Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Zelltherapie zu beantworten, wie z. B. kann die Islettransplantation durch die hOMING-Chirurgietechnik optimiert werden? Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie einfach, schnell und abstimmbar ist und die Validierung des Biomaterials ebenfalls sehr schnell ist. Die visuelle Demonstration der Nadelplatzierung ist entscheidend, um eine ordnungsgemäße Transplantatinjektion im Omentum zu gewährleisten, da eine falsch platzierte Nadel zu einer Leckage der Islete führen kann.
Um Diabetes zu induzieren, injizieren Sie 75 Milligramm pro Kilogramm Streptozotocin intraperitoneal in jede sechs Wochen alte, 150 bis 190 Gramm Lewis Empfängerratte, und überprüfen Sie den Diabetes-Status durch tägliche Blutzuckermessung für die ersten vier Tage nach der Injektion. Wenn die Ratten eine Glykämie über zwei Gramm pro Liter aufweisen, injizieren sie subkutan sechs Einheiten lang wirkendes Insulin pro Tag, um Diabeteskomplikationen und Gewichtsverlust zu verhindern. Nehmen Sie Ratten in die experimentelle Kohorte ein, wenn zwei Messungen des Blutzuckerspiegels der Schwanzvene an zwei aufeinanderfolgenden Tagen größer als vier bis fünf Gramm pro Liter sind, mit einem C-Peptidspiegel unter 200 Picomolar.
Bei der Pelletimplantation, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen im anästhesierten diabetischen Empfängertier und reinigen Sie den Hals mit Povidon Jod. Rasieren Sie den Implantationsbereich und reinigen Sie die exponierte Haut mit zusätzlichem Povidon-Jod. Nach drei Minuten sterilisieren Sie ein 1/2 Insulinpellets in einer ein bis fünf Povidon-Jodlösung und verwenden Sie einen 16 Gauge Trocar, um die exponierte Nackenhaut zu durchbohren.
Verwenden Sie dann die Führung und stylet, um die Pellets einzufügen und die Öffnung mit einem einzigen Punkt zu bespannen. Reinigen Sie den Stich mit mehr Povidon Jod und lassen Sie die Ratte in einem Käfig mit Überwachung und Nahrung zu erholen, um Hypoglykämie zu vermeiden. Um die Effizienz der Pellets zu messen, messen Sie die Glykämie-Abnahme jede Woche für einen Monat nach der Implantation, einschließlich Ratten in der experimentellen Kohorte, wenn ein Maß des Schwanzvenenblut-C-Peptidspiegels unter 200 Picomolar bei einem Monat nach der Insulinpellet-Implantation gehalten wird.
Für die intra-omentale Matrix-Inselfüllung zählen Sie die Anzahl der Von gesunden Spenderratten isolierten Inseln in Inseläquivalenten und bereiten Sie ein 7, 660 Inseläquivalent pro Kilogramm Empfänger in einzelnen 1,5-Milliliter-Röhren vor. Waschen Sie jedes Aliquot mit 500 Mikroliter CMRL-Medium ohne fetales Rinderserum und setzen Sie die Inselpellets in 150 Mikroliter frisch zubereiteten Alginathydrogelträger pro Rohr mit sorgfältiger Mischung vor, bevor Sie die Rohre auf Eis legen. Als nächstes laden Sie Ein-Milliliter-Spritzen mit einer atraumatischen 21-Spur-Nadel mit 150 Mikroliter leerem Alginat ohne totes Volumen, gefolgt von 150 Mikroliter Alginat plus Inselchen.
Legen Sie die Spritzen auf Eis und bereiten Sie den Hals des ersten Empfängertiers vor, wie gerade gezeigt. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt über die alte Wunde zu machen und verwenden Sie Zangen, um die Pellets zu entfernen. Schließen Sie den Stich mit einem oder zwei einzelnen Stichpunkten und legen Sie die Ratte in die Supine-Position.
Sterilisieren Sie den Peritonealbereich und rasieren Sie sich. Verwenden Sie ein Skalpell, um eine 1/2 Zentimeter Laparotomie direkt unter dem Brustbein zu erstellen. Legen Sie nass sterilisierte Gaze um den Schnitt und identifizieren Sie das omentale Fettpolster neben dem Magen.
Verwenden Sie Zangen, um das Fettpolster vorsichtig aus der Peritonealhöhle zu ziehen und es auf der Gaze zu verbreiten. Hydratisieren Sie das Omentalgewebe gut mit zwei Millilitern vorgewärmter, 37-Grad-Celsius steriler Salin, und durchdringen Sie das Gewebe mit kleinen gekrümmten Zangen in der einen Hand mit der anderen in die omentale Kante zwischen den Omentalschichten. Achten Sie beim Einsetzen der Nadel darauf, dass sie vor Beginn der Injektion von einer dünnen Schicht Omentalgewebe umgeben ist.
Setzen Sie die Nadel vollständig ein und beginnen Sie langsam mit der Injektion des Inselpräparats, während Sie die Nadel zurückziehen, damit die injizierten Inselchen im gesamten Gewebe verteilt werden können. Während der Injektion ziehen Sie die Nadel an den Rand des Gewebes, stoppen Sie die Injektion, wenn die Nadel fast aus ist. Warten Sie dann fünf Sekunden, bevor Sie eine neue Injektion am nächsten Speicherort starten.
Und weitere drei bis vier Aliquots injizieren, wie gezeigt. Wenn das gesamte Hydrogel abgegeben wurde, ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück, um den Verlust der injizierten Inselchen zu vermeiden, und überprüfen Sie, ob die Inselchen nicht in der Spritze am Ende der Injektion gruppiert sind. Wenn alle Inselchen geliefert wurden, hydratisieren Sie das Omentum und die Wand der Laparotomie, bevor Sie das Omentalgewebe vorsichtig in die Bauchhöhle zurückgeben.
Injizieren Sie zwei Milliliter vorgewärmte sterile Saline in die Bauchhöhle, um die Ratte zu rehydrieren. Schließen Sie dann die Muskelwand mit einer durchgehenden Fadennaht und nähen Sie die Hautschicht mit einem einzigen Stichpunkt. Nach ein bis zwei Monaten metabolischer Nachbeobachtung öffnen Sie den chirurgischen Schnitt jedes Empfängers wie gezeigt, und verwenden Sie Zangen, um die Omenta vorsichtig auf salinengetränkte Gazestücke zu verteilen, die neben den Einschnitten angeordnet sind.
Ausgehend von der Region, die dem Bauchspeicheldrüsenschwanz haftet, verwenden Sie eine Schere, um das Omentalgewebe zu verbrauchen und zwei Milliliter vorgewärmte Salin zu injizieren, bevor jedes Tier geschlossen wird, wie gezeigt. Fixieren Sie die abgerufene Omenta in 4%Paraformaldehyd, bevor Sie sie in Paraffin einbetten. Dann erwerben sie vier Mikrometer dicke Abschnitte des Gewebes auf einem Mikrotom und wenden Hämatoxylin und Eosinfleck für die morphologische Bewertung der Transplantationen an.
Dextran-Perlen, die mit der hOMING-Methode transplantiert wurden, wie gezeigt, wurden häufig in der Nähe der Blutgefäße beobachtet und gut in das Fettgewebe implantiert. In dieser repräsentativen isogenen Studie wurde die Glykämie zunächst durch Implantation eines 1/2 Insulinpellets, wie nachgewiesen, und dann durch implantierte Inselchen kontrolliert, wie durch eine Glykämie von etwa zwei Gramm pro Liter und eine C-Peptidämie von mehr als 500 Picomolar bei den Empfängertieren nachgewiesen wurde. Darüber hinaus ergab die histologische Analyse der explantierten Omenta hochgradig rekonvaskularisierte Inselchen, wahrscheinlich aufgrund ihrer Nähe zu den Blutgefäßen.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in Zelltherapiebereichen, um biotechnologische Zellmikroumgebungen in präklinischen Modellen zu erforschen.
