intensität für den Bereich von Interesse berechnet. Ein Plugin für ImageJ namens &quot;loci_tools.jar&quot; ( <a href="http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej" target="_blank">http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej</a> ) kann zur Nikon ICS / ids konfokalen Dateien zu importieren. </li><li> Wir wiederholen die gleiche lineare Entmischung und Analyse, um Mäuse in der gleichen Hirnregion Wildtyp, um einen Hintergrund Restwert zu erhalten. </li><li> Dann erhält man die korrigierte mittlere Intensität α4YFP durch Subtraktion der Hintergrund Restwert (4,6) von der mittleren unkorrigierten α4YFP Wert (4,5). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Wir zeigen ein repräsentatives farbechte Projektion eines Lambda-Stapel von Bildern des medialen Habenula aus einer homozygoten α4YFP Maus (3A) mit einer spektralen konfokalen Mikroskop. Wir haben auch das Emissionsspektrum von einem Bereich von Interesse beinhaltet α4YFP positiven Neuronen aus dem gleichen Lambda Stapel-Aufnahme (3B). Eine deutliche Emissions-Peak liegt bei ~ 527 nm erkennbar, das ist der Gipfel Fluoreszenzemission von YFP. Die medialen Bereich benachbart der Habenula ein Emissionsspektrum fehlt eine spektrale Spitze bei 527 nm, was die Abwesenheit von α4YFP nAChR-Untereinheiten. Nach linearen Entmischung mit Referenzspektren von YFP und Mäusehirn Autofluoreszenz mit signifikante Überlappung der Emission (4), Trennung von YFP und Autofluoreszenzlichtbild-Signal möglich was eine α4YFP ungemischten Bild, ein Bild Autofluoreszenzlichtbild ungemischten und einen Rest-Kanal. Klare Lokalisierung von α4YFP Grippeorescence kann in der dicht gepackten Soma des medialen Habenula (Abb. 4) identifiziert werden. Im Hippocampus α4YFP wird hauptsächlich in der medialen perforans, der Tempero-Ammonium-Pfad und der alveus 12 lokalisiert. Diese sind alle glutamatergen Innervation des Hippocampus. Wir untersuchten die Auswirkungen von chronischem Nikotin auf α4YFP Ausdruck in der hippocampalen perforans (Abb. 5). Chronische Verabreichung von Nikotin (2 mg / kg / h für 10 Tage) führte zu einem signifikanten Anstieg (69 ± 14%) in α4YFP Fluoreszenz von Kontrolle Kochsalzlösung behandelten Mäusen zu einer chronischen Nikotin behandelten Mäusen (p = 0,001, Wilcoxon-Rangsummentest) ( Abb.. 5). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ablaufschema Verfahren, um Veränderungen im Bild α4YFP nAChR-Untereinheiten mit chronischem Nikotin. Mini-osmotischen Pumpen sind entweder mit Kochsalzlösung oder Nikotin gefüllt und subkutan in ALP &amp; implantiertha; 4YFP homozygote Mäuse. Nach 10 Tagen Mäusen perfundiert werden und mit 4% Paraformaldehyd und der Mäusehirne befestigt werden geschnitten (30 um dick) auf Folien. Das Gehirn Abschnitt basiert auf einer spektralen konfokalen Mikroskop (Nikon C1si) abgebildet und spektral in YFP und autofluoreszierenden Bilder unvermischt. Dann werden die Bilder α4YFP werden weiter mit ImageJ-Software analysiert. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig2.jpg" /> 2. Eine schematische Darstellung eines Lambda-Stapel aus einer spektralen konfokalen Mikroskop abgebildet und linear in seine spektralen Komponenten vermischt. (A) einer Lambda-Stapel von Bildern gesammelt. (B) einer Lambda-Stapel besteht aus Bildern mit verschiedenen Wellenlängen des Lichts erfasst, so dass ein Emissionsspektrum für jedes Pixel über die gesamte Stapel gesammelt wird. (C) Seit YFP und Gewebeautofluoreszenz jeweils charakteristischen spektralen Signaturen haben, kann der Lambda Stack entfalteten unter Verwendung eines linearen algebraischen Algorithmus Entmischung in s werdeneparate YFP und autofluoreszierenden Signale. Somit können sehr genaue Quantifizierung der YFP-Fluoreszenz auch in Gewebe mit einem hohen Maß an Autofluoreszenz bestimmt werden. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig3.jpg" /> Abbildung 3. Spectral konfokalen Bild einer Hirnregion auszudrücken α4YFP nAChRs. (A) Ein wahrer Farbprojektionssystem einer Lambda-Stapel von Bildern des medialen Habenula von einem α4YFP Maus mit einem Nikon C1si spektralen konfokalen Mikroskop. (B) Rollen von Spektren aus einer Region von Interesse, die α4YFP enthaltenden Neuronen (grün) und einen Bereich von Interesse außerhalb des medialen Habenula (rot) enthält. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig4.jpg" /> Abbildung 4. Lineare Entmischung des medialen Habenula. (A) Bilder von ungemischten α4YFP und (B) Autofluoreszenz folgende lineare Entmischung. (C) Referenzspektren von YFP (grün TriWinkel) und Autofluoreszenz (gelbe Kreise) für die Entmischung eingesetzt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig5.jpg" /> Abbildung 5. Hochregulation von α4 nAChR im Hippocampus von α4YFP knock-in Mäusen, die chronische Nikotin. (A) mit lückenlos aneinandergereihten Montage α4YFP Fluoreszenz des Hippocampus. Die beiden gestrichelten Auswahl Bereichen sind die ungefähren Positionen auf dem unteren Schenkel des perforans des Hippocampus, wo Analysen für jede Maus durchgeführt wurden. (B) α4YFP Fluoreszenz war signifikant höher in der perforans von Mäusen, die chronische Nikotin als chronische Salzlösung (*, p = 0,001, Wilcoxon-Rangsummentest). Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SEM von n = 20 Messungen für beide Kochsalzlösung und chronische Nikotin behandelten Mäusen (5 Mäuse für jede Behandlungsgruppe). <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig6.jpg" /> Abbildung 6. Bessere depth Expression α4YFP um Antikörpermarkierung verglichen. XZ orthogonale Ansichten α4YFP Fluoreszenz (A) und VGLUT2 Antikörpers mit Cy5 als sekundäre Markierung (B). (C) zeigt eine größere Rollen Fluoreszenzsignalintensität Abbau über die Tiefe für die Antikörper-Färbung (schwarze Quadrate), um α4YFP (offene Kreise) verglichen.

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W., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+doesn't+nicotinic+ACh+receptor+immunoreactivity+knock+out.">Why doesn't nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out.</a> Trends Neurosci. 28, 343-345 (2005).</li><li>Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+suitability+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+standard+immunodetection+procedures.">Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures.</a> J. Neurochem. , (2007).</li><li>Whiteaker, P., Cooper, J. F., Salminen, O., Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Brown, R. W., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+demonstrates+the+interdependence+of+mouse+brain+a4+and+b2+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+expression.">Immunolabeling demonstrates the interdependence of mouse brain a4 and b2 nicotinic acetylcholine receptor subunit expression.</a> The Journal of Comparative Neurology. 499, 1016-1038 (2006).</li><li>Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R. W. B., Cooper, J., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+underlies+chronic+nicotine-induced+up-regulation+of+nicotinic+agonist+binding+sites+in+mouse+brain.">Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. , 337-3187 (2011).</li><li>Marks, M. J., Rowell, P. P., Cao, J. Z., Grady, S. R., McCallum, S. E., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsets+of+acetylcholine-stimulated+86[Rb]++efflux+and+125[I]-epibatidine+binding+sites+in+C57BL/6+mouse+brain+are+differentially+affected+by+chronic+nicotine+treatment.">Subsets of acetylcholine-stimulated 86[Rb]+ efflux and 125[I]-epibatidine binding sites in C57BL/6 mouse brain are differentially affected by chronic nicotine treatment.</a> Neuropharmacology. 46, 1141-1157 (2004).</li><li>King, S. L., Caldarone, B. J., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta2-subunit-containing+nicotinic+acetylcholine+receptors+are+critical+for+dopamine-dependent+locomotor+activation+following+repeated+nicotine+administration.">Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration.</a> Neuropharmacology. 47, 132-139 (2004).</li><li>Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inbred+mouse+strains+vary+in+oral+self-selection+of+nicotine.">Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine.</a> Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).</li><li>Sparks, J. A., Pauly, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+continuous+oral+nicotine+administration+on+brain+nicotinic+receptors+and+responsiveness+to+nicotine+in+C57Bl/6+mice.">Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57Bl/6 mice.</a> Psychopharmacology (Berl). , 141-145 (1999).</li><li>Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E. A., Corrigall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroadaptive+changes+in+the+mesoaccumbens+dopamine+system+after+chronic+nicotine+self-administration:+a+microdialysis+study.">Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study.</a> Neuroscience. 129, 415-4124 (2004).</li><li>Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+receptors+containing+the+Î²2+subunit+are+involved+in+the+reinforcing+properties+of+nicotine.">Acetylcholine receptors containing the Î²2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine.</a> Nature. 391, 173-177 (1998).</li><li>Fowler, C. D., Lu, Q., Johnson, P. M., Marks, M. J., Kenny, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habenular+&#945;5+nicotinic+receptor+subunit+signalling+controls+nicotine+intake.">Habenular &#945;5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake.</a> Nature. 471, 597-601 (2011).</li><li>Maskos, U., Molles, B. E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B. P., Guilloux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reinforcement+and+cognition+restored+by+targeted+expression+of+nicotinic+receptors.">Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors.</a> Nature. 436, 103-107 (2005).</li><li>Matta, S. G., Balfour, D. J., Benowitz, N. L., Boyd, R. T., Buccafusco, J. J., Caggiula, A. R., Craig, C. R., Collins, A. C., Damaj, M. I., Donny, E. C., Gardiner, P. S., Grady, S. R., Heberlein, U., Leonard, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+on+nicotine+dose+selection+for+in+vivo+research.">Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research.</a> Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).</li><li>Lang, T., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+clusters+at+nanoscale+resolution:+more+than+pretty+pictures.">Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures.</a> Physiology (Bethesda). 25, 116-1124 (2010).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

<p class="jove_content"&gt; Verwendung einer fluoreszierenden Rezeptors in einer Knock-in Mausmodell Menge und Lokalisierung eines bestimmten Ions Kanal zu bestimmen bietet eine Reihe von Vorteilen. Im Gegensatz zu Proteinen wie Aktin, das ubiquitär in allen Zellen exprimiert wird, sind die Ionenkanäle in weit geringerer Anzahl vorhanden und ihre Expression variiert zwischen neuronaler Subtypen machen eine genaue Analyse über traditionelle immunhistochemischen Techniken eine Herausforderung. Die α4YFP Genprodukt wird in WT Ebenen zum Ausdru...

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Mini-osmotische Pumpen </td><td> Alzet </td><td> Modell 2002 </td><td></td></tr><tr><td> Kochsalzlösung </td><td> Teknova </td><td> S5819 </td><td></td></tr><tr><td> (-)-Nicotin Wasserstoff Tartratsalz </td><td> Sigma </td><td> N5260 </td><td></td></tr><tr><td> Augentropfen </td><td> Novartis </td><td> Tear-Gel </td><td></td></tr><tr><td> Vetbond Leim </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> Heparin-Natrium-Salz </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 70011 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Wyeth Tiergesundheit </td><td> 0856-4403-01 </td><td></td></tr><tr><td> medatomidine Hydrochlorid </td><td> Pfizer </td><td> 1950673 </td><td></td></tr><tr><td> 23G Butterfly-Nadel </td><td> Becton Dickinson </td><td> 367253 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> Kunststoff Einbettform </td><td> VWR </td><td> 18986-1 </td><td></td></tr><tr><td> Oktober Einbettkunststoff </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> EMD-Calbiochem </td><td> 475904 </td><td> pH 8,5 </td></tr></table>

spectral confocal imaging of fluorescently tagged nicotinic receptors in knock-in mice with chronic nicotine administration

Liganden-gesteuerte Ionenkanäle im zentralen Nervensystem (ZNS) werden in zahlreichen Bedingungen mit schweren medizinischen und sozialen Folgen verwickelt. So ist zum Beispiel Sucht nach Nikotin über das Rauchen eine der häufigsten Ursachen für vorzeitigen Tod weltweit (World Health Organization) und wird wahrscheinlich durch eine Veränderung der Ionenkanal-Verteilung im Gehirn 1 verursacht. Chronische Nikotin bei Nagern und Menschen führt zu einer erhöhten Anzahl von nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (nAChR) im Hirngewebe 1-3. Ebenso haben Veränderungen in den glutamatergen GluN1 oder GluA1 Kanäle bei der Auslösung von Sensibilisierung mit anderen süchtig machenden Drogen wie Kokain, Amphetamine und Opiate 4-6 in Verbindung gebracht. Folglich ist die Fähigkeit zu erfassen und zu quantifizieren, Verteilung und Expressionsmuster von spezifischen Ionenkanäle von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Mechanismen der Sucht. Das Studium der Hirnregion-spezifische efgen von einzelnen Drogen wurde durch das Aufkommen von Techniken wie der radioaktiven Liganden vorangetrieben. Jedoch verhindert die geringe räumliche Auflösung des radioaktiven Liganden-Bindung in der Lage, Liganden-gesteuerte Ionenkanäle in spezifischen Subtypen von Neuronen zu quantifizieren. Genetisch kodierte fluoreszierende Reporter, wie grün fluoreszierende Protein (GFP) und seine vielen Farbvarianten, revolutioniert haben das Feld der Biologie 7. Durch gentechnisch Tagging einen fluoreszierenden Reporter an ein endogenes Protein ein Protein in vivo 10.07 visualisieren können. Ein Vorteil der Fluoreszenz-Tagging Proteine ​​mit einer Sonde ist die Beseitigung von Antikörper Verwendung, die Probleme der Nichtspezifizität und Zugänglichkeit an das Zielprotein aufweisen. Wir haben diese Strategie, um Fluoreszenz-Label nAChRs, das die Studie von Rezeptor-Montage mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET) in transfizierten Kulturzellen 11 aktiviert werden. In jüngerer Zeit haben wir die knoc verwendetk-Ingenieur in Annäherung an Mäusen, die mit gelb fluoreszierenden Protein markiert α4 nAChR-Untereinheiten (α4YFP), ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Rezeptor ex vivo bei Sub-Mikrometer-Auflösung in ZNS-Neuronen über spektrale konfokale Mikroskopie 12. Die gezielte fluoreszierende Knock-in-Mutation befindet sich im endogenen Locus und unter Kontrolle seines nativen Promotors eingebaut, wodurch ein normales Niveau der Expression und Regulation des Rezeptors, wenn um den unmarkierten Rezeptoren in Wildtyp-Mäusen verglichen. Das Knock-in-Ansatz kann erweitert werden, fluoreszierend markieren andere Ionenkanäle werden und bietet eine leistungsfähige Methode zur Visualisierung und Quantifizierung von Rezeptoren im ZNS. In diesem Beitrag beschreiben wir eine Methode, um Veränderungen in der nAChR-Expression in spezifischen ZNS-Neuronen nach der Exposition mit chronischem Nikotin zu quantifizieren. Unsere Methoden sind mini-osmotischen Pumpe Implantation, intrakardiale Perfusionsfixierung, Abbildung und Analyse von fluoreszenzmarkierten Nikotinsäure receptor Untereinheiten aus α4YFP knock-in Mäuse (Abb. 1). Wir haben die Verfahren zur Fixierung optimiert, um Autofluoreszenz von festen Gehirn tissue.We minimieren beschreiben im Detail unsere Methode Bildgebung unter Verwendung einer spektralen konfokalen Mikroskop in Verbindung mit einem linearen Entmischung Algorithmus autofluoresent Signal zu subtrahieren, um genau zu erhalten α4YFP Fluoreszenzsignals. Schließlich zeigen wir Ergebnisse von chronischem Nikotin-induzierte Hochregulation von α4YFP Rezeptoren im medialen perforans des Hippocampus.

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Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Wir haben eine neue Technik zur Quantifizierung nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors Veränderungen innerhalb subzellulären Regionen spezifischen Subtypen von ZNS-Neuronen zum besseren Verständnis der Mechanismen der Nikotinabhängigkeit, indem eine Kombination von Ansätzen einschließlich fluoreszierendes Protein Markierung des Rezeptors mit dem Knock-in-Ansatz entwickelt und spektrale konfokale Bildgebung.

Spectral konfokale Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Nikotinrezeptoren in Knock-in Mäusen mit chronischer Gabe von Nikotin

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

spectral-confocal-imaging-fluorescently-tagged-nicotinic-receptors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K Aufrufe.  University of Victoria. Wir haben eine neue Technik zur Quantifizierung nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors Veränderungen innerhalb subzellulären Regionen spezifischen Subtypen von ZNS-Neuronen zum besseren Verständnis der Mechanismen der Nikotinabhängigkeit, indem eine Kombination von Ansätzen einschließlich fluoreszierendes Protein Markierung des Rezeptors mit dem Knock-in-Ansatz entwickelt und spektrale konfokale Bildgebung.

Serie: Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo pharmacological studies of the signals essential for the formation and maintenance of mammalian NMJs. However, drug penetration into these muscles after subcutaneous or intramuscular administration is often incomplete or uneven and many NMJs can remain unaffected. Although systemic administration with devices such as mini-pumps can improve the spatiotemporal effects, the invasive nature of this approach can cause confounding inflammatory responses and/or direct muscle damage. Moreover, complete analysis of the NMJs in a hind limb muscle is challenging because it requires time-consuming serial sectioning and extensive immunostaining. 
The mouse LAL is a thin, flat sheet of muscle located superficially on the dorsum of the neck. It is a fast-twitch muscle that functions to move the pinna. It contains rostral and caudal portions that originate from the midline of the cranium and extend laterally to the cartilaginous portion of each pinna. The muscle is supplied by a branch of the facial nerve that projects caudally as it exits the stylomastoid foramen. We and others have found LAL to be a convenient preparation that offers advantages for the investigation of both short and long-term in vivo effects of drugs on NMJs and muscles. First, its superficial location facilitates multiple local applications of drugs under light anesthesia. Second, its thinness (2-3 layers of muscle fibers) permits visualization and analysis of almost all the NMJs within the muscle. Third, the ease of dissecting it with its nerve intact together with the pattern of its innervation permits supplementary electrophysiological analysis in vitro9,5. Last, and perhaps most importantly, a small applied volume (&tilde;50&mu;l) easily covers the entire muscle surface, provides a uniform and prolonged exposure of all its NMJs to the drug and eliminates the need for a systemic approach1,8.

We describe procedures for repeated administration of inhibitors of muscarinic signaling to the levator auris longus (LAL) muscle of young adult mice and for subsequent immunostaining of its neuromuscular junctions (NMJs) in wholemounts. The LAL muscle has unique advantages for revealing in vivo pharmacological effects on NMJs.

Subkutane Verabreichung von Muscarinic Antagonisten und Triple-Immunfärbung der Levator Auris longus in Mäuse

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo  pharmacological studies of the signals ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Live-Imaging von Nikotin induzierte Calcium Signaling und Neurotransmitterausschüttung Zusammen Ventral Hippocampus Axone

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Quantifying Infra-slow Dynamics of Spectral Power and Heart Rate in Sleeping Mice

Three vigilance states dominate mammalian life: wakefulness, non-rapid eye movement (non-REM) sleep, and REM sleep. As more neural correlates of behavior are identified in freely moving animals, this three-fold subdivision becomes too simplistic. During wakefulness, ensembles of global and local cortical activities, together with peripheral parameters such as pupillary diameter and sympathovagal balance, define various degrees of arousal. It remains unclear the extent to which sleep also forms a continuum of brain states-within which the degree of resilience to sensory stimuli and arousability, and perhaps other sleep functions, vary gradually-and how peripheral physiological states co-vary. Research advancing the methods to monitor multiple parameters during sleep, as well as attributing to constellations of these functional attributes, is central to refining our understanding of sleep as a multifunctional process during which many beneficial effects must be executed. Identifying novel parameters characterizing sleep states will open opportunities for novel diagnostic avenues in sleep disorders.
We present a procedure to describe dynamic variations of mouse non-REM sleep states via the combined monitoring and analysis of electroencephalogram (EEG)/electrocorticogram (ECoG), electromyogram (EMG), and electrocardiogram (ECG) signals using standard polysomnographic recording techniques. Using this approach, we found that mouse non-REM sleep is organized into cycles of coordinated neural and cardiac oscillations that generate successive 25-s intervals of high and low fragility to external stimuli. Therefore, central and autonomic nervous systems are coordinated to form behaviorally distinct sleep states during consolidated non-REM sleep. We present surgical manipulations for polysomnographic (i.e., EEG/EMG combined with ECG) monitoring to track these cycles in the freely sleeping mouse, the analysis to quantify their dynamics, and the acoustic stimulation protocols to assess their role in the likelihood of waking up. Our approach has already been extended to human sleep and promises to unravel common organizing principles of non-REM sleep states in mammals.

Here, we present experimental and analytical procedures to describe the temporal dynamics of the neural and cardiac variables of non-REM sleep in mice, which modulate sleep responsiveness to acoustic stimuli.

Quantifizierung der infra-langsamen Dynamik der spektralen Kraft und der Herzfrequenz bei schlafenden Mäusen

Three vigilance states dominate mammalian life: wakefulness, non-rapid eye movement (non-REM) sleep, and REM sleep. As more neural correlates of behavior ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

Automatisierte Ganganalyse bei Mäusen mit chronischen Verengung Verletzungen

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its highly-organized subcellular architecture, we recently developed a new imaging modality, named spectral reflectometry (SpeRe), which enables unprecedented label-free nanoscale imaging of the live myelinated axons in situ. The underlying principle is to obtain nanostructural information by analyzing the reflectance spectrum of the multilayered subcellular structure. In this article, we describe a detailed step-by-step protocol for performing a basic SpeRe imaging of the nervous tissues using a commercial confocal microscopic system, equipped with a white-light laser and a tunable filter. We cover the procedures of sample preparation, acquisition of spectral data, and image processing for obtaining nanostructural information.

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Here, we present a step-by-step protocol for imaging myelinated axons in a fixed brain slice using a label-free nanoscale imaging technique based on spectral reflectometry.

Spektrale Reflectometric Mikroskopie auf Markhaltige Axone In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with subcellular location within cells where this function is carried out. To study the subcellular location of nicotinic ACh receptors (nAChRs) in native brain tissue, an optical method was developed for precise release of nicotine at discrete locations near neuronal membranes during electrophysiological recordings. Patch-clamped neurons in brain slices are filled with dye to visualize their morphology during 2-photon laser scanning microscopy, and nicotine uncaging is executed with a light flash by focusing a 405 nm laser beam near one or more cellular membranes. Cellular current deflections are measured, and a high-resolution three-dimensional (3D) image of the recorded neuron is made to allow reconciliation of nAChR responses with cellular morphology. This method allows for detailed analysis of nAChR functional distribution in complex tissue preparations, promising to enhance the understanding of cholinergic neurotransmission.

This article presents a method for studying nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in mouse brain slices by nicotine uncaging. When coupled with simultaneous patch clamp recording and 2-photon laser scanning microscopy, nicotine uncaging connects nicotinic receptor function with cellular morphology, providing a deeper understanding of cholinergic neurobiology.

Sondieren Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Gehirnscheiben per Laser Flash Photolyse von Photoactivatable Nikotin

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...